PPARγ和乙型肝炎病毒X蛋白对肝癌细胞miR-122的表观遗传调控

摘要

简介

肝细胞癌（HCC）是最常见的肝脏原发恶性肿瘤，也是全球第三大癌症相关死亡原因(1). HCC的主要危险因素包括丙型肝炎病毒（HCV）和乙型肝炎病毒（HBV）感染、酒精性和非酒精性脂肪性肝病(2). 未来几十年，全球HCC负担预计将增加，HCV感染是美国HCC发病率上升的原因，HBV感染是全球HCC的主要原因。尽管精确的基因靶点和潜在机制尚未完全确定，但已知大多数肝癌危险因素都会引起表观遗传变化，如DNA甲基化和组蛋白修饰。

微RNA已成为正常和疾病状态下基因表达的重要调节器(三,4). 最近的证据表明，在肝癌发生和肿瘤进展中，miRNAs的调控被解除(5,6). 在这方面，值得注意的是，表观遗传修饰被认为是调节miRNA表达的关键机制(7)尽管肝脏中的miRNAs是否受到表观遗传调控仍不清楚。

miR-122是肝脏中表达最高的miRNA(8)与肝脏病理生物学的几个重要方面有关，包括肝癌发生、HCV复制、脂质代谢和铁稳态(9–13). 已知miR-122能结合HCV基因组的5′-UTR并刺激HCV RNA的翻译(13); 因此，抑制miR-122可降低培养细胞和HCV感染黑猩猩模型中HCV的病毒载量(14). HBV感染患者miR-122水平降低(15)尽管HBV介导的miR-122减少的机制尚不清楚。小鼠体内miR-122的缺失已被证明会导致肝脂肪变性、肝炎症和纤维化，最终导致肝细胞癌(16,17). 已知几种肝脏富集转录因子（LETE）调节miR-122的表达(18,19); 然而，对于肝脏中miR-122表达的表观遗传调控知之甚少。此外，虽然最近的研究已经证明miR-122在肝脏中的作用(20)目前尚不清楚miR-122在肝细胞癌细胞和肝脏疾病中的表达是如何调节的。

过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是一种配体激活的转录因子，属于核激素受体超家族(21). PPARγ与维甲酸X受体α（RXRα）形成异二聚体，并与DNA反应元件结合，该元件由由一个或两个核苷酸（分别为DR1或DR2基序）隔开的两个六核苷酸直接重复组成(22,23). 在没有配体的情况下，PPARγ/RXRα与核受体辅加压蛋白（NCoR）和视黄醇和甲状腺激素受体沉默介质（SMRT）等辅加压因子相关；这种核受体辅阻遏物复合物通过组蛋白去乙酰化酶（HDAC）或组蛋白甲基转移酶（HMT）的募集来改变染色质环境，从而降低转录活性(24,25). 在存在PPARγ配体的情况下，共抑制因子与PPARγ/RXRα分离，从而实现基因转录。

在本研究中，我们进行了miRNA微阵列分析，我们的数据表明，miR-122是经表观遗传药物（5-Aza-CdR和PBA）治疗的肝癌细胞中表达量最高的miRNA之一。假设miR-122的启动子区域包含DR1和DR2基序(19)，我们推测PPARγ/RXRα复合物可能与肝癌发生过程中miR-122的表观遗传调控有关。事实上，我们的实验结果表明，PPARγ/RXRα与miR-122启动子的DR1和DR2基序相关，以调节HCC细胞中miR-122的表达，其效果依赖于两个PPARγ共表达子N-CoR和SMRT以及一个关键HMT SUV39H1。此外，我们的数据显示，乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）结合PPARγ并抑制miR-122基因的转录，这为乙型肝炎和丙型肝炎病毒对miR-122的有趣差异调节提供了机制解释。

实验程序

结果

人肝癌细胞中表观调控的miRNAs

为了鉴定HCC中表观遗传调控的miRNA，我们对DNA甲基化抑制剂（5-氮杂-2′-脱氧胞苷，5-aza-CdR）和组蛋白脱乙酰酶抑制剂（4-苯丁酸，PBA）治疗的人肝细胞癌细胞（HepG2）进行了miRNA微阵列研究。微阵列数据通过log2值的分层聚类进行分析，并显示在热图中(图1A). 在分析的837个人类miRNA中，5-Aza-CdR和PBA处理的细胞与对照载体处理的细胞相比，有43个miRNA差异表达（p<0.01）。上调的miRNA包括miR-122、miR-30e、miR-3922-5p、miR-125-5p和miR-224；下调的miRNAs包括miR-654-3p、miR-4481、miR-133a和miR-133b。其中，miR-122被确定为上调最多的miRNA（6.6倍，图1B).

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图1

肝癌细胞中miR-122的表达受到表观遗传抑制

（A）MiRNA表达热图描绘了用对照载体或5-Aza-CdR（3μM）和PBA（3 mM）处理48小时的HepG2细胞中差异表达的MiRNA（p<0.01）。（B）miRNA微阵列数据总结，与对照组相比，其变化至少为3倍（p值通过方差分析计算）。（C）用对照载体或5-Aza-CdR和PBA处理48小时的HepG2和Huh7细胞中成熟miR-122的qRT-PCR分析。数据归一化为U6 RNA。（D）用对照载体或5-Aza-CdR和PBA处理48小时的HepG2和Huh7细胞中pri-miR-122的qRT-PCR分析。（E）肝癌细胞系与人原代肝细胞miR-122表达的qRT-PCR比较。（F）用5-Aza-CdR（3μM）和PBA（3 mM）处理48小时后，人原代肝细胞miR-122表达的qRT-PCR。数据代表平均值+SD（***P<0.001，n=3）。

鉴于miR-122是主要的肝细胞特异性miRNA（约占肝脏总miRNA的70%）(8,31)在肝癌发生过程中其表达降低(16,32)，我们选择关注miR-122的表观遗传调控。根据qRT-PCR分析，5-Aza-CdR/PBA治疗使两种肝癌细胞系HepG2和Huh7中成熟miR-122的水平分别增加了11.6倍和4.2倍(图1C). 5-Aza-CdR和PBA处理的HepG2和Huh7细胞也显示出pri-miR-122水平的高表达（分别增加6.3倍和5倍）(图1D)表明miR-122的表观遗传上调主要发生在转录水平。我们观察到，与肝细胞癌细胞系（HepG2、Huh7和Hep3B）相比，原代人肝细胞表达的miR-122的基础水平更高(图1E). 然而，在原代人肝细胞中，5-Aza-CdR/PBA对miR-122表达的上调幅度较小（1.8倍，图1F). 这些结果表明，与原代肝细胞相比，肝癌细胞中miR-122的表达受到了更大程度的表观遗传抑制。

5-Aza-CdR和PBA诱导PPARγ/RXRα与miR-122基因启动子的DR1和DR2基序结合

miR-122基因的启动子区域包含肝脏富集转录因子（LETF）的特定结合位点，如肝细胞核因子-4α（HNF-4α）和CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP），它们调节miR-122的基因转录(18,19). 为了确定5-Aza-CdR/PBA是否通过诱导这些LETF诱导miR-122表达，我们检测了HNF-4α、C/EBPα和相关信号分子的蛋白水平。如所示补充图S1，5-Aza-CdR和PBA处理不会显著改变这些分子的水平。我们观察到，经5-Aza-CdR和PBA处理的HepG2细胞中E-cadherin表达水平增加；这一发现与E-cadherin的表达经常被表观遗传机制（如肝癌中启动子超甲基化）抑制的观点一致(33).

假设miR-122的启动子区域包含DR1和DR2基序，这些基序被包括PPARγ在内的核激素受体超家族的几个成员识别(19)，我们使用与miR-122启动子相对应的生物素化DR1或DR2寡核苷酸进行DNA下拉分析。如所示图2APPARγ和RXRα与miR-122 DR1和DR2基序结合，5-Aza-CdR和PBA显著增强了这种联系。相反，PPARα没有与DR1或DR2共识位点结合。用PPARγ表达载体瞬时转染进一步增强5-Aza-CdR/PBA诱导的PPARγ与miR-122 DR1和DR2基序的结合(图2B). 为了进一步确定PPARγ与miR-122启动子DNA的关联，我们使用与miR-22基因启动子中三个DR1和DR2区域对应的三个特异性引物集进行染色质免疫沉淀（ChIP）分析。如所示图2C，5-Aza-CdR/PBA处理显著增强了PPARγ与miR-122启动子DR1和DR2区域的结合。为了分析miR-122基因启动子的转录活性，我们构建了一个包含miR-122启动子DR1和DR2区域的荧光素酶报告子结构，我们的数据表明，5-Aza-CdR/PBA处理显著增加了miR-122的基因启动子荧光素酶报告子活性(图2D). 因此，5-Aza-CdR和PBA处理诱导PPARγ/RXRα复合物与DR1和DR2元件结合，这一机制与5-Aza-CdR/PBA诱导miR-122表达有关。

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图2

5-Aza-CdR/PBA诱导miR-122表达的PPARγ/RXRα复合物

（A）5-Aza-CdR/PBA诱导内源性PPARγ/RXRα与DR1和DR2共识位点结合。（上面板）人类miR-122基因启动子中假定PPARγ/RXRα结合位点的示意图。（中间面板）将来自HepG2细胞的等量细胞裂解物与miR-122启动子中对应DR1和DR2基序的生物素化双链寡核苷酸以及甾体亲和素-琼脂糖珠孵育。对沉淀的复合物进行SDS-PAGE和蛋白质印迹。（下面板）Western blot检测经或不经5-Aza-CdR/PBA处理的HepG2细胞中的PPARα。（B）在PPARγ过度表达的HepG2细胞中，5-Aza-CdR/PBA诱导PPARγ/RXRα与miR-122 DR1和DR2基序结合。PPARγ表达载体瞬时转染后，用5-Aza-CdR/PBA处理细胞48小时，获得细胞裂解物进行DNA下拉分析。（C）ChIP分析。从用5-Aza-CdR/PBA或对照载体处理的HepG2细胞中提取的染色质用PPARγ抗体进行免疫沉淀，并使用引物对沉淀进行qRT-PCR分析，以扩增DR1和DR2区域，如示意图所示（箭头显示miR-122启动子中的引物区域）用正常兔IgG作为阴性对照。（D）5-Aza-CdR和PBA对HepG2和Huh7细胞中miR-122启动子荧光素酶活性的影响。在短暂转染miR-122-Luc启动子载体后，对细胞进行5-Aza-CdR和PBA处理48小时，获得细胞裂解物以检测荧光素酶活性。（E）经PPARγ激动剂（15-d-PGJ）处理的HepG2细胞成熟miR-122的qRT-PCR₂，15-酮-PGE₂)或RXRα激动剂（9-cis RA）。用PPARγ表达载体或对照载体瞬时转染细胞，并用DMSO或10μM激动剂孵育细胞24小时。qRT-PCR检测成熟miR-122。（F）用10μM PPARγ激动剂（罗格列酮、曲格列酮和西格列酮）或载体对照（DMSO）处理的PPARγ过表达的HepG2细胞中成熟miR-122的qRT-PCR。（G）用PPARγsiRNA或PPARγ表达载体转染NeHepLxHT细胞中成熟miR-122的qRT-PCR（上面板）western blotting证实NeHepLxHT细胞中PPARγ的敲除或过度表达（下面板）数据表示平均值+SD（***P<0.001，n=3）。

由于PPARγ/RXRα的活性受特定配体的影响，我们接下来检查了PPARγ和RXRα配体对miR-122表达的影响。在这些实验中，用PPARγ激动剂15-脱氧前列腺素J处理HepG2细胞₂（15d-PGJ₂，10μM）或15-酮-前列腺素E₂（15-酮-PGE₂，10μM）和RXRα激动剂，9-顺维甲酸（9-顺式RA，10μM）。如所示图2E这三种激动剂增加了miR-122的表达，当PPARγ蛋白过度表达时，这种作用进一步增强。用额外的PPARγ激动剂（罗格列酮、曲格列酮和西格列酮）治疗也能增加PPARγ过度表达HepG2细胞中miR-122的表达(图2F). 为了评估PPARγ对非恶性肝细胞miR-122表达的影响，用PPARγsiRNA或表达载体转染NeHepLxHT细胞（永生化未转化的新生肝细胞）。如图所示图2GPPARγ的敲低降低了miR-122的表达，而PPARγ过度表达则使其增加。这些结果表明，肝细胞源性细胞中的miR-122表达受到PPARγ和RXRα的正调控。

5-Aza-CdR和PBA从PPARγ和DR1/DR2复合物中诱导N-CoR和SMRT分离

鉴于N-CoR和SMRT是PPARγ的共同阻遏物(34)，我们进行了DNA下拉分析，以确定它们与miR-122 DR1和DR2基序的关联。我们的数据表明，5-Aza-CdR和PBA处理降低了N-CoR和SMRT与DR1和DR2寡核苷酸的结合(图3A). 因此，联合免疫沉淀试验表明，5-Aza-CdR和PBA处理导致N-CoR和SMRT从PPARγ中分离(图3B)，尽管N-CoR和SMRT的蛋白质水平没有改变。这些发现表明，N-CoR和SMRT从PPARγ和DR1/DR2复合物中分离有助于5-Aza-CdR/PBA诱导miR-122表达。

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图3

5-Aza-CdR/PBA诱导的miR-122表达与N-CoR/SMRT共表达载体分离和SUV39H1抑制相关

（A）用对照载体或5-Aza-CdR/PBA处理的HepG2细胞中内源性N-CoR和SMRT与miR-122 DR1和DR2基序的结合。（B）5-Aza-CdR和PBA对HepG2细胞中PPARγ与N-CoR、SMRT和SUV39H1相关性的影响。（左侧面板）用抗PPARγ抗体免疫沉淀细胞裂解物，然后用指示的抗体免疫印迹。（右侧面板）使用指示抗体的常规免疫印迹法。（C）5-Aza-CdR和PBA对HepG2和Huh7细胞中SUV39H1表达的影响。用5-Aza-CdR/PBA处理细胞48小时，获得细胞裂解物，用抗SUV39H1抗体进行Western印迹。（D）SUV39H1与miR-122 DR1和DR2图案的结合。用5-Aza-CdR和PBA处理HepG2细胞48小时，细胞裂解物与生物素化的DR1和DR2寡核苷酸孵育。使用抗SUV39H1对样品进行免疫印迹。（E）SUV39H1敲低对miR-122表达的影响。用靶向SUV39H1的两种不同的siRNA（100nM）或模拟siRNA转染HepG2细胞作为对照。转染72小时后通过western blotting分析SUV39H1敲除的效率（左侧面板）对成熟miR-122进行qRT-PCR（右侧面板）.（F）SUV39H1抑制剂毛霉素增加了HepG2和Huh7细胞中miR-122的表达。用200 nM毛霉素处理细胞48小时，并进行qRT-PCR以确定miR-122的水平。（G）5-Aza-CdR/PBA对组蛋白乙酰化的影响（染色质免疫沉淀分析）。用5-Aza-CdR/PBA或对照载体处理HepG2细胞提取的染色质，用抗乙酰组蛋白抗体进行免疫沉淀。使用引物对沉淀进行qRT-PCR分析，以扩增miR-122基因启动子的DR1和DR2区域，如示意图所示。数据表示平均值+SD（***P<0.001，**P<0.01；n=3）。

丙型肝炎病毒不影响miR-122的表达

丙型肝炎和乙型肝炎病毒感染是与HCC相关的主要表观遗传因素。miR-122已被证明与HCV RNA的5′-UTR结合，导致HCV积聚(13). 为了研究丙型肝炎病毒感染是否会影响miR-122的表达，我们利用Huh7.5细胞（最适合丙型肝炎感染）。在这个系统中，80%以上的Huh7.5细胞在加入丙型肝炎病毒（克隆JFH1-GFP）96小时后感染，GFP荧光显示；HCV RNA的qRT-PCR分析也证实了成功感染(图4A). 如所示图4BmiR-122的表达水平在HCV感染细胞和对照细胞之间没有显著差异。同样，HCV感染并没有显著改变miR-122启动子荧光素酶报告活性(图4C). 因此，HCV感染不会显著影响miR-122的表达。

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图4

丙型肝炎病毒对miR-122表达的影响

（A）用JFH1-GFP-HCV病毒感染Huh7.5细胞96小时。（上面板）荧光显微镜显示感染JFH1-GFP-HCV的细胞中GFP的细胞内表达。（下面板）对JFH1-GFP-HCV感染或未感染细胞中HCV RNA的qRT-PCR分析。（B）用qRT-PCR分析96小时内有无JFH1-GFP-HCV感染的Huh7.5细胞中的miR-122。结果被归一化为U6 RNA水平。（C）无论是否感染JFH1-GFP-HCV，96小时后Huh7.5细胞中miR-122启动子荧光素酶报告活性。

乙型肝炎病毒下调miR-122的表达

已知HBV感染患者miR-122的表达下调(15). 为了研究miR-122表达与HBV的关系，我们使用了HepG2.2.15细胞，该细胞来源于HepG2细胞，在培养系统中具有稳定的HBV表达和复制(37). 如所示图5AHepG2.2.15细胞中存在HBV DNA，而HepG2细胞中没有HBV DNA证实了HBV复制的成功，而与HepG2.细胞相比，HepG2.1.15细胞中miR-122的表达显著下调。此外，我们在4%聚乙二醇（PEG）存在下使用HepG2.2.15细胞的上清液进行HBV感染实验。如所示图5B和C与未感染细胞相比，HBV感染的HepaRG和原代人肝细胞的miR-122显著降低（通过检测感染细胞中的HBV DNA和HBX mRNA证实了最佳感染效率）。这些结果表明，HBV感染下调miR-122的表达。

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图5

乙型肝炎病毒对miR-122表达的影响

（A）HepG2.2.15细胞培养72小时；从HepG2.2.15细胞或上清液（400μl）中提取DNA。HBV特异性引物qRT-PCR检测HBV DNA（左侧面板）将HepG2细胞及其上清液用作阴性对照。在HepG2和HepG2.2.15细胞中对成熟miR-122进行qRT-PCR分析（右侧面板）.（B）用HBV接种物感染HepaRG细胞20小时并孵育7天。每2天更换一次培养基。孵化结束时，在培养基和HBV感染细胞中检测到HBV DNA（左侧面板）对从未感染或HBV感染的HepaRG细胞中提取的总RNA进行miR-122的qRT-PCR分析（右侧面板）.（C）用HBV接种物感染人原代肝细胞5或7天。HBX mRNA水平（左侧面板）和miR-122表达水平（右侧面板）通过qRT-PCR测定。GAPDH mRNA和U6水平作为内部对照。数据代表平均值+SD（***P<0.001，***P<0.01；n=3）。

乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）对miR-122表达的影响

鉴于乙型肝炎病毒X蛋白（HBX）在HBV介导的肝癌发生中起着关键作用，并且已知HBX通过蛋白质相互作用调节转录机制(38)，我们研究了HBX对我们系统中miR-122表达的潜在影响。如所示图6AHBX转染降低了HepG2和Huh7细胞以及原代人肝细胞中miR-122的表达。因此，HBX转染也降低了miR-122启动子荧光素酶报告活性(图6B). 另一方面，HepG2.2.15细胞中HBX的siRNA敲低显著增加miR-122的表达(图6C). 这些结果表明HBX蛋白能够下调miR-122的表达。共免疫沉淀试验表明HBX与PPARγ结合(图6D)这与之前的报告一致，即HBX与PPARγ的DNA结合域结合并抑制PPARγ介导的反式激活(39). 这些观察结果表明，HBX蛋白通过结合和抑制PPARγ负调控miR-122的表达。PPARγ在抑制miR-122基因转录中的作用进一步得到证实，PPARγ的过度表达阻止了HBX诱导的miR-122成熟和pri-miRNA水平的降低(图6E和6F). 综上所述，这些结果为最近Wang及其同事报道的HBV感染患者miR-122降低提供了机制上的解释(15).

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图6

HBX对miR-122表达的影响

（A）HBX表达载体或对照载体转染HepG2和Huh7细胞48小时后miR-122的qRT-PCR分析（左侧和中间面板）用HBX转染人原代肝细胞72小时，用qRT-PCR测定miR-122的表达水平（右图）。（B）用HBX表达载体或对照载体转染后48小时，HepG2和Huh7细胞中miR-122启动子荧光素酶报告活性（***p<0.001）。（C）使用脂质体将Mock-siRNA和HBX-siRNA（100 nM）转染到HepG2.2.15细胞中。HBX蛋白水平（左上面板）或mRNA（左下面板）western blot和qRT-PCR检测（转染72小时后）。通过qRT-PCR测定对照组和HBX-siRNA转染HepG2.2.15细胞中miR-122的表达水平（右侧面板）.（D）HBX与PPARγ相关。用HBX表达载体或对照载体转染HepG2细胞，细胞裂解物用抗PPARγ抗体免疫沉淀，然后用抗HBX抗体免疫印迹（上面板）HBX转染细胞或载体控制细胞中HBX和β-肌动蛋白的常规蛋白质印迹显示在下部面板.（E）qRT-PCR分析转染HBX和/或PPARγ的HepG2细胞中成熟miR-122。数据表示平均值+SD（***P<0.001，n=3）。（F）转染HBX和/或PPARγ的HepG2细胞中pri-miR-122的qRT-PCR分析。

讨论

本研究揭示了肝癌细胞中miR-122表达的一种新的表观遗传调控机制，包括PPARγ/RXRα与miR-122启动子的DR1和DR2基序结合。我们的研究结果表明，这一过程受PPARγ联合阻遏物（N-CoR和SMRT）和组蛋白甲基转移酶（SUV39H1）的影响。我们观察到PPARγ和RXRα与miR-122启动子的DR1和DR2基序结合，并且在用5-Aza-CdR和PBA处理的HCC细胞中，它们的结合显著增加。这种关联是PPARγ亚型特有的，因为PPARα不与DR1和DR2基序结合。与这些发现一致，我们观察到PPARγ和RXRα激动剂治疗增加了肝癌细胞中miR-122的表达。此外，过表达和敲除研究表明，PPARγ也调节非恶性肝细胞中miR-122的表达。这些发现表明PPARγ和RXRα是miR-122表达的正调控因子。另一方面，我们观察到5-Aza-CdR和PBA处理降低了N-CoR/SMRT与PPARγ/RXRα以及miR-122启动子中DR1和DR2元件的相互作用，表明PPARγ联合阻遏物N-CoR和SMRT是miR-122表达的负调控因子。此外，我们发现5-Aza-CdR和PBA处理抑制SUV39H1（一种催化形成H3K9二甲基和三甲基，导致基因转录抑制的H3K9-甲基转移酶）的表达，并降低SUV39H2与miR-122启动子DR1和DR2区域的结合。SUV39H1对miR-122抑制的作用得到了进一步的支持，该观察结果表明，敲除或抑制SUV39H2可增强肝癌细胞中miR-122的表达。与肝癌细胞相比，人类原代肝细胞中H3K9二甲基和三甲基含量较低，这也证实了后一发现。因此，SUV39H1是肝癌细胞中miR-122表达的另一个负调控因子。总之，我们的研究结果表明，肝癌细胞中PPARγ和RXRα介导的miR-122表达被N-CoR/SMRT/SUV39H1抑制（如图7). 似乎5-Aza-CdR和PBA减少SUV391可能导致N-CoR/SMRT/SUV39l从PPARγ/RXRα和DR1/DR2结合复合物中分离，从而允许miR-122基因转录。此外，我们观察到5-Aza-CdR和PBA处理也增加了miR-122启动子区域周围的组蛋白乙酰化。因此，肝癌细胞miR-122的表观遗传调控是一个复杂的过程，涉及PPARγ/RXRα/N-CoR/SMRT/SUV39H1/DR1/DR2结合复合物、组蛋白乙酰化和组蛋白H3K9甲基化。

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图7

miR-122表观遗传调控机制示意图

肝癌细胞和肝细胞中miR-122的表观遗传调控涉及PPARγ/RXRα/N-CoR/SMRT/SUV39H1/DR1/DR2结合复合物、组蛋白乙酰化和组蛋白H3K9甲基化。5-Aza-CdR和PBA治疗抑制SUV39H1的表达，并导致辅抑制复合物（N-CoR/SMRT/SUV39H2）与PPARγ/RXRα/DR1/DR2分离，从而允许PPARγ/RXRα诱导的miR-122基因转录。乙型肝炎病毒X蛋白通过直接结合抑制PPARγ，从而下调miR-122的表达。

先前的研究表明，miR-122的表达与包括HNF4α和C/EBPα在内的必需肝富集转录因子（LETF）的水平有关(11,18,19). 然而，HNF4α和C/EBPα似乎与HCC细胞中miR-122的表观遗传沉默无关，因为在我们的系统中，5-Aza-CdR和PBA处理并未显著改变其水平。值得一提的是，C/EBPα在包括肺癌和急性髓细胞白血病在内的几种肝外癌中表观遗传沉默(40,41)和HNF4α在卵巢癌中由于转录因子2（TCF2）的表观遗传沉默而降低(42). 因此，表观遗传修饰的敏感性可能取决于特定的组织背景和不同的肿瘤类型。

丙型肝炎和乙型肝炎病毒是与肝癌发展密切相关的主要表观遗传环境因素。在本研究中，我们研究了丙型肝炎病毒和乙型肝炎病毒对miR-122的差异调节机制。众所周知，miR-122通过与病毒基因组的5′-UTR结合，对HCV RNA积累至关重要。以前的报告显示，miR-122刺激HCV病毒蛋白翻译，并与Agonaute 2（Ago2）蛋白结合HCV RNA，从而减缓感染细胞中病毒RNA的衰变。在慢性丙型肝炎病毒感染的黑猩猩模型中，用锁定核酸（LNA）修饰的寡核苷酸沉默miR-122可抑制丙型肝炎病毒血症并改善丙型肝炎病毒诱导的肝脏病理(14). 然而，在本研究之前，HCV是否能够调节miR-122的表达尚不清楚。在我们的研究中，我们没有观察到感染HCV颗粒的Huh7.5细胞中miR-122表达和启动子活性的显著变化。因此，尽管miR-122积极调节HCV的复制和稳定性，但HCV感染似乎不会显著影响miR-122的水平。我们的发现也与之前的报告一致，该报告显示慢性丙型肝炎患者肝活检中HCV RNA和miR-122水平之间没有相关性(43).

与HCV感染相比，HBV感染患者miR-122显著下调(15). 已知miR-122下调细胞周期蛋白G1并中断细胞周期蛋白与p53的相互作用，从而消除p53介导的对HBV复制的抑制(15). 然而，在本研究之前，HBV介导的miR-122下调的机制尚不清楚。在本文中，我们采用了三种HBV感染系统（HBV在HepG2.2.15细胞中的稳定表达，HBV在HepaRG细胞中的短暂感染，以及HBV在原代人肝细胞中的暂时感染）；所有这些系统都表明HBV感染降低了miR-122的表达。我们的数据表明，HBX过表达显著降低了miR-122基因启动子活性并下调了miR-122的表达，而HBX的siRNA敲低增强了miR-122的表达。先前的一项研究报告称，HBX结合PPARγ，从而阻断核定位并抑制PPARγ介导的反式激活(39). 在我们的系统中，我们还观察到HBX与PPARγ直接相互作用，尽管我们没有观察到HBX对PPARγ的核转位，因为PPARγ定位于细胞核，而HBX定位于HepG2细胞的细胞质和细胞核(补充图S3). 我们的发现为HBX介导的PPARγ抑制miR-122转录提供了新的证据。

总之，本研究首次证明了PPARγ/RXRα复合物通过与HCC细胞中的共阻遏物和H3K9组蛋白甲基转移酶（SUV39H1）的相互作用对miR-122（一种关键的肝脏特异性miRNA）进行表观遗传调控。我们的数据也为HBV和HCV对miR-122的差异调节提供了重要的机制性见解。

补充材料

致谢

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脚注

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