氧化应激下SIRT1调节剂对FOXO和p53的调节

试剂和抗体

北美⁺（Oriental Yeast，Tokyo，Japan）和烟酰胺（Wako Pure Chemical Ind.）溶解在培养基中。将白藜芦醇（Wako Pure Chemical Ind.）、裂宫霉素（Calbiochem-Millipore，Billerica，MA，USA）、Ex527（Tocris Bioscience，Ellisville，MO，USA，美国）和抗霉素A（Sigma-Aldrich，St Louis，MO）溶解在二甲基亚砜中，以获得储备溶液。H（H）₂O（运行）₂和Hoechst 33342购自Wako Pure Chemical Ind。所用抗体为抗活性caspase 3兔多克隆抗体（Abcam，Cambridge，MA，USA）、抗SOD2兔多克隆（Millipore）、抗乙酰-p53兔多克隆疫苗（在小鼠p53上检测乙酰-Lys 379，在人p53上监测乙酰-Lys 382）、抗p53小鼠单克隆抗体、，抗FOXO1兔单克隆、抗FOXO3a兔单克隆，抗磷酸-AMPKα（Thr172）兔多克隆、抗AMPKα兔多克隆，抗磷乙酰辅酶A羧化酶（ACC）（Ser79）兔多clone，抗ACC兔多克隆（Cell Signaling Technology，Tokyo，Japan），抗乙酰辅酶OXO1兔子多克隆，反FOXO4山羊多克隆，抗Bax小鼠单克隆抗体（Santa Cruz）、抗GAPDH小鼠单克隆疫苗（Sigma Aldrich）和抗SIRT1兔多克隆抗体[18]抗体。

siRNA转染

抗小鼠SIRT1的siRNA（siTrio）如前所述从B-Bridge International获得[13]抗小鼠FOXO1、FOXO3a和FOXO4的siRNA来自圣克鲁斯。如前所述，从Sigma Genosys获得的无义siRNA被用作基因表达的非特异性效应的对照[13],[14],[16]使用Nucleofector试剂盒进行转染（Lonza，Walkersville）。将siRNAs（100 nM）转染细胞两次，间隔24小时。第二次转染后24小时，用抗霉素A处理细胞。

细胞死亡分析

通过核浓缩或活性caspase-3或Bax的免疫染色检测凋亡细胞死亡。用抗霉素A或H处理后，用4%多聚甲醛固定贴在玻片上的细胞10分钟₂O（运行）₂为了检测核浓缩的凋亡，用PBS洗涤细胞，然后用Hoechst 33342（1∶1000稀释）孵育进行核染色。按如下所述进行免疫染色。从每个处理的六个区域中测定浓缩细胞核细胞、活性caspase-3阳性细胞或Bax阳性细胞的百分比，并对三个独立实验的数据进行合并和分析。根据制造商的协议，使用Muse™计数和活性试剂盒（Muse™细胞分析仪，Millipore）对死细胞进行分析。

细胞内活性氧水平分析

用共焦激光显微镜对用5-（和-6）-氯甲基-2′，7′-二氯二氢荧光素二乙酸酯（CM-H₂DCFDA）（Invitrogen）。将附着在玻片上的细胞与CM-H孵育₂DCFDA在37°C下放置30分钟，然后用PBS清洗两次。用抗霉素A或H处理后₂O（运行）₂用4%多聚甲醛固定细胞10min，PBS洗涤。在相同条件下采集所有图像，并用Image-J软件（NIH）定量荧光。每个处理从六个场获得平均荧光强度，并结合三个独立实验的数据进行分析。

免疫染色

固定和洗涤后，用含有3%BSA、1%山羊血清和0.1%Triton X-100的PBS封闭细胞30分钟。然后将细胞与抗活性胱天蛋白酶-3（1∶250稀释）、SOD2（1∶500稀释）、Bax（1∶50稀释）或乙酰基-p53（1∶250稀释）的抗体在4°C下孵育过夜。然后用PBS清洗细胞四次，并在4°C下用二级抗体Alexa Fluor 488或594抗兔IgG（Invitrogen，1∶1000稀释）孵育过夜。用PBS清洗后，细胞用Hoechst 33342染色，并安装在玻璃载玻片上。在共聚焦显微镜观察期间，所有图像均使用相同的设置拍摄。

西方印迹法

细胞在CelLytic M细胞裂解试剂（Sigma）和1%蛋白酶抑制剂混合物（Nacalai Tesque）中进行裂解。为了分析乙酰-p53或乙酰-FOXO1，将烟酰胺（10mM）和曲霉菌素A（500nM）加入裂解缓冲液中。分析磷酸-AMPK和磷酸-ACC时，将磷酸酶抑制剂混合物（Nakalai Tesk）添加到裂解缓冲液中。然后对裂解产物进行超声波处理和离心，以去除不溶物。使用蛋白质定量试剂盒-Rapid（日本熊本市Dojindo）测量上清液的蛋白质浓度。如前所述，通过Western blotting分析等蛋白浓度的上清液组分（Tanno等人，2010）。用含有5%非脂肪乳或5%BSA的TBST（50 mM Tris-HCl，pH 7.5，150 mM NaCl，0.05%吐温20）封闭膜30分钟。在4°C下用一级抗体培养膜过夜。用TBST冲洗后，将膜与过氧化物酶标记的二级抗体（1∶10000稀释）孵育1小时。膜是通过使用增强化学发光的标准方法开发的。

逆转录与聚合酶链反应

使用RNeasy迷你试剂盒（Qiagen）分离总RNA。使用SuperScript III（Invitrogen）合成第一链cDNA。使用Taq DNA聚合酶（新英格兰生物实验室）通过RT-PCR进行DNA扩增。用于RT-PCR的引物序列如下：p53正向5′-AGTCACAGCACATGACGTGT-3′，反向5′-TACACATGTTACTTGTGGAT-3′; GAPDH转发5′-ACCACAGTCACATGCAATCAC-3′，反向5′-TCCACCCCTGTTGCTGTA; FOXO1转发5′-CAAAGTACACATACGGATCC-3′，反向5′-TGCCTGGCTGCCATACGCA-3′; FOXO3a转发5′-AACAGCACCTCTT-3′，反向5′-GCTGACAGAATTTGAGAGCA-3′; FOXO4转发5′-atacaccacctcctgcgatg-3′，反向5′-CCAGATCCTGAGGCATTCTGCAT-3′GAPDH用作控件。对于定量PCR，使用TaqMan Universal Master Mix II在StepOne（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统）中进行cDNA扩增，并对SOD2（Mm00449726_m1）或β-肌动蛋白（Mm01205647_g1）进行UNG（应用生物系统）和TaqMan基因表达检测。β-actin起到了内部控制作用。

SIRT1调节剂对抗霉素A诱导的p53依赖和p53依赖性细胞凋亡的影响

转录因子p53被SIRT1脱乙酰化并失活[7],[8]由于抗霉素A激活p53[19]，我们检测了p53是否介导抗霉素A诱导的C2C12细胞凋亡。p53敲除本身并不影响车用C2C12细胞的细胞死亡(图4A和4B). 然而，在抗霉素A的存在下，p53基因敲除显著减少了凋亡细胞的数量，但未能完全抑制凋亡(图4B)表明p53依赖和p53依赖机制均调节抗霉素A诱导的C2C12细胞凋亡。p53-siRNA转染部分抑制SIRT1抑制剂SP的促凋亡活性(图4C)表明p53依赖性途径参与了SP诱导的细胞凋亡增强。然而，SP仍能增强抗霉素A诱导的p53敲除细胞凋亡(图4C). 此外，在p53-siRNA的存在下，RSV仍然减少了凋亡细胞的数量(图4D).

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图4

p53敲除对SIRT1调节剂功能的影响。

（A） RT-PCR分析转染抗阴性对照（Ctrl）或p53 siRNA的C2C12细胞中的p53和3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）。（B） 用载体或AA（50µM）处理转染对照组（Ctrl-si）或p53-siRNA（p53-si）的C2C12细胞24小时。对核浓缩的凋亡细胞进行定量。数据来自三个独立的实验。（C和D）分析细胞核浓缩C2C12细胞的百分比。将转染有对照组（Ctrl-si）或p53-siRNA（p53-si）的C2C12细胞用载体或60µM斯普利霉素（SP in C）或10µM RSV in D预处理3小时，然后用50µM抗霉素A（AA）孵育24小时。数据来自三个独立的实验。（E） 野生型（p53+/+）或p53缺乏型（p53−/-）HCT116细胞中p53 mRNA的RT-PCR分析。（F） 用载体或AA处理24小时的野生型（p53+/+）或p53-null（p53-/-）HCT116细胞中细胞核凝集的凋亡细胞的定量。数据来自三个独立的实验。（G和H）SIRT1调节剂处理的HCT116细胞的凋亡分析。用60µM SP（G）或10µM RSV（H）预处理野生型（p53+/+）或p53缺乏型（p53−/−）HCT116细胞3小时，然后用50µM AA孵育24小时。数据来自三个独立的实验***p＜0.001，**p＜0.01，*p＜0.05。（一） 用载体或抗霉素A（AA，50µM）处理的C2C12细胞中乙酰基p53（K379）和p53的代表性免疫印迹，有或没有用白藜芦醇（RSV）或Ex527进行预处理。在50 nM曲古抑菌素A的存在下处理所有细胞。

为了排除残留p53导致p53-siRNA转染细胞凋亡的可能性，我们检测了p53阳性（p53（+/+））和p53缺陷（p53）HCT116人结肠癌细胞(图4E). 抗霉素A诱导的p53（−/−）细胞凋亡数量明显小于p53（+/+）细胞，表明p53通路参与了抗霉素A诱导HCT116细胞死亡(图4F). SP和RSV分别通过抗霉素A显著增加和抑制p53（−/−）细胞的凋亡(图4G和4H)尽管SP处理增加的凋亡细胞数量在p53（−/−）细胞中显著低于p53（+/+）细胞(图4G). 这些发现表明，p53依赖和p53依赖机制都调节C2C12细胞和HCT116细胞氧化应激引发的凋亡，SIRT1调节剂影响这两种机制来调节细胞死亡。

由于SIRT1通过促进p53去乙酰化抑制p53活性[7],[8]，我们检测了SIRT1调节剂对p53乙酰化水平的影响。Western blotting和免疫细胞化学显示，抗霉素A增加了乙酰基p53水平。用呼吸道合胞病毒处理细胞降低了乙酰-p53水平，而特异性SIRT1抑制剂Ex527强烈增强了p53乙酰化(图4I和4J).

FOXO1、FOXO3a和FOXO4参与白藜芦醇依赖性SOD2诱导

接下来我们研究了FOXO转录因子是否在SIRT1调节剂，特别是RSV对p53诱导的抗霉素a诱导的凋亡的依赖性调节中发挥作用。FOXO在氧化应激反应中具有双重作用，在氧化应激中，它们既促进凋亡，又诱导ROS-脱毒酶，如SOD2。如前所述[13],[16]、RSV诱导C2C12细胞和新生大鼠心肌细胞SOD2表达(图5A和5B). 在哺乳动物中，FOXO家族由FOXO1、FOXO3a、FOXO4和FOXO6组成。FOXO1、FOXO3a和FOXO4广泛表达于各种组织，而FOXO6主要表达于大脑[20]因此，我们在以下实验中分析了FOXO1、FOXO3a和FOXO4。由于所有这三种FOXO都在C2C12细胞中表达，我们通过使用每个FOXO的siRNAs来检测在抗霉素A治疗下RSV诱导SOD2的过程中涉及哪些FOXO(图5C). 我们发现FOXO1、FOXO3a或FOXO4的个体敲除显著降低SOD2的表达(图5C和5D). 当C2C12细胞被转染一种siRNA混合物（FOXOs-siRNA），对抗FOXO1、FOXO3a和FOXO4时，RSV对SOD2的诱导被阻断(图5E). 此外，通过CM-H监测细胞内ROS水平₂DCFDA显示RSV引起的ROS水平下降被FOXOs-siRNA阻断(图5F和5G).

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图5

白藜芦醇通过FOXO上调SOD2并抑制抗霉素A诱导的ROS。

（A） C2C12细胞在RSV（100µM）存在或不存在的情况下培养6小时，然后进行蛋白质印迹分析SOD2蛋白水平。（B） 培养的新生大鼠心室肌细胞SOD2免疫染色的代表性图像（上部）和量化数据（下部）。细胞在载体（Ctrl）、白藜芦醇（RSV）或烟酰胺（NA）存在下培养48小时。比例尺：10µm。（C） RT-PCR分析转染阴性对照siRNA（Ctrl）或针对FOXO1（F1）、FOXO3a（F3a）或FOXO4（F4）的siRNA的C2C12细胞中的FOXO转录因子。（D） 实时RT-PCR定量分析C2C12细胞（N = 6） 。用抗阴性对照（Ctrl）、FOXO1（F1）、FOXO3a（F3a）或FOXO4（F4）的siRNA转染细胞后，用白藜芦醇（RSV，30µM）预处理细胞3小时，然后用抗霉素A（AA，50µM。（E） SOD2的免疫印迹分析。将用对照siRNA（Ctrl-siRNA）或针对所有三种FOXO的siRNA（FOXO1、FOXO3a、FOXO4）转染的C2C12细胞与载体或RSV（30µM）预孵育3小时，然后用AA（50µM）在没有血清的情况下处理24小时。全细胞裂解物进行免疫印迹分析。（F） CM-H的代表性图像₂DCFDA染色的C2C12细胞。用载体或RSV（30µM）预处理3小时后，用AA（200µM。比例尺：10µm。（G） CM-H的量化₂DCFDA（DCF）荧光。数据来自三个独立的实验。（H） C2C12细胞中乙酰-FOXO1和FOXO1的免疫印迹。细胞用载体、抗霉素A（AA，60µM）或RSV（30µM，+AA）处理（左面板），或在曲古菌素A（TSA）存在下用载体或烟酰胺（NA，20 mM）培养（右面板）。（一） 用带有或不带有RSV的载体或AA处理的C2C12细胞中FOXO3a和FOXO4的代表性免疫印迹。***p<0.001，**p<0.01。未另行规定。 = 不显著。美国。 = 任意单位。

由于SIRT1通过乙酰化调节FOXO活性，我们评估了RSV对乙酰-FOXO1水平的影响(图5H). 在抗霉素A存在下，RSV显著降低乙酰-FOXO1水平(图5H)表明RSV增强了FOXO1的脱乙酰化。SIRT1抑制剂NA增加乙酰-FOXO1水平(图5H). 出乎意料的是，我们发现用抗霉素A处理C2C12细胞会降低FOXO1蛋白水平，而这不受RSV的影响。抗霉素A处理也会下调FOXO3a和FOXO4蛋白水平(图5I). 抗霉素A下调FOXO蛋白使我们难以通过免疫沉淀实验检测乙酰化FOXO（数据未显示）。

FOXO1、FOXO3a和FOXO4基因敲除完全抑制白藜芦醇在C2C12细胞中的细胞保护功能

最后，我们检测了所有三种FOXO mRNA的敲除是否影响抗霉素A处理的C2C12细胞中RSV的细胞保护功能，而三种FOXO-siRNAs的表达则完全消除了其细胞保护作用(图6A). RSV预处理转染对照siRNA的C2C12细胞也抑制了抗霉素A诱导的BAX积累，BAX是早期凋亡指标(图6B). RSV对BAX积累的这种抑制被三种FOXO mRNA的敲除所抑制(图6B). 此外，与转染对照siRNA的细胞相比，FOXOs-siRNA显著增加了抗霉素A诱导的凋亡细胞的数量(图6A和6B). 这些发现表明，FOXO对于RSV诱导的细胞保护机制对氧化应激是不可或缺的。为了排除FOXOs-siRNAs影响p53脱乙酰状态的可能性，我们对C2C12细胞进行乙酰基p53免疫染色。RSV显著降低了转染对照siRNA和FOXOs-siRNA的C2C12细胞中乙酰基p53的水平(图6C)表明FOXO的敲除并不影响p53的乙酰化水平。

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图6

FOXO介导白藜芦醇的抗凋亡作用。

（A） （左）C2C12细胞中Hoechst33342核染色的代表性图像。用载体或白藜芦醇（RSV，30µM）预处理转染对照siRNA（Ctrl-siRNA）或抗所有三种FOXO（FOXO1，FOXO3a，FOXO4）的siRNA混合物（FOXO-siRNA）的细胞3小时，然后在无血清条件下用抗霉素a（AA，50μM）孵育24小时。比例尺：50µm。（右）通过核浓缩定义的凋亡细胞的定量。数据来自三个独立的实验。（B） （左）按A.处理的C2C12细胞中BAX（绿色）免疫染色的代表性图像。比例尺：10µm。（右）BAX积累细胞的量化。数据来自三个独立的实验。（C） 在如A中处理的C2C12细胞中乙酰化p53（红色）的代表性免疫荧光图像。通过使用抗乙酰基-p53的抗体进行免疫染色来检测p53的乙酰化。数据来自三个独立的实验。比例尺：20µm***p<0.001，**p<0.01，未另行说明。 = 不重要。

通过FOXO活性的调节实现细胞存活

在哺乳动物中，有四个FOXO转录因子成员，其功能似乎相互重叠[10]事实上，我们在这里观察到，RSV在抗霉素A存在下对SOD2的诱导被FOXO1、FOXO3a或FOXO4的个体敲除显著抑制(图5D). 在氧化应激条件下，SIRT1激活物RSV增加SOD2水平(图5E)，降低了ROS水平(图5F和5G)促进细胞存活(图6A和6B)通过FOXO。

我们之前的研究表明，SOD2敲除完全抑制RSV对抗霉素A的抗凋亡功能[13]综上所述，结果表明，在抗霉素A诱导的氧化应激下，RSV增加SOD2表达对细胞生存是必要的。FOXO1、FOXO3a和FOXO4的敲除抑制了呼吸道合胞病毒对SOD2的诱导，但未能消除SOD2的基线表达(图5E). 这可能表明，包括SOD2在内的ROS脱毒酶的上调对RSV抵抗高ROS水平的细胞保护作用很重要。SOD2催化O的歧化₂ ⁻至H₂O（运行）₂，进一步代谢为H₂O和O₂通过过氧化氢酶和过氧化物酶。因为FOXOs可以诱导过氧化氢酶和一些过氧化物酶[9],[23]因为SIRT1调制器对H的影响相似₂O（运行）₂-抗霉素A诱导的细胞凋亡(图1和​和2），2)RSV通过FOXO的细胞存活效应不仅取决于SOD2的诱导，还取决于下游ROS脱毒酶的增加。

在没有抗霉素A的情况下，与转染对照siRNA的细胞相比，三种FOXO-siRNA的表达意外地增加了细胞ROS水平和凋亡细胞的数量(图5F和​和6）。6). 因此，在没有FOXO的情况下，细胞代谢产生的ROS，例如线粒体氧化磷酸化，可能会触发细胞凋亡，FOXO可能通过降低细胞ROS水平来持续保护细胞。

FOXO的活性受乙酰化和脱乙酰化的调节[9]SIRT1激活增强FOXO1的转录活性[24]、FOXO3a[25]和FOXO4[26]在ROS脱乙酰化酶上，CBP/p300介导的FOXO乙酰化会削弱其DNA结合活性[9]最近我们发现SIRT1对p300的脱乙酰化促进了p300的泛素化和下调，RSV降低了p300蛋白水平[15]因此，SIRT1下调p300也可能增加去乙酰化FOXO水平。此外，据报道RSV通过SIRT1介导的脱乙酰化作用促进FOXO1的核保留[27]，这可能会增加其转录活性。

通过改变p53活性实现细胞存活

我们在这里显示，C2C12细胞和p53缺失的HCT 116细胞中p53基因敲除后，抗霉素A诱导的凋亡分别少于亲代C2C12和p53阳性HCT116细胞(图4B和4F)表明p53参与了氧化应激诱导的凋亡途径。在氧化应激下，p53阳性C2C12细胞和p53（+/+）细胞中SIRT1抑制剂SP的存在分别比p53敲除C2C12和p53的HCT116细胞中凋亡细胞更多(图4C和4G). 这些结果表明，p53依赖性凋亡机制也受到SIRT1调节剂的调控，这与SIRT1在电离辐射、足叶乙甙和H₂O（运行）₂治疗[7],[8].

我们感谢T.Tokino提供的HCT 116细胞和M.Tanno提供的技术建议。