配体结合与环境与构象的耦合
配体结合通常会导致结构和动力学的改变，动力学的增加和减少通常发生在同一蛋白质的不同部位(4). 配体结合对蛋白质活性的影响可以根据经典热力学概念来观察，如变构、诱导配合或构象选择以及协同性(1–6). 为了简单起见，我们考虑活动状态和静止状态之间的两种状态转换。实验观察到的放射性变化取决于以下几个因素：(一)活性状态和静息状态之间的自由能差或“能隙”，它决定了在没有配体的情况下处于活性状态的蛋白质的比例；(b)蛋白质对配体的亲和力及其浓度；以及(c（c）)配体在完全结合时诱导转变的能力。即使配体与活化构象和静止构象结合，也会发生不完全活化，即使配体完全结合。在这种情况下，活化程度与配体对活化状态与静止状态的相对亲和力有关。耦合平衡的这些概念得到了很好的研究和理解。将这些与部分活化、增强和协同配体等现象联系起来是一个简单的代数记帐问题，如下所示。
在下一节中，我们将从更定量的角度探讨当有多个配体能够激活感兴趣的蛋白质时，这些简单的结合现象如何导致各种激活曲线。在这种情况下，不同位置的不同配体结合位点可以“配对”以产生多种结果；其中一种结合可以改变另一种对蛋白质的亲和力，并且它们可以对配体饱和时的最大活化程度产生加性或非加性影响。
结合和功能跃迁的耦合是指配体与一个位点的结合影响第二个位点的结构、动力学和结合亲和力的现象，这与蛋白质的能量间隙以及调控配体对激活态与静息态的亲和力之比有关。考虑到这些简单的要求，可以用不同的方式实现耦合就不足为奇了。一种特殊情况是配体的结合引起结合状态的改变。当没有观察到关联的变化时，通常会隐含地假设信号是通过“硬连接”发生的，其中螺旋移动、倾斜或改变寄存器，机械地驱动在双层中传播的构象变化。第二个模型涉及子单元之间的通信，这可能导致相邻域或通过柔性链接器连接的域之间的交互发生大规模或微妙的变化。当测量结合位点之间位置突变的影响时，这些不同的通信模式可能会导致不同的结果。例如，如果一个域作为刚体移动，那么从一个位置到另一个位置的“路径”搜索可能会产生与侧链的相关运动不同的结果，侧链以两种状态的方式在两个位置之间传播。
最后，TM蛋白的能量缺口的大小和符号取决于膜环境。改变特定残基暴露或蛋白质在膜中给定位置的宽度（横截面积）的任何结构变化都会使能量间隙对双层的物理特性敏感。因此，机械敏感通道会随着双层张力的变化而开启(7). 钾通道对TM电势作出反应，细胞质环和螺旋的位置和耦合随着双层中磷脂酰肌醇、鞘磷脂和胆固醇的比例而改变(8–11). 事实上，TM螺旋的疏水长度反映在其所在细胞器中双层的宽度上。此外，一旦位于给定的膜中，脂质环境和蛋白质构象之间存在紧密耦合，例如，蛋白质会分裂成富含胆固醇/鞘磷脂的相(12,13).
能量联轴器的简单模型
能源缺口
认为功能蛋白质至少具有两种热力学状态是很方便的，即静息状态和活性状态。它们之间的自由能隙ΔG公司缺口=G公司积极的–G公司非活动的（其中G公司积极的和G公司非活动的分别是活性和非活性状态的自由能），确定活性蛋白质的平衡分数为.R（右）是气体常数，并且T型是绝对温度。由于处于活性状态的蛋白质的最大可能部分是1，这也决定了由于任何配体的结合或扰动而可以达到的最大活化程度，如A类= 1 +e（电子）ΔG公司缺口/RT公司例如，如果ΔG公司缺口为0.41 kcal/mol，则在室温下，活性态的背景分数为1/3。因此，即使是最好的活化剂也只能使活性增加三倍。然而，如果ΔG公司缺口为6.82 kcal/mol，最大活化度为105.
当配体与活性物质的亲和力高于非活性物质时，配体就会激活（参见). 如果K（K）A类和K（K）我是分别与活性和非活性状态结合的配体的离解常数，如果K（K）A类<K（K）我此外，分数K（K）我/K（K）A类决定配体的激活电位。当系统被配体饱和时，活性态和非活性态之间的自由能差变为：对于理想的活化配体，K（K）我接近无穷大，配体饱和导致完全激活，最大激活度（相对于背景）仅受固有Δ的限制G公司缺口如果配体结合到这两种状态，最大激活度为，并受到固有Δ的限制G公司缺口和平衡结合常数之比K（K）我/K（K）A类（请参见). 对于给定的蛋白质（和固定ΔG公司缺口)不同配体的平衡结合常数之比可能不同，导致配体饱和时活化程度不同。生物过程的特殊性决定了Δ的大小G公司缺口以及如何通过绑定进行调整。大ΔG公司缺口和K（K）我/K（K）A类导致高度的最大激活(). A大ΔG公司缺口在有多个效应器组合作用的情况下也很有用。
简单关联平衡模型。(一)一个热力学循环，说明两态蛋白质活化与配体结合之间的耦合。(b)作为激动剂配体浓度函数的两态蛋白质的激活特征。非活性和活性状态的离解常数之比，K（K）我/K（K）A类和固有能隙ΔG公司缺口，确定可达到的最大激活。(c（c）)一个简单信号转导分子的示意图。两个结构域，一个受体结构域和一个细胞质功能结构域，每一个都有两种状态，与受体进行热力学耦合，由激活配体调节。系统的所有八种状态都会明确显示。为了简单起见，省略了配体-束缚态（立方体背面）之间的自由能差异，但只遵循热力学循环。L（左）表示细胞质配体的浓度。在一和c（c），平衡自由能差对应于它们所示的箭头方向。(d日)面板中系统的激活配置文件c（c）作为细胞质结构域能量隙的函数，以及将受体的自由能耦合到细胞质域，.K（K）A类和K（K）我分别设置为10 nM和20μM，以及受体域的能隙，，设置为3.0 kcal/mol。该系统的有效能隙可以显示为因此，如果为零（即受体和细胞质域之间没有耦合），则总间隙为，但只要为阴性（即受体的激活促进功能域的活性状态）导致整体能源缺口增大。同样，更紧密的耦合（下部)导致更高的总间隙和更大的最大激活度。
环境
ΔG公司缺口可以通过环境变量进行调节，例如膜的组成。虽然可能将膜效应视为结合位点的集合，但我们将其视为调节Δ的环境因素G公司缺口在最简单的情况下。例如，电压依赖性钾通道存在于“开”和“关”构象之间的平衡状态，这些构象不仅在电导特性上不同，而且在不透电膜两侧的带电基团数量上也不同。开-关构象变化涉及12个带电基团在膜上的运动，对应约0.28 kcal/mol/mV。因此，当膜电位增加10 mV时，会发生突变(14)因此，如果在静止状态下，活性通道的数量为1%，则电位的10-mV变化将导致50倍的激活。
联轴器
相邻蛋白质结构域的激活状态可以耦合。例如，一旦TM信号蛋白的受体结构域转移到其活性状态，该信息就会传递到分子的功能性细胞质末端。这有时被称为变质性，相当于说明分子的一端与另一端是热力学耦合的。这种耦合取决于分子结构和动力学的具体情况，但可以认为是由处于不同状态时的畴间相互作用自由能的差异引起的。因此，可以用热力学耦合自由能参数ΔΔ捕捉到这种畴间耦合或合金化G公司c（c），这决定了不同领域相互经历状态的程度。1
简单模型1
考虑TM信号分子的简单模型.具有能量缺口的两态细胞外受体结构域，从信号配体接收输入，信号配体优先与受体的活性状态结合。受体域通过耦合自由能参数进行热力学耦合，连接到细胞质结构域，细胞质结构域在其活性状态下执行系统的功能。细胞质结构域的固有活性由其自身的能隙控制，.显示了该系统的活性曲线（例如，活化水平是配体浓度的函数）如何取决于和由于整个系统的功能是基于细胞质结构域的活性，其间隙的高值导致背景活性的低水平，从而导致更多的开关样行为（比较高低剖面在里面). 然而，由于这两个结构域是耦合的，因此受体结构域的能隙也会影响激活水平。事实上，这两个领域的能隙可以被视为共同调节系统的整体有效能隙，如所示.
简单模型2
TM结构域可能有两个或多个状态，特别是因为许多TM结构域是二聚体，自然会导致多个低能构象或局部结合的变化。在，我们考虑TM结构域具有自己的活性和非活性状态，受体的状态与TM的状态耦合，TM的状态又与细胞质结构域的状态耦合。说明了激活曲线如何依赖于该模型中的新参数——TM结构域的能隙及其与细胞质结构域的耦合。虽然细胞质结构域的较大能量隙总是导致系统的较大总能量隙（即，最大激活程度更大），但TM结构域的能量隙不一定如此（参见). 增加的影响可以向任一方向移动，具体取决于其他参数。直觉上，这是因为与,不直接调节功能性细胞质结构域的活性，而是通过热力学耦合进行调节。增加的由于两个结构域耦合，导致细胞质结构域的绝对活性分数降低。这有助于在静息状态下沉默背景活性，而在存在活化配体的情况下，它限制了活性蛋白的最大部分。总体后果取决于这两种影响中的哪一种占主导地位。由于TM域降低了静息状态的活性，因此与没有两态TM域的系统相比，它可以提供更高水平的激活(). 这说明了具有多个松散耦合域的优点，它允许强大的开关行为，而无需在活动状态和非活动状态之间使用较大的能量屏障。中间域还为信号的调制提供了额外的机会。其他环境条件，如膜的状态或特定配体的存在，可以整合到信号系统的最终输出中。
信号分子的更复杂模型。(一)除了受体和功能性细胞质域外这里，跨膜（TM）结构域被明确建模为具有两种状态。激活状态下TM域的固有分数定义为，并通过系统的16种状态以及相应的自由能如右图所示。(b)激活配置文件的依赖性和.K（K）A类和K（K）我分别设置为10 nM和20μM，并显示其他参数的值。带圆圈的线显示了不存在两态TM结构域的情况，受体结构域与具有相同结构域的细胞质结构域直接耦合与其他车型一样。
简单模型3
细胞外和细胞内信号可以由同一受体整合。VirA/VirG双组分系统根癌农杆菌将多种输入与其细胞外和细胞质域相结合，包括植物酚类信号分子、单糖和pH(15). 这可以通过添加一个两态细胞质连接域来建模(). 细胞内配体，如酚类分子，与活性态的结合比与非活性态的结合更强（配体C类在里面)而另一种配体，如糖，调节受体结构域（配体）的状态L（左）在里面). 一种配体的最大活性和半最大活性浓度（IC50）都会随着另一配体的不同浓度而变化(). 这两种配体对活性的累积调节实际上等于信号整合。只有在两种配体都以特定浓度存在的情况下，细胞才能使用它来执行某些动作。在这种情况下，两种配体被选择与各自结构域的活性状态更紧密地结合，但抑制信号也可以调节受体功能。
受VirA/VirG双组分系统的VirA蛋白启发，建立了一个现实的信号转导模型。(一)除了模型中的域和状态外，有一个细胞质连接域，有自己的活性和非活性状态，由信号配体调节C类.不同的配体，L（左），调节受体。此系统中的状态总数为64个，为了清楚起见，只绘制了完全非活动状态和完全活动状态的图表。(b)相对于静息状态的激活是根据配体浓度的增加绘制的L（左）在不同浓度的C类这说明了整合来自多个配体的信号的能力。尽管该模型没有明确地将受体视为二聚体（就像VirA蛋白的情况一样），但它可以很容易地扩展到二聚体。在这种情况下，配体的结合可能与受体二聚体偶联，也可能不与受体二聚体偶联，并且两个配体结合位点之间可能存在协同性（阴性或阳性）。可以探索的潜在情况包括：单个配体的结合可能会将系统推向活性状态，而对称地结合两个配体可能有利于非活性状态；或者，受体可能只在两个配体结合时发出信号；或第二配体的结合可以独立于第一配体进行。
M2质子通道和K的离子结合特性、传导和栅极的热力学和结构耦合+通道
在本节中，我们探讨了环境变量和渗透离子结合与两个蛋白质家族的结构、动态和功能属性耦合的机制：(一)K系列+以KcsA和电压门控K为代表的通道+通道(16–18)和(b)以甲型流感病毒M2质子通道为代表的病毒孔蛋白(19,20). 尽管总体结构存在很大差异，但它们有许多相似之处。
两者都有双门来调节离子扩散到通道中或通过通道。
它们通过结合渗透离子的多个拷贝来实现高选择性。
闸门的运动是热力学耦合的。
M2和K+通道被带正电的疏水性烷基胺阻断。
K的结构和导电性能+对渠道进行了广泛的审查(16–18). 然而，与其两个闸门的开启和关闭相关的能量耦合的结构基础现在才变得清楚(21–34). 同样，近年来M2质子通道活性的结构机制也有了显著的进展(35–40).
甲型流感病毒M2的生物学功能和结构生物学
M2是一种小型多功能膜蛋白，对甲型流感病毒的生命周期至关重要(41–44). 这种质子通道最初被发现是抗病毒通道阻断药物金刚烷胺和金刚乙胺的靶点。该通道将质子导入包裹在酸化内体中的病毒内部，对病毒RNA从基质蛋白中脱膜至关重要。M2延缓了某些病毒株晚期高尔基体的酸化。它的通道活性和其他独立功能被划分成非常紧凑的序列，由一个短的N末端区域组成，该区域对并入病毒粒子很重要(45); 四聚体、药物结合和质子通道形成所必需和足够的TM螺旋(46–49); 通道形成或药物结合不需要的C端两亲性螺旋(46)但涉及膜定位、出芽和断裂(43); 和与基质蛋白M1相互作用的C末端尾巴(50). 卵母细胞全长M2的突变和电生理测量表明，耐药突变发生在TM螺旋N末端的孔衬里残基上(51–53). 金刚烷胺结合M2TM结构域的最新晶体结构(37)显示了N端孔区的电子密度。当药物在胶束中的浓度非常高时，可以观察到蛋白质外部的第二个位置(38)或双层(19)，但电生理研究和反向工程病毒的药物敏感性表明，该位点对该通道的药理抑制没有贡献(51–53).
M2的膜相互作用域是40个残基区(47)由TM成孔结构域组成，其次是基本的两亲螺旋(43,54). 用X射线晶体学研究了孔隙结构域的结构(37,40)和固态核磁共振（SSNMR）(19)从而产生不同分辨率的结构。最高分辨率结构为1.65-Ω晶体结构(40)胶束M2的TM结构域，补充了在不同条件下以中间分辨率（2.0到3.5º）获得的早期结构(37). 该肽也已通过定向和魔角旋转核磁共振研究(49,55)最终形成磷脂双层中的金刚烷胺肽复合物结构(19)，分辨率与溶液NMR相当。溶液核磁共振(38,56)和最近的SSNMR研究(35)重点研究了包含TM和细胞质螺旋的片段的结构。尽管这些研究在TM区螺旋的总体排列上有合理的一致性，但它们将细胞质螺旋置于不同的方向；在解决方案结构中(56)，细胞质螺旋形成一个伸入细胞质的四聚束，而SSNMR结构将细胞质螺旋放置在暴露于双层头组区域的束的C末端(35). 广泛诱变(43,46,54)已经表明，细胞质螺旋有助于病毒的定位和出芽；然而，SSNMR或溶液结构中细胞质螺旋形成的相互作用的五个残基同时突变对全长蛋白质的表达、插入、传导、选择性或药物结合没有明显影响(43,46,54). 这与细胞质螺旋段具有不同于通道形成的功能并以很大程度上自主的方式发挥作用的事实一致(43). 仅此序列的合成16位肽就能够诱导巨大单板层囊泡的出芽(43)该序列的突变抑制了体内转染M2蛋白的发芽。
通过M2和K的离子结合和通量+通道
离子通过通道的流量受到严格控制，以防止泄漏，这将对生物体的生命造成灾难性的影响。例如，电压门控通道在非常窄的TM电势范围内受到严格调节(16)并且激活的pH依赖性和M2通道的最大传导密切匹配，不超过特定病毒株的要求，以将对宿主细胞的毒性降至最低(51).
说明了K的离子导电孔+信道，KcsA(57,58)与M2质子通道相比(40). 在这两种情况下，离子首先遇到一个疏水门，该疏水门是由多孔螺旋线的聚合形成的；KcsA的激活或“A门”处于闭合构象，而M2的Val27门部分打开。在KcsA中，一个离子接下来会遇到一个中央水腔，然后是一个具有可以结合四个离子（尽管不是同时结合）的位点的选择性过滤器。最后，一组水线状的水分子标志着出口。
M2和KcsA的离子导电孔。两者都是细胞质结构域向下绘制的。M2的生理离子流向内（向下），而KcsA的生理离子流量向外（向上）。(一)M2的高分辨率晶体结构[蛋白质数据库（PDB）代码3LBW]显示了整体结构，以及(b)有序孔内衬侧链和水分子的放大。在所有五个面板中，水分子显示为小洋红球体，并且面板中注释了各种侧链的身份b. (c（c）)KcsA（PDB代码1K4C）在选择性滤光片中与钾离子的结构显示为深灰色。其他钾离子以灰色显示，水合水以洋红色显示。(d日和e（电子）)金刚烷胺和四丁基铵（TBA）的结构分别与M2和KcsA结合（后者的PDB代码为2HVK）。面板中M2的结构d日来自固态核磁共振结构（2KQT），其中3LBW中的水对接，以显示水分子的大致位置。
在过饱和离子浓度下，通过开口形式孔隙的通量速率通常与扩散侧的离子浓度成比例，乘以二阶速率常数(16). 因为离子可以双向流动，所以只有在TM化学或电梯度存在的情况下才能观察到给定物种的净通量。离子通过K扩散的二阶速率常数+通道接近扩散控制极限（~108M（M）–1秒–1)，导致利率接近108生理电化学梯度下的离子/秒(16). 选择性过滤器决定K的能力+显示如此高速率的通道，同时保持对K的精细选择性+Na上的离子+.两个钾离子（由一个水分子分隔）可以在给定的时间稳定地占据四个结合位点，并且它们在“1和3”以及“2和4”构型之间振荡，占据率几乎相等(57,59–62). 选择性过滤器的导电构象结合这些K+相对紧密，离解常数大约比生理离子浓度低两个数量级(59)，导致特定的稳定，如与K的结合作用+提供足够强大的驱动力，以诱导具有收敛和周期性的封闭羰基阵列（以及Thr75侧链）的构象，从而在1和3与2和4构型中创建四个具有几乎完全匹配能量的位点。第三个K的移动+从选择性过滤器正下方的水腔中的位置（)进入选择性过滤器导致离子的排斥和快速排出到细胞外部。整个过程大约在10毫微秒内发生，表明路径上没有高能屏障。因此，两个紧密结合位点和第三个弱位点之间的负协同性既提供了高选择性，也提供了非常快速的K+扩散。该网站也有很高的选择性；当只有Na时+在解决方案中，通道默认为非导电构象，在站点2和3处折叠。根据静电、水合、空间位阻和熵的相对贡献，这一过程的理论基础仍然是一个活跃的研究领域(63–67).
M2质子通道传导质子的总二阶速率常数约为107到108M（M）–1秒–1接近pH 6(68–71). 鉴于该pH值下的质子浓度非常低，该速率常数转化为约100个离子/s的周转率。虽然看起来很慢，但该速率与质子通过M2通道尺寸的孔的扩散控制通量的预期速率大致相同(20,68). 在病毒基因组背景下，质子通过M2的精确速率以序列依赖的方式变化(51,72,73). 质子通过M2的速率在低pH值时达到上限(74,75)这表明，当质子快速扩散到通道中时，除质子扩散到通道外的其他过程将成为速率限制。平衡研究表明，M2在His37的每个四聚体通道上以高亲和力结合两个质子(76). pK一这两种组氨酸的含量比通道发挥作用的生理pH高约8个或约两个数量级。因此，前两个质子的结合专门驱动构象系综朝向导电状态(). 第三个pK一His37接近6，与pH-质子通量剖面的中点相匹配(74,75). 在质子传导的梭子模型中(77)蛋白质在+2和+3状态之间交替，低pH下质子通量的饱和与His37的速率限制脱质子相关（以及任何伴随的构象变化）。根据上述质子达到约10的速率这一事实，可以得到脱质子速率的数量级估计值8M（M）–1秒–1和第三个pK一His37，预计关闭率约为100秒–1与实验值吻合良好(68–71). M2促进来自内体酸性环境（pH）的质子扩散外面的)进入病毒内部（pH在里面)电生理测量表明，低pH值时质子通量较大外面的和高pH值在里面而大多数甲型流感病毒株M2的情况正好相反(70,74,75,78). Trp41与His37相互作用，是这种不对称电导所必需的(78). pH值较长时在里面和pH外面的都很低，可以观察到较低水平的阳离子通量，防止电梯度的形成，否则会导致质子积聚在病毒内部(71).
M2在中性到+2态的结构研究为M2的不对称质子通量提供了解释。高分辨率结构（蛋白质在+2状态下的1.65μl）显示了一个充满水分子级联层的孔隙，与氨基酸侧链交错，为质子通过氢键水和侧链的“线”扩散提供了一条途径(40). 质子通过Val27门进入通道。质子穿过无序的水区域，到达水分子的“入口团簇”，该团簇由六个水组成的三棱柱组成，其方形底部通过氢键固定在N上δHis37和Gly34的羰基氧（结晶突变体中的Ala34）。His残基参与类似芳香盒的“His-box”相互作用，相邻环以边-面方式相互作用。咪唑类化合物之间没有直接的氢键，而是通过高度结构化的水分子网络连接起来的。
在希氏盒的细胞质一侧，它的Nε氮素结合水分子的紧密“桥联”二聚体，该二聚体位置良好，可与Trp41残基的富电子环介导π-阳离子相互作用。Trp41环通过第三簇水分子稳定在篮状结构中，该簇水分子桥接Trp41的吲哚NH和Asp44的羧酸盐，完成病毒内部的通路。在基于孔形成区突变的蛋白质模型中首次预测了His盒的基本排列(77)在溶液核磁共振结构中也可以看到(38)以及金刚烷胺络合物的高分辨率SSNMR结构(19). 已经提出了His残基的另一种取向，但这种排列是基于一个SSNMR模型，该模型完全由主链酰胺的取向测量建立的，没有包含任何实验距离限制或关于侧链几何排列的信息(35). 在大多数结构中，Trp41篮具有良好的定向性，可以抑制质子从酸化病毒中反向流出。
基于他们的高pK一秒(8)，前两个质子与His37的结合在热力学上稳定了His37盒，与前两个K的结合方式基本相同+离子稳定KcsaA的选择性过滤器，而第三渗透离子的结合亲和力较低（pK一≈6），并增加了附着在His盒上的质子的不稳定性。SSNMR研究表明，第三次质子化事件增加了His37的动力学及其N的氢结合ε到His盒细胞质侧的水分子(36). 溶液核磁共振研究表明，Trp41整体结构的流动性增加，动力学更快速(38). 最后，似乎代表中间和低氢状态的晶体结构表明，该位置的水可接近性显著增加(37).
尽管这些特征现在已经清楚，但重要的机械问题仍然存在。一个是质子如何扩散到希斯盒，另一个是蛋白质如何在如此狭窄的外壳中稳定高电荷。在主要中性状态下，通道的上部由接受Ala30、Gly34羰基的氢键和His37的去质子孤对排列。因此，通道中的水分子缺乏氢键供体基团，并高度极化，将质子带入通道，在动力学和热力学上有利于His37的质子化。随着电荷密度的积累，它被结合到接受Gly34羰基和Trp41富电子环的氢键上的水团簇所稳定。第二个问题是质子如何通过Trp篮从His盒中进入病毒内部。第三个质子从水中转移的机制His团簇取决于第三个粒子是否像航天飞机模型中那样完全转移到His37(35,36,79). 在这个模型中，质子从外部添加到Nδ随后质子释放到病毒内部。环翻转或水介导的互变异构作用重新定位His37上的一个孤孔，以接受来自病毒外部的另一个质子，开始循环过程的另一步。相反，门控通道模型设想的是由水分子链排列的孔隙的开口(80)混合模型包括质子在整个水/His团簇中的快速离域(40). 实验数据有利于在每次翻转过程中质子在His盒/水团簇之间的正式转移，这仍然是当前研究的主题。
药物与渗透离子结合的耦合与大尺度构象变化
在神经脉冲传输的经典模型中，现在主要定义为原子分辨率(81)，TM电势的扰动引起Δ的变化G公司缺口以及“电压传感器”伴随的构象变化，在K上施加机械力+通道内部激活门。该力导致a栅内孔螺旋线发生偏移（强耦合或ΔΔ较大G公司c（c）,)，打开孔隙的下部(). 在此步骤之前，选择性过滤器已经处于导电状态，加载了两个K+离子。因此，A门的打开导致通道从“C，O”快速转换为“O，O”状态（字母分别表示A门和选择性过滤器的状态），从而实现离子传输。然后，通道通过两个其他构象状态自发关闭(8,21–24,26,31,82,83); 管束下端螺旋的开口对选择性过滤器的开放构象产生张力，促使其变形为非导电的开放失活（O，I）C型失活过程中的构象（第二个N型失活流程涉及N末端肽与开放孔的结合，通过阻碍质子运输和促进C型失活性来阻止传播）。作为超极化构象的电压传感器，A门也放松，产生C，I态，这现在促进选择性滤波器的重组，再生通道的静止C，O形式。由于这些转变是动力学和热力学耦合的，失活受到渗透离子和孔隙阻滞剂的高度调节。此外，尽管通过循环的运动是响应电压门控通道的膜极化变化而发生的，但在KcsA通道的情况下，转变是在酸性pH下自发发生的，仅由热能驱动(84,85).
最近，KcsA通道的一种变体在许多不同的构象中结晶，提供了相同通道在不同激活状态下的视图(23,24)以及延长Na的早期结构工作+/K（K）+通道(32). 正如能量耦合所预期的那样，通道下端A栅极的打开会诱导选择性过滤器的非导电（失活）构象，反之亦然（如). 我们使用了一个广义几何模型(86)检查整个10个结构家族中通道螺旋束的构象转变（参见). 根据先前研究的预期，通过代表螺旋弯曲运动的简单运动和代表螺旋相对于管束轴倾斜的“俯仰角”变化，可以将成孔管束描述为小于1°分辨率(28,32). 弯曲度变化高达25°，刚体倾斜高达26°。这些运动发生在平行于管束周长的平面内。枢轴点位于选择性过滤器顶部附近，导致A门附近发生剧烈运动。枢轴点附近更微妙但意义重大的位移破坏了螺旋体对开放选择性过滤器的堆积，促使过滤器的构象改变为失活状态。这一变化涉及侧链网络(29,31)包括Phe103，其向选择性过滤器的Thr75和相邻亚单位的Ile100进行旋转体转移。所有相互作用似乎都是保持Δ大值所必需的G公司缺口，但Phe103似乎有助于将内螺旋束结构的变化转化为选择性过滤器的动力学和热力学稳定性的变化（反之亦然）。事实上，这种耦合在Phe103被小侧链取代的突变体中丢失，哺乳动物通道中同源位置的残基突变也有类似的作用(24). 其他重要的区域包括羧酸-羧酸对，它直接调节Glu71和Asp80之间的选择性过滤器(82,87)以及位于束细胞质末端附近的一块离子残基，其调节开放与闭合构象中内孔螺旋的稳定性(88). 有趣的是，这种转变发生在一个几乎完全合作的过程中，涉及四个亚基的协调运动(27,89).
(a、 b条)M2蛋白通道成孔螺旋结构变化的参数视图和(c、 d日)KcsA通道。通过弓形束参数化（参考文献中概述）描述了成孔螺旋束（M2的残基为25–46，KcsA的残基是86–122；对于后者，一些构造缺少该区域的N末端部分）86). 总共分析了M2[蛋白质数据库（PDB）代码2RLF、3C9J、2KQT、2L0J、3LBW的8个结构，以及从不对称结构3BKD的3个不同螺旋衍生的3个对称结构]，并分析了KcsA的10个结构（PDB代码1R3J、2HVK、3EFF、3F5W、3F7V、3F6Y、3FB5、3FB6、3FB7和3FB8）。通过逐步强制更多的参数对所有结构具有相同的值来确定基本特征。面板一和c（c）通过比较真实主干结构来说明参数表示的准确性(青色)使用理想化模板(绿色)分别针对M2和KcsA的代表线束。数学建模结构的一个优点是它们提供了明确的对齐框架。(b)所有八个M2结构的叠加参数化模型的轴视图和侧视图（对于后者，仅显示了两条相对的螺旋线）清楚地说明了主要的运动模式（用箭头). 这些结构的基本变化参数是螺旋拱的曲率半径、螺旋倾角和管束半径(86)，除了溶液核磁共振结构2RLF可能存在的例外情况外[虽然所有结构仅用这三个参数拟合在1.0？均方根偏差（RMSD）范围内，但2RLF中的第一个模型产生的RMSD为1.66？]。(d日)所有10 KcsA结构的叠加参数化模型的轴视图和侧视图（对于后者，仅显示了两条相对的螺旋线）。这些结构变化的基本参数是螺旋拱的曲率半径和方向以及螺旋节角(86).
KcsA的最近结构及其N端细胞质螺旋完整(33)揭示了一个清晰的四螺旋束，向细胞质投射约70°，证实了早期的定点电子顺磁共振研究(90,91). 这种螺旋束通过稳定通道的闭合形式来稳定蛋白质并调节门控。特别令人感兴趣的是束稳定性和通道选通之间的关系(92,93).
对M2质子通道成孔段的整套晶体、溶液和SSNMR结构进行的类似结构分析显示出类似的运动，尽管螺旋的位移比KcsA中的位移小。轴心点位于线束顶部附近，因此倾斜主要影响C端子端。螺旋线的轻微弯曲（高达12°）往往会导致可变的左手超螺旋，从而最大限度地减少弯曲最严重结构中螺旋线的发散。尽管这些结构是在不同的环境中、不同的pH值和不同的长度结构中解决的，但它们沿着单一的轨迹以连续的方式变化，这表明它们沿着平滑的功能相关的能量景观运动。
随着pH值的降低，结构在C末端附近发生分化，从而导致His37质子化，这是一种普遍趋势。N端的小扩张伴随着C端的扩张。一个潜在的警告是质子化状态并不总是由pH和pK明确定义的一第37页。因此，令人欣慰的是，来自Klein、Cross和Zhou组的分子动力学模拟显示出相同的趋势，因为四个His残基的电荷状态不同(94–96). 此外，溶液和SSNMR研究表明，随着质子化程度的增加，管束的构象流动性和水合作用程度更大(36,97,98). 第二个潜在的警告是，用于晶体结构的胶束环境可能允许比在双层中观察到的更大范围的波动(99). 然而，高分辨率晶体结构是各种结构中最紧密的，结构之间的运动沿着共同的轨迹发生，这表明质子化与TM螺旋的运动紧密耦合。
最后，将M2的运动幅度和时间尺度与KcsA的选通运动进行比较，这是很有趣的。总的来说，M2的构象变化范围小于K+频道。对于M2，在Trp41处测得的通道直径从最紧凑到最宽结构增加了7º，而对于K，相应的变化超过15º+频道。此外，K中构象选通的时间尺度+通道取决于膜环境、pH值和电压(26,31,100)，但在低pH值下，选通转换发生在毫秒时间范围内(84,85). 最后，KcsA在结构上比M2更复杂，不仅在一端有一个膜结合螺旋，在另一端也有一个延伸的螺旋束(33). 相比之下，M2具有短的非结构化N末端片段（在B型流感病毒的相应M2蛋白中完全缺失）和C末端表面螺旋，对通道活性没有明显影响(43).
M2的NMR研究表明，在双层和胶束中，酰胺的共振在接近生理pH时加宽(38,101,102)，表示螺旋运动在与K中的选通相同的微秒到毫秒时间范围内+频道。侧链动力学也显示微秒范围内的运动(36,38,103). 然而，这两种蛋白质之间的一个重要区别是离子通过KcsA的速度更快。在10ms打开期间，大约105离子通过KcsA传导，而M2在同一时间段内大约通过一个质子(69,71). 因此，质子通过M2的传导似乎是在构象波动中发生的，这表明存在一种类似于转运蛋白的机制，在这种机制中，低质子化状态下的N末端开口鼓励外部水的进入，而质子化后的构象变化促进质子释放到病毒内部(37,94,95). 因此，重要的是设计实验，在可以证明通道是传导质子的条件下，测试与质子化/脱质子化相关的动力学变化。
最后，已知烷基铵类药物可以抑制K+通道和M2。由于通道阻滞剂优先结合通道的特定状态，因此它们对各种失活过程的程度和动力学具有显著影响，并直接阻断离子传导途径(104–106). 因此，它们有时被认为是通过构象选择、变构结合或物理闭塞起作用的，但后者是一种戏剧性的直接机制，通过它可以实现完全抑制。四丁基铵（TBA）在KcsA选择性过滤器入口处结合()与金刚烷胺（金刚烷胺类）与M2的结合方式非常相似，M2位于入口水团簇/His盒附近(19). 在这两种情况下，抑制几乎没有电压依赖性，这与药物在其各自的选择性过滤器之前的位置是一致的，在这些过滤器上，电位会急剧衰减(46,104,107). 在KcsA中，TBA取代K+选择性过滤器入口附近的水合物()和药物结合取代M2中His37的质子(46,76).说明了M2通道的SSNMR结构，高分辨率结构中的水分子叠加显示了其近似位置。铵基团位于进入团簇的氢结合距离内，因此结合不仅阻止质子进入中心，而且降低pK一第页，共页(46,76,101). 有趣的是，有可能根据这一分析设计出亲和力更高的药物(108,109).
集成接收器中的内外耦合
整合素是α-β异二聚体粘附受体，介导细胞外环境和细胞内细胞骨架之间的相互作用(110–114)，演示了双向TM信号转导如何通过细胞外、TM和细胞溶质域中的多重耦合平衡进行微调(). 整合素外结构域包含一个大的球状N末端配体结合“头”和不同的C末端α-和β-“腿”，作为单个TM结构域穿过质膜，终止于结合细胞内分子的短细胞质结构域。非活性整合素采用弯曲构象，使头部靠近膜和远端腿。激活后，有利于扩展构象，α-和β-腿、TM和细胞质域分离。
整合素信号传递的热力学模型。(一)在最粗略的水平上，整合素的细胞外、跨膜（TM）和细胞内结构域可以被认为是活性或非活性的，如图所示，产生八种耦合状态。各种效应分子通过优先结合选择结构域构象来调节整合素状态。“内脱”信号是指通过整合素的细胞溶质尾部和细胞内信号分子之间的相互作用调节细胞外结构域的构象。“外-内”事件有时指结合多价配体后寡聚依赖性信号通路的激活。然而，与我们的模型一致，这里指的是细胞外配体影响细胞内结构域的构象和功能的能力。(b)使用与这些状态相关的能量间隙和耦合常数的合理值，以及不同效应分子活性和非活性状态的平衡结合常数，可以粗略、半近似地询问整合素信号的热力学。这里显示的是整合素激活水平（TM/尾部区域的分离），以响应作为Mn函数的激活抗体数量的增加2+浓度。这说明了外部输入信号（激活水平显示在z轴上，也由假彩色指示）。(c、 d日)细胞外结构域与天然配体结合的部分作为不同数量的活性细胞内talin和kindlin的函数，说明了内脱信号。配体的结合亲和力以及talin/kindlin的数量都可以决定整合素的激活状态。
α-和β-链腿、TM和膜近端细胞溶质结构域之间的相互作用稳定了非活性整合素。单点突变可导致受体活化(115–118)，并且膜近端αβ二硫键交联完全消除了任一方向的TM信号转导(119,120). 虽然结构研究表明存在一个独特的TM界面，但膜近端区域是动态的(118,120–123)，适合快速信号转导的需要。
膜附近的α-链和β-链之间的“松散”动态相互作用让位给了细胞外结构域球状部分之间的广泛界面，这可以通过突变来干扰(124). 整个球状外畴都发生热力学耦合。有配体和无配体的结晶导致活性延长(125)和不活动(126,127)构象。用配体浸泡非活性晶体，由于晶体接触限制，仅导致结合位点发生小规模变化，而没有腿延伸(126). 如果没有这些限制，抗整合素药物可以通过激活受体并在整合素腿中生成免疫反应表位或配体诱导的结合位点（LIBS）而产生不利的副作用(114). 小分子药物也可以解偶联亚结构域。竞争域间接触的变构抑制剂产生功能性分裂整合素，其中头部被锁定在非活性构象中，但远端区域产生活性LIBS(127). LIBS抗体也将整合素平衡转移到活性构象。限制整合素C末端可以稳定弯曲构象和非活性配体结合位点，但添加LIBS抗体和Mn会使其稳定2+（第二个变构激活剂）将头部结构域平衡转移到活动状态，尽管存在远端限制(128). LIBS抗体表现出双向性，在不受约束的情况下可诱导TM分离(116). LIBS抗体和第二激活剂Mn的组合2+，进一步增加活化，但Mn2+单独使用对TM分离没有显著影响。因此，就像VirA/VirG的情况一样()，多个刺激被整合以产生不同的细胞内反应（模拟于).
虽然整合素胞质域比胞外域短得多（β-整合素约为5–6 kDa），但它将多种信号整合到细胞外功能。尽管有令人信服的证据表明定义了αIIbβ3TM界面，但膜近端和细胞质域并没有提供一致的结构(118,122,129–132). 最近，为了捕获αIIbβ3非活性构象，在αIIb和β3膜近端结构域之间引入了二硫键交联(133). αIIb细胞质结构域紊乱，但在β3中引起扭结，预计这将稳定两个β3细胞质螺旋与双层的相互作用。值得注意的是，这些动态的膜相互作用螺旋包含了结合进化相关蛋白的talin和kindlin家族的主要基序（参见参考文献113和134).概述了一个简单的链接平衡模型，该模型在，说明了talin和kindlin结合基序之间的耦合如何允许具有不同受体亲和力的配体之间的分化，有效地重述了中间亲和力状态，而无需不同的细胞外构象(128,135).
连接整合素跨膜（TM）相互作用与细胞溶质事件的耦合平衡。整合素αβTM异二聚体(左边)稳定非活性外结构域构象和TM分离(正确的)稳定活跃的外结构域构象。αβ异二聚体稳定了β-细胞质结构域和双层内小叶之间的相互作用（顶部). 细胞质蛋白talin和kindlin通过稳定扩展的细胞质结构域和分离的TM结构域，将平衡转移到活性构象(右下角). 小鼠血小板中talin-1或kindlin-3的缺失会导致出血和几乎完全丧失内外整合素的活化(138,139). 同样，缺乏火种-3的患者分别因αIIbβ3和β2整合素功能的丧失而出现出血和免疫损伤(140–144). 虽然缺乏talin和kindlin-3的血小板在生理上受到损害，但在非常强的激动剂存在下，它们能够部分激活整合素。此外，大量过量的talin可以在缺乏kindlin的情况下激活整合素(145)，kindleins和talin的共表达导致活化显著增加(146,147)而仅仅kindlin的过度表达并不能显著激活整合素。这种平衡可以通过整合素相互作用基序的磷酸化进一步扩大(148,149)或与其他信号分子竞争，如丝氨酸(150,151).
动力学考虑因素
整合素激活过程中涉及的广泛构象变化说明了耦合平衡如何影响受体与受体相互作用的动力学。血小板周围有大量过量的可溶性纤维蛋白原，但它们不会自发激活αIIbβ3，而小分子Arg-Gly-Asp（RGD）配体可以将整合素平衡转移到激活状态。在纯化的整合素中，这种活性状态的寿命约为小时(136)这表明，虽然小分子结合位点是可以动力学地获得的，但弯曲构象对大纤维蛋白原分子来说是不可动力学地得到的。最近的表面等离子共振分析表明，非活性的αIIbβ3在没有小分子配体动态启动的情况下不能结合可溶性纤维蛋白原(137). 即使在其素数状态下，开启速率也相对较慢，且熵不受欢迎，作者将其归因于除中央RGD序列外，αIIbβ3还与无序区域结合。调节单个整合素活化的局部平衡参与由聚合物配体、细胞骨架和机械力驱动的较大单体多聚体平衡(138,139)，也可能在张力下赋予整合素簇独特的动力学性质。
寡聚状态和构象的控制对一系列信号受体至关重要，包括细胞因子和生长因子受体(140,141)，并被认为在微调G蛋白偶联受体信号转导中发挥作用(142). 受体齐聚可以简单地解释为更大平衡中的热力学状态。然而，它也可能通过潜在的动力学解耦联配体诱导的构象状态产生动力学效应，从信号转导到寡聚反应发生。在这种平衡中可以编码不同的信号事件，例如表皮生长因子受体家族的成员，其与单体和预制二聚体的种群平衡(143)并证明变构调控可能允许不同配体产生不同的信号(144).
