CD73蛋白作为持续NAD的细胞外前体来源⁺FK866治疗肿瘤细胞的生物合成^*

天然橡胶的合成

制备NR，25μmol NAD⁺用5个单位的鳄鱼毒液核苷酸焦磷酸酶（Sigma-Aldrich）和40单位小牛肠碱性磷酸酶（Sigma-Aldrich）在37°C的温度下在100 m米Tris/HCl，pH 8.0，含100m米氯化镁₂（最终体积，0.3 ml）。用150μl的1.2停止反应米次氯酸₄在冰上放置15分钟后，以12000×克.用80μl的1米K（K）₂一氧化碳_三，在冰上保持10分钟，并按上述方法离心。将50μl等分上清液加载到Phenomenex C18 Kinetex色谱柱（2.6μm，4.6×150 mm）上。洗脱条件如下：在100%缓冲液A（5 m）下2 min米甲酸铵，pH 3.3），7 min至100%缓冲液B（5 m米甲酸铵，pH 3.3，25%乙腈），在100%缓冲液B中保持1分钟，在1分钟内返回到100%缓冲液A，并在100%缓冲溶液A中保持6分钟。流速保持在0.75 ml/min，温度固定在25°C。将含有NR（保留时间，4分钟）的洗脱液混合、冻干并储存在−20°C下。将冻干样品重新悬浮在水中并进行分光光度定量后，通过5 nmol NR的HPLC分析验证纯度(一₂₅₉= 4305米⁻¹厘米⁻¹).

细胞培养

U87（人类胶质母细胞瘤）、A549（人类肺腺癌）和PC3（人类前列腺癌）细胞取自美国型培养物收集中心（ATCC，Manassas，VA），在添加有10%胎牛血清、青霉素（100单位/ml）和链霉素（100μg/ml）的RPMI 1640中在37°C、5%CO的增湿大气中生长₂.

胞外NAD的测定⁺-或AMP-降解酶活性

CD73和CD38的胞外酶活性通过培养1×10来测定⁶在存在底物AMP或NAD的情况下，将U87和A549完整细胞置于0.6 ml Hanks缓冲盐水溶液中⁺（0.4米米). 在不同的时间（0、1、5、30和120分钟），取出100μl等分培养液并短暂离心，并将2.5%三氯乙酸（TCA）添加到90μl上清液中。对样品进行离心，并用乙醚去除多余的TCA。产生的核苷酸数量通过前面描述的磷酸盐HPLC分析确定(40).

可溶性人重组CD38的酶活性测定

人重组CD38（0.1μg）在37°C和0.25 m的温度下培养米北美⁺、NMN或NR，总体积为0.5 ml（10 m）米三氯化氢，pH 6.5。在不同时间（0、0.5、3和15分钟），取出100μl等分样品，并通过添加5μl 50%（v/v）TCA停止酶反应。没有酶的对照组总是并行处理，以纠正非酶NAM生成。产品ADPR和NAM通过分析磷酸盐HPLC进行分析和定量(40).

细胞外NAD的降解⁺

将U87和A549细胞接种在96个板（5×10）中⁵细胞/孔）。24小时后，取出培养基，并取出含有NAD的新鲜培养基⁺不同浓度（10、3或1μ米)在不同的井中添加。在不同时间（0、10、60和180 min）收集培养基一式三份，并添加高氯酸（PCA）（0.6米，最终浓度）。全国广告部⁺用酶循环试验评估浓度(42).

人CD73和CD38的表达载体

人CD73表达载体的构建(40)和人CD38(43)如前所述执行，然后在pcDNA3.1中克隆。

U87细胞分别与pcDNA3.1/V5-HisTOPO®或pcDNA3.1（空白，对照质粒）、CD73-pcDNA3.1/W5-His TOPO®（CD73质粒）或CD38-pcDNA1.1（CD38质粒）并行转染，使用Nucleofector系统（德国科隆Amaxa）和Cell Line Nucleofector Kit T，程序X-001，遵循制造商的说明。此后，2×10⁵细胞接种在35×10-mm组织培养皿上进行mRNA定量，1×10⁶将细胞接种到60×15-mm的组织培养皿上进行Western blot分析，并将2×10⁵细胞/孔接种在12孔板中，用于测定细胞内NAD⁺水平。所有实验均在转染后24小时进行。

CD73和CD38 siRNA基因沉默

用隐形技术转染A549细胞^TM（TM）靶向人类CD38（寡核苷酸ID HSS107326）和CD73（寡核苷酸IDHSS101578）的RNAi（Invitrogen）。用2μ米按照制造商的说明，使用Cell Line Nucleofector Kit T，程序X-001，使用Nucleofector系统的双重siRNA。作为对照，A549细胞被转染隐形^TM（TM）RNAi阴性对照双链（Invitrogen）。细胞接种如下：2×10⁵细胞置于35×10-mm组织培养皿上进行mRNA定量；1 × 10⁶细胞置于60×15-mm组织培养皿上进行Western blot分析；2 × 10⁵用于测定细胞内NAD的12孔板中的细胞/孔⁺水平；5 × 10^三细胞/孔置于96周板中，用于活性分析。所有实验均在转染后24小时进行。

qPCR分析

转染24小时后，使用RNeasy Micro Plus试剂盒（Qiagen，Milan，Italy）从U87和A549细胞中提取总RNA；从用CD38或CD73质粒转染的细胞中提取的总RNA根据制造商的说明书用不含RNase的DNase组（Qiagen）进一步处理，以排除任何可能的质粒污染。使用NanoDrop分光光度计（Nanodrot Technologies，威明顿，DE）分析RNA的质量和数量。使用iScript cDNA合成试剂盒（Bio-Rad）合成cDNA（0.5μg）。利用Beacon Designer 2.0版软件（Bio-Read）设计PCR引物，序列如下：人CD73，5′-GCTTCTCACCAAG-3′（正向）和5′-TCAGTCCTCCACACCATTAT-3′（反向）；人CD38，5′-GGACACGCTGCTAGGCTACCTACCT-3′（正向）和5′-CATCACATGGACCACAGG-3′（反向）；人GAPDH，5′-CCTGTCGACAGTCAGCG-3′（正向）和5′-CGACCAAATCCGTACTCC-3′（反向）；人类HPRT1，5′-GGTCAGGCAGTATAATCAAAG-3′（正向）和5′-TTCTATAGTCAAGCATCC-3′（反向）。

qPCR的统计分析是使用iQ5光学系统软件2.0版（Bio-Read）基于2^−ΔΔC类_t吨方法，该方法计算目标基因表达的相对变化，并将其归一化为GAPDH公司和HPRT1型。实验重复三次，一式三份。

Western Blot分析

转染后24小时，用冷PBS洗涤细胞，收集细胞，并以700×克在冷裂解缓冲液（50 m）中裂解细胞颗粒10 min米三氯化氢，150 m米NaCl和1%Nonide P-40，pH 7.4），含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂混合物。总蛋白浓度通过Bradford方法（Bio-Rad）测定。将等量的裂解蛋白（20μg/样品）重新悬浮在含有10%β-巯基乙醇的SDS样品缓冲液中，加载到SDS 10%聚丙烯酰胺凝胶上，然后电泳分离并转移到免疫块PVDF膜（Bio-Rad）。在室温下用5%脱脂奶粉在PBS中封闭膜1小时，并用以下抗体进行可视化：抗CD73（Sc130006，Santa Cruz Biotechnology，Inc.，Dallas TX）、抗V5表位（Invitrogen）、抗CD38（C-1586，Sigma-Aldrich）、抗γ-微管蛋白（Cell Signaling Technology，Danvers，MA）、，和抗β-肌动蛋白（圣克鲁斯生物技术）。次要抗体是辣根过氧化物酶偶联物（GE Healthcare）。根据制造商的说明，使用ECL-PLUS试剂盒（GE Healthcare）开发了蛋白质印迹。使用Chemi-Doc系统和Quantity One软件包（Bio-Read）进行带检测和密度测定。

细胞内NAD的测定⁺水平

U87、A549和PC3细胞以2×10的密度进行电镀⁵细胞/孔置于12孔板中，并在500μl完整RPMI 1640中培养，有或无30 n米FK866和，根据实验设置，每天补充两次（上午9点和下午6点），持续3天，添加或不添加10μ米北美⁺、NMN或NR。然后收集细胞并在0.1 ml 0.6米4°C时的PCA。细胞提取物在16000×克，收集上清液，并在100 m内将等分样品稀释200倍米pH 8.0的磷酸钠缓冲液，用于NAD的测定⁺内容，如所述(42). 北美⁺这些值被归一化为蛋白质浓度，由Bradford分析测定。

细胞活性测定

确定EC₅₀NAD值⁺在拯救FK866诱导的细胞死亡、U87、A549和PC3细胞（5×10⁵/96孔板中的孔）与30n孵育米FK866，并用不同浓度的NAD每天补充（或不补充）两次（上午9点和下午6点），持续3天⁺（范围为0至20μ米). 在其他实验设置中，5×10⁵在存在或不存在30 n的情况下，将U87或A549细胞/孔镀在96 well板中米FK866，有或没有1m米辛醇，10μ米间隙26，10μ米加扰Gap26或1μ米5′-（α，β-亚甲基）二磷酸腺苷（APCP），每天补充两次（上午9点和下午6点），持续3天，添加或不添加10μ米北美⁺、NMN、NR、NAM、AMP、ADPR或腺苷或其组合。如前所述测量细胞活力(44).

细胞外NAD的降解⁺

细胞外NAD⁺在用于评估生存能力的相同实验条件下添加，浓度能够使细胞从FK866诱导的死亡中解救出来，被A549和U87细胞迅速降解(图2一). 试图确定NAD产生的主要产品⁺通过完整的A549和U87细胞，我们在0.4 m米北美⁺，并用HPLC分析上清液。A549细胞转化NAD⁺以2.11 nmol/min/mg蛋白质的速率合成ADPR，而未检测到AMP的生成。相反，U87细胞主要转化NAD⁺AMP（0.22 nmol/min/mg蛋白质）和ADPR（0.07 nmol/min蛋白质）(表1). 在哺乳动物细胞中，NAD⁺多功能胞外酶CD38催化ADPR和NAM的转化，其具有高NAD⁺-糖水解酶活性(48). qPCR分析表明，CD38的mRNA在U87细胞中几乎检测不到，而在A549细胞中则存在，与较高的NAD一致⁺-这些细胞的糖水解酶活性。北美⁺转化为AMP是由于细胞外核苷酸焦磷酸酶催化NMN和AMP的生成(49). 最近，人类重组CD73，一种对AMP具有活性的5′-核苷酸酶(50)，据报道可降解NAD⁺至NMN和AMP，以及脱磷酸NMN以生成NR(40). 为了评估CD73胞外酶活性，将AMP添加到完整的细胞中；A549细胞中腺苷的产生高于U87细胞(表1). qPCR分析显示，A549细胞中CD73 mRNA的表达比U87细胞中高60%。用抗CD73抗体对细胞裂解物进行的Western blot分析显示，A549中的条带强度是U87细胞的6倍（未显示）。

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图2。

NMN和NR可防止FK866诱导的细胞死亡。 一将U87和A549细胞接种在96个板（5×10）中^三细胞/孔），并在含有NAD的完整培养基中培养⁺不同浓度（10、3或1μ米). 在指定的时间，收集培养基一式三份，并添加PCA（0.6米最终浓度）。细胞外NAD⁺用酶循环测定法评估不同时间的浓度。结果是三个不同实验的平均值（为了清晰起见，未显示S.D.）。U87电池(B类)或A549电池(C类)在96个板（5×10）中播种^三细胞/孔），并在有或无30 n培养72 h后通过SBC评估细胞活力米FK866和带或不带10μ米NAD浓度⁺、AMP、NMN、AMP和NMN、ADPR、NAM、ADPR和NAM、腺苷、NR或腺苷和NR。结果表示为与未处理细胞相比的细胞生长百分比。数据表示为平均值±S.D(误差线) (n个= 3). §,第页< 0.001; °,第页在没有其他补充物的情况下，与FK866处理的细胞相比<0.001；†，第页与FK866+NAD相比<0.001⁺-处理过的细胞。D类、A549和U87电池（2×10⁵12孔板中的细胞/孔）处理72h，有或没有30n米FK866是否存在10μ米NMN或NR（每天添加两次）。收集细胞并在0.6米PCA和NAD⁺测定中和提取物中的含量。北美⁺这些值根据蛋白质含量进行了标准化。数据表示为平均值±S.D(n个=4和n个=A549和U87单元分别为3）。#，第页< 0.01; °,第页与相应的对照细胞相比，<0.001；§,第页< 0.0001; †,第页与相应的FK866处理细胞相比，<0.001。插入，细胞内NAD⁺经30 n处理的A549和U87中的含量米FK866和10μ米NMN或NR。

补充NAD的事实⁺_{e（电子）}将FK866处理过的细胞从死亡中拯救出来，并且这些细胞上的胞外酶会快速降解NAD⁺_{e（电子）}提出了这些降解产物在NAD中的可能作用⁺_{e（电子）}-救援能力。识别NAD⁺能够逆转FK866诱导毒性的代谢物，U87(图2B类)和A549(图2C类)细胞在AMP、NMN或两者的存在下培养；使用ADPR、NAM或两者；或与NR、腺苷或两者同时使用。所有这些核苷酸或其配对组合每天添加两次，每次10μ米最终浓度，如NAD实验中的浓度⁺补充。如所示图2,B类和C类，在没有FK866的情况下，这些组合都不影响细胞活力(白色条). 正如预期的那样，添加微摩尔浓度的NAM对FK866诱导的细胞死亡没有任何预防作用(图2,B类和C类). 同样，含有腺嘌呤的AMP、ADPR或腺苷也不能阻止FK866诱导的细胞死亡。相反，NMN和NR几乎完全挽救了U87细胞，同时存在AMP或腺苷并没有增强其作用(图2,B类和C类). 在细胞外NMN或NR存在的情况下，也观察到A549细胞从FK866诱导的死亡中拯救出来，尽管程度较低，但NR更有效(图2C类). 在NMN或NR存在下获得的细胞存活率结果与不同的细胞内NAD非常一致⁺在两种NAD中任何一种存在的情况下，用FK866处理的U87和A549细胞的含量⁺前驱体；事实上，细胞外NMN或NR补充可恢复细胞内NAD⁺U87中的内容，而[NAD⁺]_我两个NAD仅略微增强，但仍显著增强⁺A549中的前体(图2D类). 与较高的细胞活力一致，[NAD⁺]_我与NMN相比，细胞外NR的增加幅度更大(图2D类).

CD38和CD73在生成胞外NAD前体中的作用⁺合成

我们推断不同的EC₅₀细胞外NAD值⁺与U87细胞相比，在对抗FK866诱导的A549细胞死亡中，可能是由于这些细胞系中细胞外CD38和CD73的表达不同。北美⁺CD38的裂解会导致NAM的产生，而NAD对NAM无效⁺用FK866处理的细胞中的前体。NMN在拯救A549细胞方面不如NR有效，这也可以解释为NMN是CD38的底物，导致产生NAM(38). 我们通过测量人类重组CD38对NMN的降解来证实这一特性(表2). 相反，NR是CD38酶活性较差的底物(表2).

为了剖析CD38在NAD细胞外生成中的作用⁺代谢物，可被细胞用作NAD⁺前体，CD38表达被siRNA特异性沉默。qPCR和Western blot分析证实CD38表达在转染CD38 siRNA的A549细胞中几乎完全消失(图3一,插入). 【北美地区】⁺]_我在CD38样细胞中显著减少，与先前证明NAD调节的研究一致⁺CD38表达水平(43). 用FK866处理（或不处理）CD38沉默细胞，外源性NMN对[NAD的影响⁺]_我与在存在阴性对照siRNA的情况下转染的对照细胞进行比较。细胞内NAD的补充⁺在对照组和经FK866处理的细胞类型中，外源性NMN对CD38样细胞的作用显著增强(图3一). 接下来，通过转染CD38-pcDNA3.1质粒，CD38在U87细胞中过度表达。作为对照，细胞在空质粒存在下转染。如所示图3B类，NMN介导的FK866诱导的[NAD减少的补救⁺]_我在CD38过度表达的U87细胞中几乎完全消除。这些结果表明，CD38对细胞外NMN的降解阻止了其作为NAD的利用⁺前体，因为在FK866处理的细胞中NAM不能转化为NMN。

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图3。

CD38表达影响细胞内NAD⁺由细胞外NMN触发的合成。 一用CD38特异性siRNA或阴性对照siRNA（siRNA对照）转染A549细胞，接种于12孔板（2×10⁵细胞/孔）。用或不用30 n处理细胞72 h米FK866是否存在10μ米NMN（每天添加两次）。收集细胞并在0.6米PCA和NAD⁺测定中和提取物中的含量。北美⁺将值归一化为蛋白质含量。数据表示为平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页< 0.05; #,第页与未经处理的siRNA对照细胞相比<0.01；†，第页与未经处理的siRNA CD38细胞相比<0.01；°,第页与FK866处理的细胞相比<0.001；§,第页与FK866+NMN处理的siRNA对照细胞相比，<0.001。插入转染后24小时；一，进行qPCR分析，并对参考基因的结果进行标准化GAPDH公司和HPRT1型与阴性对照组比较；b条，对CD38蛋白水平进行Western blot分析（显示了一个代表性实验的结果）。B类使用Nucleofector系统将U87细胞与pcDNA3.1（空质粒）或CD38-pcDNA 3.1（CD38质粒）并行转染，并接种在12孔板（2×10⁵细胞/孔）。然后用或不用30 n处理细胞72 h米FK866是否存在10μ米NMN（每天添加两次）。收获细胞并在0.6中裂解米PCA和NAD⁺测定中和提取物中的含量。北美⁺将值归一化为蛋白质含量。数据表示为平均值±S.D(n个= 3). *,第页< 0.05; #,第页与未经处理的空质粒细胞相比，<0.01；§,第页与FK866处理的空质粒细胞和FK866+NMN处理的CD38质粒细胞相比，<0.001。插入转染后24 h，对CD38蛋白水平进行Western blot分析（显示了三个可比实验中的一个代表性实验）。

我们还研究了NAD的细胞外转化⁺通过CD73将NMN转换为NR(40)可以促进NAD⁺生物合成。事实上，细胞外NR可以穿过质膜，被哺乳动物细胞中的NR激酶磷酸化，生成细胞内NMN，最终生成NAD⁺(32). CD73沉默受损NMN作为NAD的使用⁺FK866处理的A549细胞中的前体(图4一). 相反，当CD73过度表达时，NMN诱导NAD⁺FK866处理细胞的合成明显高于转染空质粒的细胞(图4B类). 总之，这些结果表明细胞外NMN转化为细胞内NAD⁺受到CD38的损害，而受到CD73的青睐。

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图4。

CD73表达影响细胞内NAD⁺由细胞外NMN触发的合成。 一用CD73特异性siRNA或阴性对照（siRNA对照）转染A549细胞，接种于12孔板（2×10⁵细胞/孔）。用或不用30 n处理细胞72 h米FK866是否存在10μ米NMN（每天添加两次）。收集细胞并在0.6米PCA和NAD⁺测定中和提取物中的含量。北美⁺将值归一化为蛋白质含量。数据表示为平均值±S.D(误差线) (n个= 3). *,第页与未经处理的siRNA对照细胞相比<0.05；#，第页与FK866处理的siRNA对照细胞和FK866+NMN处理的siRNA-CD73细胞相比，<0.01。插入转染后24小时；一，进行qPCR分析，并将CD73的表达标准化为持家基因的表达GAPDH公司和HPRT1型并与阴性对照组进行比较；b条，对CD73蛋白水平进行了Western blot分析（显示了一个代表性实验的结果）。B类，使用Nucleofector系统将U87细胞与pcDNA3.1/V5-HisTOPO®（空质粒）或CD73-pcDNA3.1/V5-His TOPO™（CD73质粒）并行转染，并接种在12孔板（2×10⁵细胞/孔）。然后用或不用30 n处理细胞72 h米FK866是否存在10μ米NMN（每天添加两次）。收集细胞并在0.6米在中和提取物中测量PCA和NAD含量。北美⁺将值归一化为蛋白质含量。数据表示为平均值±S.D(n个= 3). *,第页与未经处理的空质粒细胞相比<0.05；†，第页与未经处理的CD73质粒细胞相比<0.05；§,第页与FK866处理的空质粒细胞相比<0.0001；#，第页与FK866+NMN处理的空质粒细胞相比，<0.01。插入转染后24小时；一对转染细胞进行总RNA提取，并对CD73进行qPCR分析。结果根据参考基因进行标准化GAPDH公司和HPRT1型并与空质粒进行比较；b条，使用针对V5表位的单克隆抗体对细胞裂解物进行Western blot分析（显示了三个代表性实验中的一个）。