试剂
4-硝基蓝四唑氯化物（NBT，Roche，目录号1087479）。
5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP，罗氏，目录号1585002）。
无水甲醇（Fisher Scientific，目录号M-4000-PC17）！小心。它对眼睛和皮肤有刺激性。吸入、皮肤接触和吞食有各种严重不可逆影响的危险。酌情穿戴护目镜、衣服和手套。
琼脂糖（例如来自BDH Electran，产品目录号438792U）。
二氨基联苯胺和尿素过氧化氢片（Sigma-Aldrich，目录号D4293-50SET）。
甘油（Acros Organics，目录号AC15892-2500）。
热灭活正常山羊血清（NGS，Sigma-Aldrich，目录号G9023）。
热灭活正常兔血清（NRS，Sigma-Aldrich，目录号R9133）。
过氧化氢（Sigma-Aldrich，目录号H1009）！小心。如果摄入，会对眼睛造成严重伤害。酌情穿戴护目镜、衣服和手套。氯化镁1 M（Sigma，分类号M1028）。
多聚甲醛（PFA，Sigma-Aldrich，目录号P6148）！小心。吸入和吞咽有害。对眼睛、呼吸系统和皮肤有刺激性。接触后可能导致皮肤过敏。酌情穿戴护目镜、衣服和手套。在通风柜中使用。
磷酸盐缓冲盐水片（PBS，Sigma-Aldrich，目录号P4417）。
现成的无血清蛋白块溶液（Dako，目录号X0909）。
SlowFade Antifade试剂盒（Life Technologies，产品目录号S2828）。
氯化钠（Sigma，目录号S3014）
Triton®声波风廓线仪X100（Sigma-Aldrich，产品目录号T8787）！小心。如果摄入，会对眼睛造成严重伤害。酌情穿戴护目镜、衣服和手套。
三（羟甲基）氨基甲烷（Tris，VWR，目录号443864E）
AlexaFluor488-共轭山羊抗鼠二级抗体（Life Technologies，目录号A11006）。关键步骤：该协议已使用该荧光团进行了优化，但可以选择其他荧光团）。
AlexaFluor488-共轭链霉亲和素（Life Technologies，目录号S32354）。关键步骤：该协议已使用该荧光团进行了优化，但可以选择另一种链亲和素共轭荧光团。
生物素化凝集素单叶斑潜蝇BS-I隔离素B4（IB4；Sigma，分类号L2140）。关键步骤：该方案已针对该凝集素进行了优化，因此建议使用。
HRP标记的兔抗大鼠第二抗体（Dako，猫号P045）。
HRP标记的链霉亲和素（Dako，目录号P0397）。
大鼠抗鼠PECAM单克隆抗体（CD31，MEC13.3；BD Pharmingen，目录号553370）。关键步骤：该方案已针对该抗体进行了优化，因此建议使用。
可能需要额外的一级和二级抗体来标记巨噬细胞、平滑肌细胞、毛细血管和静脉内皮、血管基膜、周细胞、有丝分裂细胞或VEGF-A受体。请参见和了解详细信息。
怀孕的大坝。任何可育鼠种的成年雄性和雌性小鼠都可以配对以获得怀孕的母鼠。对于定时交配，小鼠在晚上交配，阴道堵塞形成的早晨计算为交配后0.5天（dpc）！警告：必须遵守有关啮齿动物使用的机构和政府道德规范。
DMEM（生命科技，目录号31966-021）。
FBS（生命科技，目录号10437-028）。
Lipofectamine（生命技术，目录号18324012）。
ddH（日/小时）2O。
质粒DNA。
设备
2.0 ml圆底试剂管（安全锁；例如Eppendorf，目录号022363352）。
24孔细胞培养板（例如BD Falcon，目录号353047）。
50 ml猎鹰管（例如BD falcon，目录号352098）。
台式管辊（例如Stuart SRT9、Stuart）。
共焦激光扫描显微镜（例如蔡司LSM710、蔡司）。
数据采集软件（例如OpenLab 3.5.1，Improvision Ltd.）。
一次性塑料模具（例如电子显微镜科学，目录号62352）。
配备数码相机（如哈马松C4742-95-12HR）的表观荧光立体显微镜（如奥林巴斯、SZX16）。
玻璃瓶（例如Schott Duran）。
玻璃盖玻片（22×55mm；VWR国际，目录号631-0137）。
玻璃载玻片（VWR国际，目录号631-0111）。
鹅颈灯（例如冷光源KL 2500 LCD、Schott）。
图像编辑器软件（例如Photoshop CS3、Adobe Inc.）。
塑料细胞培养皿（直径60 mm；例如BD Falcon，目录号353002）。
塑料巴斯德吸管（例如，来自Alpha Laboratories，目录号LW4003）。
配备数码相机（例如QImaging Micropublisher 3.3 RTV）的立体显微镜（例如Leica MZ16、Leica）。
台式天平（例如ED精密天平、Sartorius）。
振动器（例如，振动器1000Plus剖切系统，Intracel）。
5号钟表钳（例如来自Dumont，目录号91150-20）。
55号钟表钳（例如，来自Dumont，目录号11255-20）。
水浴（例如Stuart SWB15D、Stuart）。
试剂设置
阻隔缓冲液（10%，vol/vol）：对于1 ml，混合100μl含900的血清μl的PBT。为每个免疫染色实验准备新鲜的。
显影缓冲液
将6 g Tris碱溶于50 ml ddH中2O并调节至pH 9.5，以产生1 M Tris缓冲液。在10 ml ddH中溶解2.9 g氯化钠2O生成5 M氯化钠。将1 ml 1 M Tris缓冲液与200μl 5 M氯化钠和50μl 1 M氯化镁混合。添加ddH20至10 ml。在室温（21°C）下无限期储存。展开液：向1ml展开缓冲液中加入3.5μl NBT和3.5μl BCIP。防止光线照射。为每个实验准备新鲜食物。
DAB解决方案
将1片DAB溶于5 ml ddH中2室温下，在工作台顶部滚轮上为O。将药片量调整到所需的最终体积。防止光线照射。为每个免疫染色实验准备新鲜的。
DAB和尿素/过氧化氢溶液
将1片DAB和1片尿素过氧化氢片溶解在5 ml ddH中2室温下，在工作台顶部滚轮上为O。避光。为每个免疫染色实验准备新鲜的。
甲醛溶液（4%，wt/vol）
在化学通风橱下，称取2 g PFA到50 ml Falcon管中，并添加50 ml PBS。在水浴中将溶液加热至60°C，溶解PFA，频繁搅拌，直到PFA粉末溶解。在−20°C的温度下将其等分储存一年。在室温或37°C水浴中解冻，并在使用前在冰中冷却。
甲醇梯度
为了在PBT中制备50 ml 25%、50%或75%的甲醇，将12.5、25或37.5 ml的无水甲醇与37.5、25或12.5 ml的PBT在50 ml Falcon管中混合。在室温下无限期储存。
美国公共广播电视公司
将5片PBS溶于1 l ddH中20.在室温下无限期保存。关键步骤：使用PBS进行非渗透性组织染色，例如用于细胞外表位而非细胞质表位的可视化。
PBT公司
在50 ml Falcon试管中添加50μl Triton X-100至50 ml PBS；在室温下无限期储存。关键步骤：使用PBT渗透组织，检测细胞表面和细胞质表位。
AP融合蛋白的表达
编码分泌型AP的表达载体可从各种来源（例如pAPtag-4、GenHunter Corporation或APTag-124). 为了生成融合蛋白，将HEK-293T细胞在生长介质（含10%（vol/vol）FBS和抗生素的高糖DMEM）中的10-cm培养皿中培养至80%融合，并转染细胞，如下所示：培养25μl脂蛋白和10μg质粒DNA和两个分开的500-μ1份预热的无抗菌素血清DMEM，在室温下放置15分钟。接下来，将脂多糖和DNA溶液混合，在室温下培养15分钟；接下来，从HEK-293T细胞中取出培养基，并以滴状方式向细胞中添加脂质体/DNA溶液。添加4 ml预热的无血清和抗生素DMEM，并将细胞置于37°C 5%CO2腐殖培养箱中6小时；接下来，用预热的生长培养基替换培养基，并将细胞放回培养箱中42小时。最后，收集上清液并通过0.22-μm过滤器去除脱落的细胞；将上清液分成小份，并将其储存在−80°C的温度下。此过程需要约2天的时间。已发布替代方法24.
设备设置
塑料巴斯德吸管
用于在盘子之间转移胚胎和后脑：用干净的手术刀或剪刀剪掉尖端，形成一个大小合适的开口。或者，将移液管的球茎切成薄片，形成适合移植大胚胎的匙形开口。
台式管滚轮
应放置在冷藏室或冷藏柜中，因为抗体培养应在4°C下轻轻滚动的试管中进行。
程序
胚胎分离：每个胚胎计时~5分钟
1在规定的胎龄，以人道的方式杀死怀孕的母体（例如颈椎脱位）！小心。动物程序必须按照相关机构和政府道德准则执行。
2通过在腹部皮肤和隔膜上切割V形切口来解剖子宫。用产钳将子宫角从体腔中拔出，切断产道、脂肪组织和两根输卵管。将子宫角转移到一个装有冰冷PBS的干净塑料盘中。
三在解剖立体显微镜下，用镊子将子宫角周围的肌层断裂，从而将每个胚囊取出。这可以在将子宫切成含有单个胚胎的碎片后进行，也可以通过从完整的子宫角上一个接一个地取出胚胎来完成(补充视频1和2).
4破裂每个胚囊直到胚胎出现，切断脐带，用塑料巴斯德吸管将胚胎收集到带有干净PBS的盘子中，然后将盘子放在冰上(补充视频1和2). 关键步骤。将胚胎浸入PBS中执行此步骤，以防止表面张力使胚胎破裂。这与10.5-11.5 dpc的胚胎解剖特别相关。
5用塑料巴斯德吸管一次将一个胚胎转移到含有冰镇PBS的新鲜盘子中进行后脑解剖。如果实验需要对幼崽进行基因分型，保留一片胚胎尾部或卵黄囊组织用于基因组DNA分离。
后脑疾病：每后脑约5分钟
6用镊子挤压，切断前肢上方的头部(，第1行；图S2a)并取下头部和面部的前部(，第2行；图S2b).
7用锋利的镊子轻轻拉动，使覆盖在后脑第四脑室水平的薄而半透明的顶板破裂(,图S2c和补充视频1和2). 继续向中脑方向撕裂膜(，小箭头；图S2d，e)然后朝向脊髓打开后脑(，弯曲箭头；图S2f；补充视频1和2). 现在在解剖立体显微镜下可以清楚地看到后脑组织。关键步骤。不要将镊子插入太深，因为这可能会损坏后脑组织。
8从后脑下面剥下软脑膜(;图S2g、h和补充视频1和2); 从E12.5开始，打开屋顶板后，它很容易脱落，在早期阶段，这是一个到处拉扯的问题，就像剥桔子一样-一些地区比其他地区更容易让路。
9移除中脑和脊髓，让后脑展开(分别为第6行和第7行；图S2i，j). 转移分离的后脑(,图S2k，l)将塑料巴斯德吸管平放在一个放置在冰上的24孔板中的一个孔的底部。关键步骤。不要让胚胎脱水。将胚胎保存在PBS中，直到在步骤10中添加固定剂，或者省略步骤10-13C并继续步骤13D进行AP融合蛋白结合分析。
固定：计时2小时
10去除PBS并向后脑添加4%的冷甲醛。关键步骤。对于本方案中提到的所有抗体(,)新鲜制备或解冻的甲醛固定剂是一种合适的固定剂。其他抗体可能需要另一种固定方案。
11在冰上轻轻搅拌固定2小时，在PBS中漂洗三次，然后继续染色方案。关键步骤：对于PECAM染色，最好对刚固定的组织进行染色，避免固定时间超过2小时或甲醇储存。如果固定后不能立即开始染色，则可以在第二天染色之前将样品在4°C的PBS中储存过夜。暂停点。或者，通过升高的甲醇梯度转移，在−20°C下储存最多3个月（梯度：PBS中25%、50%和75%的无水甲醇，然后是无水甲醇）。
染色程序：计时3天
12对于储存在甲醇中的组织，通过降低甲醇梯度转移（PBT中75%、50%和25%的无水甲醇，然后单独使用PBT）。
13将后脑放在2.0毫升圆底安全锁管中，准备好进行荧光或组织化学标记。按照选项A进行PECAM和/或IB4荧光染色。按照选项B进行PECAM或IB4组织化学染色。方框1中给出了使用替代抗体的指南。按照选项C进行振动切片，按照选项D进行全山AP融合蛋白结合。关键步骤。为了保存抗体并标准化不同样本之间的抗体暴露，以比较染色强度，可以标记单个后脑，以在形态学上区分它们，然后将它们合并到一个管中（例如，中脑或脊髓或两者均可附着；建议每个管子最多有4个带标签的后脑）。
PECAM和/或IB4荧光染色TIMING 3d在室温下轻轻滚动，在封闭溶液中培养30分钟。对于PECAM标记，使用PBT中10%（vol/vol）的正常山羊血清作为封闭溶液。对于生物素化IB4标记，使用在PBT中的10%（vol/vol）正常山羊或兔子血清作为封闭溶液。
在4°C下用含有一级抗体（大鼠抗鼠PECAM，稀释1:200或生物素化IB4，稀释1:2000）的封闭溶液轻轻滚动培养过夜。
在室温下用PBT彻底清洗后脑五次，每次15-30分钟。
在4°C下用含有二级抗体的封闭溶液（稀释1:200）轻轻滚动培养过夜。对于PECAM检测，使用AlexaFluor488标记的山羊抗鼠抗体。对于生物素化IB4检测，使用AlexaFluor488标记的链霉亲和素。
按照步骤13A iii.清洗后脑。
室温下，在4%（wt/vol）甲醛溶液中固化30分钟。暂停点。在此阶段，可以对样品进行成像处理，也可以在成像前在4°C的PBS中存储最多一周（见下文）。
PECAM或IB4组织化学染色：TIMING 3d通过在PBS中的1%（vol/vol）过氧化氢中培养30分钟，在室温下轻轻滚动，消除内源性过氧化物酶活性。
在PBT中清洗样品两次，每次5分钟。
在室温下，在封闭溶液中缓慢滚动培养30分钟。对于PECAM，使用PBT中10%（vol/vol）的正常兔血清作为封闭溶液。对于生物素化的IB4，使用在PBT中的10%（vol/vol）正常山羊或兔子血清作为封闭溶液。
在4°C下，在含有一级抗体的封闭溶液中培养过夜（大鼠抗鼠PECAM，稀释1:200或生物素化IB4，稀释1:2000）。
在室温下用PBT彻底清洗后脑五次，每次15-30分钟。
在4°C下用含有二级抗体的封闭溶液（稀释1:200）轻轻滚动培养过夜。对于PECAM检测，使用HRP标记的兔抗鼠抗体。对于生物素化IB4检测，使用HRP标记的链霉亲和素。
按照步骤13B v清洗后脑。
在室温下将后脑在二氨基联苯胺溶液中培养10分钟（轻轻滚动），然后在二氨基联苯胺和尿素/过氧化氢溶液中培养5分钟，或直到颜色形成。小心。样品需要避光，因为二氨基联苯胺和尿素/过氧化氢溶液是感光的。关键步骤。为了避免反应过度发展，应定期在立体显微镜下观察样品？故障排除
为了停止反应，用ddH短暂清洗后脑2O，然后PBS，在室温下在4%（wt/vol）甲醛中固定30分钟。暂停点。在此阶段，可以对样品进行成像处理，也可以在4°C下将其储存在PBS中，直至成像（见下文）。
染色后振动分段：每个后脑30分钟计时将3 g琼脂糖放入100 ml ddH中20在玻璃瓶中，在微波炉或沸水浴中熔化。让其冷却，例如在60°C的烘箱中
将后脑放在方形塑料模具中，用吸管吸出附着在后脑外部的多余液体，然后用纸巾轻轻吸干。
当融化的琼脂糖冷却到足以接触玻璃时，将其倒入模具中，并在琼脂糖开始凝固之前快速定位后脑。
琼脂糖凝固后，从模具中取出含有后脑的琼脂糖块（可以重新使用），并用振动棒切割80-100μm的横截面？故障排除
AP融合蛋白结合测定：时间2天将后脑在10%（vol/vol）FBS中的PBS中培养30分钟，在4°C下轻轻滚动。关键步骤。在评估涉及语义蛋白的蛋白质相互作用时，必须向PBS中添加最终浓度为4 mM的氯化镁？故障排除
在4°C条件培养基中培养后脑，培养基中含有融合蛋白。关键步骤。将一只后脑与含有AP蛋白的条件培养基一起孵育，AP蛋白不与任何其他蛋白融合，作为阴性对照。
在室温下，在PBS中彻底清洗后脑三次，每次15分钟？故障排除
在4°C下，轻轻搅拌，在4%（wt/vol）甲醛中固定1小时。关键步骤。不要过量加注。长时间固定可能会降低AP酶活性。
在室温下用PBT彻底清洗后脑两次，每次15分钟。
将后脑在65°C的PBS中培养3小时，以灭活内源性碱性磷酸酶。
在培养液中培养后脑10分钟。
通过在室温下将后脑在显影溶液中孵育15分钟，或直到变色，来检测组织结合的热稳定重组AP活性。小心！样品需要避光，因为显影液中的NBT和BCIP是感光的。关键步骤。为了避免反应过度发展，应定期在立体显微镜下观察样品？故障排除
为了停止反应，用ddH短暂清洗后脑2O，然后PBS，在室温下在4%甲醛中固定30分钟。暂停点。在此阶段，可以对样品进行成像处理（见下文），也可以将其储存在4°C的PBS中，直至成像。
成像：时间可变，每个后脑0.5-1小时
14如选项A所述，对全身标记HRP或AP的后脑进行荧光成像。按照选项B对振动部分进行成像。
荧光标记的后脑。将两层黑色电工胶带粘在玻璃滑板上，然后切下矩形口袋，形成一个间隔。用SlowFade试剂将每个后脑平放在一个口袋里，并用玻璃盖玻片盖住。
用荧光立体显微镜或共焦扫描激光显微镜对后脑进行成像。
HRP或AP标记的后脑将每个后脑分别放入一个空的塑料盘（直径60毫米）中，取出多余的液体，并用玻璃盖玻片盖住。或者，如果将后脑放在琼脂糖盘上的一个孔中，可以将其轻轻压扁（这个孔是用吸管尖舀出一点琼脂糖而形成的）。当玻璃盖玻片被轻轻推下以压平后脑时，这可以防止组织撕裂。
用配备合适相机的标准立体显微镜对后脑进行成像。请注意，在拍摄图像之前，可能有必要弄湿盖玻片，以清除灰尘并使后脑适当平坦。
对振动部分进行成像。将切片安装在PBS中90%（vol/vol）甘油的玻璃载玻片上，用于HRP标记样品，或用于荧光标记样品的SlowFade试剂，并用玻璃盖玻片覆盖？故障排除
方框1：替代免疫染色方案：时间与单一染色程序相同（3天）
使用来自不同物种的初级抗体或抗体与IB4（例如IB4和F4/80双重染色，如). 对于此类实验，将一级抗体或IB4和一级抗体一起应用于封闭溶液中；清洗后，将二级抗体（如果是IB4，则使用链霉亲和素）一起涂抹在封闭溶液中。上文使用的抗体以及适用于标记巨噬细胞、平滑肌细胞或毛细血管和静脉内皮细胞的单克隆抗体的一些进一步示例在可用于标记血管基底膜、周细胞、有丝分裂细胞和VEGF-A受体NRP1和VEGFR2的多克隆抗体的单独列表可在然而，多克隆抗体可能表现出分批特异性变化，需要用户测试其适用性。
为了阻止非特异性抗体结合，染色方案通常包括与一级和二级抗体兼容的血清，即来自与二级抗体产生的物种相同的血清。相反，对于包括山羊体内初级抗体的染色方案，我们建议使用无血清血清块（例如来自DAKO，目录号X0909）；没有必要在抗体稀释液中加入该块。此外，我们建议在实验中仅使用荧光团结合的Fab片段作为次级抗体，包括在山羊体内饲养的初级抗体。
IB4结合糖蛋白上的α-D-半乳糖残基，这种凝集素表位通常比蛋白质表位更稳定；因此，IB4染色与酸水解后的BrdU免疫标记或原位杂交的免疫标记兼容。
