肝病学。作者手稿；PMC 2013年9月4日提供。
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肝脂肪变性患者Kupffer细胞和白细胞介素-12依赖性自然杀伤T细胞丢失
,1,2 ,三 ,1 ,1 ,4 ,1 ,三 迈克尔·弗里德,,三和1,三 克里默
1北卡罗来纳大学教堂山分校酒精苏迪斯中心，NC 27599
2德国海德堡大学外科
伊曼纽尔·托马斯
三北卡罗来纳大学教堂山分校医学系，北卡罗来纳州27599
理查德·米尔顿
1北卡罗来纳大学教堂山分校酒精苏迪斯中心，NC 27599
阿什利·W·佩里
1北卡罗来纳大学教堂山分校酒精苏迪斯中心，NC 27599
尼科·范·鲁伊金
4荷兰阿姆斯特丹自由大学细胞生物学系
迈克尔·D·惠勒
1北卡罗来纳大学教堂山分校酒精苏迪斯中心，NC 27599
史蒂文·扎克斯
三北卡罗来纳大学教堂山分校医学系，NC 27599
理查德·里普
三北卡罗来纳大学教堂山分校医学系，北卡罗来纳州27599
伊恩·海因斯
1北卡罗来纳大学教堂山分校酒精苏迪斯中心，NC 27599
三北卡罗来纳大学教堂山分校医学系，NC 27599
1北卡罗来纳大学教堂山分校酒精苏迪斯中心，NC 27599
2德国海德堡大学外科
三北卡罗来纳大学教堂山分校医学系，NC 27599
4荷兰阿姆斯特丹自由大学细胞生物学系
通讯作者：伊恩·海恩斯（Ian N Hines）博士，北卡罗来纳大学消化与肝病科医学系，7336医学生物分子研究大楼，北卡罗莱纳州教堂山7032号校区信箱，邮编：27599，电话：919-843-7373，传真：919-8699，ude.cnu.dem@senihi - 补充资料
补充材料。
GUID:D0CA2EA9-B9C9-42DC-BC44-CB8199439BA6
摘要
背景
肝脂肪变性与肿瘤坏死因子α（TNFα）和白细胞介素（IL）-12、主要T辅助因子（Th）1细胞因子的表达增加以及肝脏NKT细胞数量减少有关。脂质积累、细胞因子表达和肝脏NKT细胞之间的关系尚不清楚。本研究旨在评估IL-12在肝脂肪变性发展中的作用及其对肝脏NKT细胞的潜在影响。
方法
雄性C57Bl/6野生型（Wt）和IL-12缺陷型（IL12−/−)小鼠被喂食胆碱缺乏饮食（CDD）0、10或20周。
调查结果
CDD导致明显的肝脂肪变性，减少肝脏而非脾脏NKT细胞的数量和功能，并增加肝脏T细胞的表达小时1型细胞因子IL-12、干扰素γ（IFNγ）和TNFα在wt小鼠中的表达。IL-12的缺失导致类似CDD诱导的肝脂肪变性，但保留了肝NKT细胞，并显著降低了肝IFNγ和TNFα的表达。用脂多糖治疗CDD喂养的小鼠导致肝脏IL12表达显著增加，Kupffer细胞（KC）去填充降低了CDD诱导的脂肪肝中肝脏IL-12的表达并恢复了NKT细胞。有趣的是，来自CDD喂养小鼠的KC在激活后未能产生增加数量的IL12在体外与对照组喂食小鼠的类似处理KC相比，表明次要因素体内促进IL-12的产生。最后，患有严重脂肪变性的人类肝脏显示NKT和NK细胞显著减少。
结论
肝脂肪变性以KC和IL-12依赖的方式减少肝脏NKT细胞的数量。我们的结果表明，KC-衍生IL-12在脂肪肝免疫反应改变中具有关键和多功能作用，这一过程可能在人类非酒精性脂肪肝中活跃。
关键词：肝脏、细胞因子、先天免疫、脂质、T辅助因子
介绍
在过去十年中，肝脏作为先天免疫系统的主要器官，具有免疫调节功能，其作用越来越被人们所认识。肝脏含有最多的常驻巨噬细胞（枯否细胞[KCs]）、自然杀伤（NK）细胞和自然杀伤T（NKT）细胞1它们都是先天免疫系统中的重要介质，尽管具有NK细胞和T细胞表型标记的NKT细胞可以代表先天免疫和适应性免疫之间的联系2NKT细胞在包括癌症、微生物感染和自身免疫在内的多种免疫反应中发挥着重要作用，因此在过去几年中受到了广泛关注三-5大多数NKT细胞识别由非典型主要组织相容性复合体（MHC）I类分子CD1d呈现的脂质抗原，主要在抗原呈递细胞上表达，包括单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞和B细胞2,6重要的是，NKT细胞的功能特性似乎主要归因于CD1d-限制性T细胞7此外，NKT细胞是CD4+或CD4−CD8（CD8）−，与典型的CD8形成对比+I类限制性T细胞。最值得注意的是，NKT细胞表达极其有限的T细胞受体，因为其TCR几乎完全由Vα14/Jα281与Vα8、Vα7或Vα2配对组成8,9结合CD1d分子呈现的脂质、糖脂或高度疏水肽6,10CD1d-限制性T细胞显示出强大的T辅助因子（Th）-1相关细胞因子，如白细胞介素（IL）-12和干扰素（IFN）γ，以及T小时2种相关细胞因子，如IL-4和IL-1011因此，适合以促炎或抗炎的方式影响/控制当地环境。
此前，我们报告称，连续6周喂食胆碱缺乏饮食（CDD）导致的肝脂肪变性与常驻NKT细胞数量显著减少相关，同时伴有T细胞增多小时1细胞因子产生（即肿瘤坏死因子（TNF）-α、IL-12和IFNγ），但T水平不变小时2种细胞因子（即IL-4和IL-10）12在不同的肥胖模型中也进行了类似的观察。瘦素缺乏对象/对象老鼠13，胰岛素抵抗fa/faZucker大鼠14和饮食导致的肥胖12,15啮齿类动物的研究表明，肝脂肪变性与局部细胞因子模式的改变有关，类似于慢性肝脏炎症状态与肝淋巴细胞亚群的改变12,15,16综上所述，这些结果表明，肝脏中脂肪的存在改变了肝脏免疫系统，这可能导致他们对继发性损伤的敏感性增加。我们最近表明，T的优势小时1脂肪肝T细胞激活后，细胞因子更为显著，与T细胞表达的信号转导子和转录激活因子（STAT）4升高和T盒转录因子（T-bet）升高有关，T细胞是T细胞活化的关键转录因子小时1个承诺12.
IL-12最初被称为自然杀伤细胞刺激因子，因为它能够刺激NK细胞17，但也发现它能刺激T调节细胞和T细胞18IL-12通过指导T细胞的发育，在对抗细胞内病原体的保护性免疫反应中发挥重要作用小时1个反应19,20不同的研究表明IL-12在肝脂肪变性过程中有重要作用，因为它影响局部T小时1/T（1/T）小时2平衡和NKT细胞激活和调节，但IL-12在饮食诱导的肝脂肪变性发病机制中的确切作用尚不清楚21,22.
本研究的目的是评估IL-12在肝脂肪变性中的作用及其对肝内NKT细胞的影响，并进一步确定患有肝脂肪变性的人是否表现出肝内NK细胞的类似减少。为此，我们利用肝脂肪变性的胆碱缺乏饮食（CDD）模型，确定了Kupffer细胞产生IL-12在肝NKT细胞减少中的重要性，并将这一NKT数量减少的观察结果转化为肝脂肪变性患者的肝脏样本。
材料和方法
动物和治疗
根据《实验动物护理和使用指南》中概述的标准，所有动物都得到了人道关怀。这项研究的进行得到了大学机构动物护理和使用委员会的批准。雄性野生型（wt）C57BL/6小鼠和IL-12 p40缺陷小鼠来自Jackson Laboratories（ME Bar Harbor）。小鼠接受胆碱缺乏药（CDD；Dyets，伯利恒，PA）治疗0、10或20周，导致肝细胞脂质积聚。对于脂多糖（LPS）研究，喂食CDD 0或20周的野生型小鼠在处死前6小时通过腹腔注射给予浓度为2.5mg/kg的LPS（来自E.coli、Sigma、St.Louis MO）。为了激活NKT细胞，喂食CDD 0或10周的wt小鼠在处死前3小时通过静脉注射以200ng/g的浓度服用α-半乳糖神经酰胺（αGal，Alexis Chemicals，Axxora，San Diego，CA）。所有动物都被安置在实验室动物护理评估和认证协会认可的无致病屏障设施中。所有动物都可以自由获得食物和水。在喂食0、10或20周后处死小鼠，收集血清和组织，并将样品储存在−80°C下，直至使用。
巨噬细胞的消耗和检测
含氯膦酸盐的多层脂质体（从德国曼海姆Roche Diagnostics GmbH获得的礼物）的制备如下所述24将100μl 0.5 mg/ml脂质体包裹的氯膦酸盐或PBS作为悬浮在盐水中的对照，静脉接种小鼠。CDD治疗10周后，小鼠接受氯膦酸盐脂质体（或PBS脂质体作为对照）治疗3周；CDD治疗20周后，小鼠每隔4-5天接受氯膦酸盐脂质体（或PBS脂质体作为对照）治疗5周。在氯膦酸钠给药期间，连续给小鼠喂食CDD。如前所述，用F4/80免疫组织化学染色巨噬细胞23从每只动物的10个高能场中计数阳性细胞。
KC的分离和体外活化
从喂食10周CSD或CDD小鼠的肝脏中富集KCs。用胶原酶（0.6mg/ml胶原酶D，印第安纳波利斯罗氏应用科学公司）灌注肝脏，然后通过70μm尼龙过滤器过滤。通过Histogenz密度梯度离心法（0.288g/14ml，Sigma，St.Louis，MO）富集巨噬细胞。界面处的细胞被镀成1×105RPMI 1640中48孔组织培养板上的细胞/孔加上10%胎牛血清和抗生素。16小时后，更换培养基，用生理盐水或脂多糖（10μg/ml）处理细胞3小时。然后收集细胞，分离RNA，并通过实时PCR分析IL-12基因表达。
人肝标本和NKT细胞染色
根据UNC机构审查委员会或海德堡大学审查委员会批准的方案，从接受常规肝活检的受试者处获得不同程度肝脂肪变性的人肝组织，受试者给予书面知情同意。排除了纤维化、肝硬化或明显炎性细胞浸润提示肝炎的样本。样品分为三组，其中显示脂肪堆积在少于5%的肝细胞（n=5），脂肪变性在6-32%的肝细胞中（n=4），脂肪堆积在每个场33%以上的肝细胞内（n=3）。为了染色，根据Harada K的改良方案，对福尔马林固定的石蜡包埋切片进行NKT细胞染色等。
25简而言之，用10%的山羊血清封闭再水化样品，用抗CD57（1:200，BD）在4°C下过夜培养，然后用与碱性磷酸酶相关的抗鼠IgG（1:100，1h，Sigma）培养。液体永久红（DAKO）染色后CD57阳性细胞呈红色。T细胞染色时，将载玻片在4°C下与小鼠抗CD3（Novacastra）孵育过夜，然后再与抗小鼠IgG HRP孵育（1:200，1h，Amersham）。对于HRP显色，使用TMB底物试剂盒（Vector Labs）将CD3阳性细胞染成蓝色，而对于碱性磷酸酶，使用液体永久红（DAKO）将CD57染成蓝色+双阳性染色细胞（紫色）被鉴定为NKT细胞。
统计
数据以平均值±SEM表示。通过使用独立样本t检验比较平均值，确定喂食CDD的小鼠与对照组之间差异的统计显著性。A类第页选择<0.05作为显著性水平。使用SPSS 11.0软件进行统计分析（SPSS Inc.，伊利诺伊州芝加哥）。
结果
CDD诱导的肝脂肪变性降低了肝脏NKT细胞的数量和功能
以前的研究表明，在肝脏脂质积聚的情况下，NKT细胞数量减少1为了确定CDD诱导的肝脂肪变性是否会显著改变肝脏NKT细胞数量和/或功能，给wt小鼠喂食CDD或CSD作为对照，喂食10周，然后喂食αGal或载体。如所示根据TCRβ和NK1.1双阳性细胞百分比以及TCRβ及CD1d-四聚体/PBS57评估，喂食10周的wt小鼠CDD导致肝NKT细胞减少，与αGal处理的CSD对照组相比，这种减少与IL4生成显著降低有关(). 总之，这些数据证实了肝脏NKT细胞不仅数量减少，而且功能也减少。
脂肪肝内肝NKT细胞数量和功能减少A.通过流式细胞术分析喂食胆碱充足饮食（CSD）或胆碱缺乏饮食（CDD）10周的小鼠肝单个核细胞的T细胞受体β（TCRβ）和NK1.1表达或TCRβ与载PBS57的CD1d四聚体的结合。给出了典型的点图。B.静脉注射α-半乳糖神经酰胺（αGal，200ng/g）后3小时，通过ELISA测定10周喂养CSD或CDD的小鼠肝脏IL4蛋白的表达。每组n=6-9只小鼠*与CSD喂食载体治疗小鼠相比，p<0.05，+与CSD喂养的αGal处理小鼠相比，p<0.05。
CDD诱导的肝脂肪变性与肝IL-12的显著增加相关
肝脂肪变性与T增加有关小时1细胞因子表达12,15在我们之前的研究中，我们报告了在喂食CDD 6周后，肝脏T细胞显著增加，CDD会导致轻度的肝脏脂质积聚小时1（IFNγ，IL12）细胞因子在对照组和伴刀豆球蛋白A治疗的CDD喂养小鼠中的产生12在这里，我们希望更好地了解严重脂肪变性对肝脏IL12表达的影响，在这种情况下，肝脏NKT细胞数量和功能显著减少。与0周喂养相比，CDD喂养10周后肝脏IL-12 mRNA水平显著升高（对照组变化1.09±0.17倍，CDD 10周后变化7.8±1.09倍，p<0.05），20周喂养后持续升高（变化10.6±2.8倍，p<0.05）().
长期喂食CDD后IL12生成增加不会影响肝脂肪变性的进展A.给C57BL/6小鼠喂食CDD 0、10或20周。全肝组织实时定量PCR检测肝IL-12的表达，ELISA检测血清IL-12。数值为平均值±SEM，。在C57BL/6（Wt）和IL-12中CDD 0周、10周和20周后，进行B&E染色的肝脏组织学检查−/−老鼠。代表性的显微照片以100倍放大率显示，并插入400倍（每张图像的右下角）。C.在CDD喂养0、10或20周后，测量血清丙氨酸氨基转移酶、肝脏重量与体重之比（LW/BW）和肝脏甘油三酯。Wt和IL-12之间无显著差异−/−这些参数中的任何一个。数值为平均值±SEM，*p<0.05，每组n=4-8只动物。
IL12缺乏并不影响CDD诱导的肝脂肪变性的进展
为了研究IL-12在肝脂肪变性中的潜在意义，除了Wt小鼠外，还用CDD喂养IL-12缺陷小鼠0、10和20周。如所示，wt和IL12均发生微泡脂肪变性−/−喂食CDD 10周后的小鼠，喂食20周后，CDD和CDD均向大囊脂积聚发展。根据血清丙氨酸转氨酶水平测定，在没有明显肝细胞损伤的情况下，脂质积聚增加(). 20周CDD喂养C57Bl/6和IL-12后，肝脏重量与体重的比值增加−/−与喂食0周相比，最后，肝甘油三酯的测量证实了组织病理学结果，即在喂食CDD 10周和20周后，wt和IL12的肝脏甘油三酸酯水平相似−/−老鼠(). 总之，很明显IL12不会显著改变长期摄入胆碱缺乏饮食后肝脂肪变性的进展。
IL-12促进T细胞的诱导小时CDD诱导肝脂肪变性中的1-相关细胞因子
除了增加IL-12水平外，其他关键T小时在不同的肝脂肪变性模型中，TNFα和IFNγ等1相关细胞因子升高，而T小时2-相关细胞因子不受影响12,15慢性CDD导致喂食10周或20周后Wt小鼠TNFα和IFNγmRNA显著增加，而IL-4或IL-10表达仅出现轻微变化。令人惊讶的是，IL-12的缺失消除了脂肪变性诱导的T细胞增加小时1相关细胞因子，尽管IL-12缺陷小鼠的肝脏脂肪积累量相当().
IL-12促进T小时脂肪肝中1种细胞因子的表达T型肝炎小时1（TNFα和IFNγ）和T小时通过实时PCR检测wt和IL12中2（IL-4或IL-10）细胞因子基因的表达−/−小鼠喂食CDD 0、10或20周。数值为平均值±SEM，*p<0.05；n=每组4-8只动物。
IL-12参与CDD诱导的肝NKT细胞耗竭
在CDD诱导的肝脂肪变性的当前研究中，我们观察到Wt小鼠肝NKT细胞数量的严重依赖性减少。在10周的饮食后，近70%的NKT细胞群在20周后耗尽，高达98%的NKT细胞群在10周饮食后耗尽()，这一发现仅限于肝脏，因为脾脏NKT细胞群不受CDD喂养的影响(). 在IL-12缺乏小鼠中，肝脏NKT细胞的显著减少被消除。CDD 10周和20周后，与0周CDD小鼠相比，肝脏NKT细胞数量没有变化(). 总之，这些结果表明，不是IL-12本身，而是IL-12与脂肪肝微环境变化的结合可能是导致肝NKT细胞耗竭的原因。
IL-12参与脂肪变性相关的肝NKT细胞耗竭C57BL/6（Wt）和白细胞介素（IL）-12−/−给小鼠喂食CDD 0、10或20周，并用流式细胞仪分析肝单个核细胞总数。用抗小鼠T细胞受体β（TCR）和自然杀伤（NK）1.1抗体对肝单个核细胞（A）或脾细胞（C）进行染色。方框中列出了T细胞、NKT细胞和NK细胞。数值代表所分析的肝单个核细胞总数的百分比。B和D。肝（B）或脾（D）NKT细胞的定量，表示为肝CD3总量的百分比+表达NK1.1。图是3-6个不同实验的代表。每组3-6只动物的结果具有代表性。
肝巨噬细胞有助于IL-12的产生
为了评估IL-12在肝脂肪变性中的潜在来源，我们研究了肝巨噬细胞在脂肪肝中的作用。先前的研究报告脂肪组织中巨噬细胞数量增加26但有关脂肪肝的报道并不一致。与0周CDD小鼠相比，用F4/80免疫组织化学法评估CDD喂食10周或20周后的巨噬细胞数量并没有增加(). 然而，脂肪变性确实改变了KC的形态，细胞大小显著增大，呈细长纺锤形。与KCs的潜在激活一致的是，患有肝脂肪变性的wt小鼠的肝脏CD14基因表达显著增加(). 为了评估肝脂肪变性对KC功能的影响，通过腹腔注射脂多糖（2.5mg/kg）给小鼠喂食胆碱缺乏饮食或对照饮食20周。注射LPS后6小时，与LPS处理的CSD喂养小鼠相比，肝脏IL12基因表达显著增加(). IL12的增加与喂食CDD但喂食CSD的小鼠的血清天冬氨酸转氨酶水平显著增加相关，这种损伤与IL12无关(). 有趣的是，在体外与CSD喂养的肝巨噬细胞相比，经LPS刺激后3小时，CDD喂养的小鼠KCs中IL12的表达没有显著增加()这表明脂肪肝内存在次级因子启动巨噬细胞释放细胞因子。总之，这些数据表明脂肪肝内肝巨噬细胞对内毒素的反应性增强，这一过程可能涉及多个因素。
Kupffer细胞在脂肪肝内被激活A.喂食CDD 0、10或20周的野生型小鼠的肝脏切片用F4/80染色。展示了具有代表性的400张显微照片。B.每400x场F4/80阳性细胞的定量。分析了每只小鼠每节的十个字段。C.使用实时PCR检测肝脏CD14基因表达。D.注射LPS 6小时后肝脏IL12基因表达。E.注射脂多糖（LPS，2.5mg/kg）6小时后wt或IL12的血清天冬氨酸转氨酶水平−/−小鼠连续20周喂食胆碱充足饮食（CSD）或CDD饮食。F.在用生理盐水或LPS（10μg/ml）治疗3小时后，从喂食胆碱充足饮食或胆碱缺乏饮食10周的wt小鼠中分离出的肝巨噬细胞（Mφ）中IL12的表达。显示了两个独立实验的代表性数据。数值为平均值±SEM，*p与相应对照组相比<0.05，+与LPS处理的胆碱充足饮食喂养的小鼠相比，p<0.05；n=每组4-8只动物。
KCs导致脂肪肝内NKT细胞丢失
为了研究巨噬细胞在肝脂肪变性中的功能作用，特别是它们对NKT细胞数量的影响，已建立脂肪肝的小鼠根据.氯膦酸盐被巨噬细胞选择性吞噬并诱导细胞凋亡。脂肪肝对照组给予生理盐水()而通过氯膦酸钠治疗可以有效地去除巨噬细胞。用免疫组织化学方法证实氯膦酸盐治疗后巨噬细胞的缺失()与PBS包裹脂质体治疗的CDD喂食对照组相比，在13周或25周的时间点均未导致肝损伤的任何变化（数据未显示），尽管巨噬细胞的减少确实显示出减少肝脂质积聚的趋势（PBS脂质体治疗CDD喂吃小鼠的巨噬细胞减少32.40±8.17 vs.17.89±4.62 vs。用氯膦酸盐包裹的脂质体治疗CDD喂养的小鼠，p=0.104）。
氯膦酸盐耗尽枯否细胞并改善T细胞升高小时脂肪肝组织中1种相关细胞因子的表达A.巨噬细胞耗竭研究的给药方案。CDD 10周后建立肝脂肪变性的小鼠每4-5天注射一次氯膦酸钠，持续3周；CDD 20周后的小鼠在连续喂食CDD的同时，每隔4-5天接受一次氯磷酸钠，持续5周。B.肝脏切片用来自给药载体或氯膦酸盐的wt小鼠的F4/80抗体染色，如A.所述。呈现400倍放大的典型显微照片。C.肝脏T小时1和T小时2细胞因子表达，如通过实时PCR在载体或氯膦酸盐处理的动物中评估的。数值为平均值±SEM，*p<0.05。n=每组4-6只动物。
KCs在先天免疫中起主要作用，并且可能是肝脏中IL-12的来源27因此，我们在氯膦酸钠（或载体）治疗Wt小鼠后，使用实时PCR检测了肝脏IL-12和IFNγ的表达以及IL-4和IL-10基因的表达(). KC缺乏减弱脂肪变性诱导的肝IL-12和IFNγ基因表达，对T细胞无影响小时2-相关细胞因子。此外，在CDD 10周后，KC耗竭导致肝NKT细胞完全再生(). 即使在20周的CDD后，肝脂肪变性患者的NKT细胞几乎完全丧失，5周的氯膦酸钠治疗足以恢复NKT淋巴细胞。为了消除氯膦酸钠治疗可能产生的非特异性影响，喂食CDD 10周的IL12缺陷小鼠被给予氯膦酸酯3周。未经治疗的CDD喂养小鼠的肝NKT细胞群没有改变（数据未显示）。这些结果表明，KCs直接或间接促进IL-12的产生，并持续消耗脂肪肝内的肝脏NKT细胞。
Kupffer细胞参与脂肪变性诱导的肝NKT细胞耗竭通过流式细胞术评估在指定时间段内喂食胆碱缺乏饮食的溶媒或氯膦酸盐处理野生型小鼠的淋巴细胞亚群，分离出肝单核细胞。结果代表了4-6个不同的实验，p<0.01。
非酒精性肝脂肪变性患者NKT细胞数量减少
最近，有报道称非酒精性脂肪性肝病患者血液中的外周血NKT细胞数量减少28，但没有关于人类脂肪肝中NKT细胞数量的数据。从北卡罗来纳大学肝病科和海德堡大学病理学系获得了不同程度肝脂肪变性患者的人类肝脏样本。根据没有严重炎症、纤维化或肝硬化的情况选择样本，以更清楚地评估单独的脂肪变性对肝脏NKT细胞的影响。如所示6-32%的肝细胞脂肪变性患者的肝切片中NKT细胞数量减少。与健康对照肝脏相比，严重脂肪变性时，肝脏NKT细胞进一步减少。总之，这些数据表明，正如在肝脂肪变性啮齿类动物模型中所见，人类非酒精性肝脂肪变性导致肝NKT细胞数量减少。
肝脂肪变性与人类NKT和NK细胞数量减少有关按照方法所述，人类肝脏活检被分为三组。对载玻片进行CD3和CD57染色，CD57是人类NK细胞的标记物。CD3阳性细胞呈蓝色，NK阳性细胞呈红色。双阳性细胞称为NKT细胞。A.呈现染色组织的代表性显微照片，NKT细胞用箭头指示。B.从至少10张400倍的组织图片中计算NKT细胞的定量。每组n=3-5的代表性结果。数值为平均值±SEM。
讨论
NKT细胞代表参与免疫系统调节的高度特异性淋巴细胞群体。由于NKT是肝脏单个核细胞的20-25%，并且具有经典T细胞和自然杀伤（NK）细胞的共同特征，因此它们通过产生两种T细胞在先天免疫和适应性免疫之间起着重要的联系小时1和T小时2种相关细胞因子2。当前研究的结果证实了肝细胞脂质积累能够降低小鼠和人类中这一重要常驻淋巴细胞群的数量和功能，并通过实验确定了IL-12和KC相关的耗竭机制。总之，这些研究为肝脂肪变性对NKT细胞的影响提供了新的重要信息。
先前对肥胖、瘦素缺乏的脂肪肝的研究对象/对象小鼠报告肝内NKT细胞数量减少16在许多不同的饮食诱导型肝脂肪变性模型中证实了这种减少12,14,15有趣的是，无论是野生型NKT细胞的过继转移，还是用瘦素缺乏的ob/ob小鼠体内天然存在的糖脂葡萄糖脑苷激活NKT淋巴细胞，都会导致肝脏脂质含量的变化，特别是从大泡脂肪向微泡脂肪的移动，糖耐量的改善表明NKT细胞可能是肝脂肪变性的抑制剂29,30然而，我们的研究结果表明，在CDD诱导的肝脂肪变性中，NKT细胞的恢复和T细胞的抑制小时IL12中的1个细胞因子反应−/−小鼠不足以影响肝脏甘油三酯的积累。目前尚不清楚缺乏对脂质积累影响的原因。很明显，其他炎症细胞因子，尤其是TNFα，能够促进非酒精性31和酒精性脂肪变性32而我们自己实验室的研究表明，TNFα在该模型中对脂质积累具有活性和重要性（未发表的观察结果）。在没有IL12的情况下，TNFα水平降低至控制水平或接近控制水平。这可能是因为它们的存在，即使在非常低的水平上，也能够促进和维持脂质积累。需要进一步研究以更好地了解脂肪变性发展的关键因素。然而，目前的研究表明，IL12单用不能促进脂质积聚。总之，由于肝脏NKT细胞数量的严重依赖性减少仅限于肝脏，而脾脏中的外周NKT淋巴细胞未受到影响，因此局部肝脏环境似乎会导致NKT常驻细胞数量的减少，这一过程涉及IL-12的产生。
在20周的时间过程中，CDD导致严重的肝脂肪变性，无炎症或坏死。它与肝脏IL-12表达显著增加有关。已知IL-12可刺激NKT和其他免疫竞争性T细胞及NK细胞释放IFNγ33，但存在关于其在IL-12暴露后的生存能力的相互矛盾的数据。鉴于Ito等。
34,35Takahashi发现IL-12刺激后肝脏NKT细胞数量增加等。报告IL-12降低NKT细胞活性的能力36和松井等。还观察到IL-12通过激活诱导细胞死亡降低NKT细胞数量37在目前的研究中，我们发现脂肪肝中肝脏IL-12表达显著增加，肝NKT细胞IL-12依赖性丢失。脂肪肝内存在的多种因素可能会使NKT细胞对IL-12相关耗竭特异性敏感。或者，IL12可以通过其他细胞因子或因子发挥作用，因为IL12缺陷小鼠显示TNFα和IFNγ的表达显著降低，并且这些介质对NKT细胞功能的作用尚未阐明。虽然IL12促进NKT细胞的丢失，但它也可能为肝脏NK细胞提供支持信号。最初被描述为NK细胞诱导因子18IL12可能支持NK细胞募集和/或存活，但其对NKT细胞功能或肝脂肪变性发展的净影响尚待确定。然而，当前研究的结果强烈暗示IL-12是耗竭小鼠脂肪肝内重要免疫调节细胞群的关键因素。
除了证明IL-12在脂肪肝NKT细胞耗竭中的重要性外，目前的研究还进一步研究了IL-12的潜在来源，该来源与KC的产生有关。经内毒素激活后，常驻肝巨噬细胞产生促炎介质，包括TNFα和IL-1213,38在酒精性肝病中，这些介质与促进肝损伤和肝细胞脂质积聚有关32非酒精性脂肪变性对KC活化的影响尚不清楚。在患有脂肪肝的瘦素缺乏小鼠中，包括IL-12在内的肝巨噬细胞细胞因子的产生增加13当前研究的结果将进一步表明，单独的脂肪变性可能诱导显著的KC激活。使用脂肪肝中的肝脏CD14基因表达作为巨噬细胞活化的间接测量，我们提供的数据表明，肝脂肪变性的严重程度与CD14表达水平之间存在相关性，而与肝巨噬细胞数量的改变无关。此外，在LPS刺激下体内脂肪肝中IL12的表达量显著增加，肝细胞损伤明显增强，尽管这种损伤独立于IL-12的诱导。有趣的是，从CDD喂养的wt小鼠中分离出的KC在基础上或被LPS激活时均未表达IL12水平的增加在体外与经类似处理的CSD喂养的wt小鼠KCs相比，表明脂肪肝内存在的次级因子在LPS存在的情况下促进IL-12的产生。另外，KC相关IL12并不是这种重要的NKT细胞消耗细胞因子的唯一来源。先前对缺血和再灌注模型的研究已经证明肝细胞产生IL12的能力39。在体内环境、脂肪代谢的变化和异常高水平的代谢物、氧化应激的增加以及由此产生的脂质过氧化可能会促进KC反应性的提高40,41肝细胞和淋巴细胞释放促炎细胞因子，如TNFα或IL-1215,42同样，KCs对该模型中肝脂肪变性发展的潜在影响仍有待确定。很明显，与IL12的丢失不同，肝巨噬细胞的丢失会导致CDD喂养10周和20周后肝脏脂质积聚的显著减少，尽管并不显著，这表明KCs产生的其他因素可能对肝脏脂质积聚很重要。需要进一步的研究来具体确定这些因素在严重肝脂肪变性的情况下的作用。然而，这里的数据表明，肝巨噬细胞直接或间接参与了IL-12的产生，因为这些细胞的耗竭降低了肝IL-12表达，平衡了T小时肝细胞因子谱，并导致已确诊的肝脂肪变性小鼠肝脏内NKT细胞的重建。总之，这些数据为脂肪肝内IL-12产生的复杂性和潜在来源提供了新的见解。
肝脂肪变性导致T小时1为主的细胞因子反应12这种转变的原因可能包括氧化剂生成增加、氧化剂防御能力降低和/或肝内免疫细胞数量或功能的调节。当前研究的数据表明IL-12和/或NKT细胞的丢失在促进T小时1-移位响应。已知IL-12可诱导T细胞产生大量IFNγ并激活T细胞小时1转录因子包括信号转导子和转录激活子（STAT）420NKT细胞也可以平衡肝脏内的局部细胞因子反应。Li和其他人报告了瘦素缺乏的ob/ob小鼠对内毒素诱导的肝损伤的敏感性随着T生成的增加而增加小时1种细胞因子，包括已知的内毒素诱导肝损伤介质IFNγ1在目前的研究中，IL-12的缺失降低了肝脏IFNγ的表达，但也保留了肝脏NKT细胞群，因此很难确定其中哪些是导致T细胞受损的原因小时脂肪肝的平衡。然而，目前的研究结果表明，在严重脂肪变性的情况下，IL12在肝脏NKT细胞耗竭中的重要性，这一过程与肝脏T细胞平衡的恢复有关小时细胞因子概况。
通过对轻度至重度肝脂肪变性患者的活检，我们提出了有趣的证据，表明脂肪变性程度与人类肝NKT细胞数量之间存在类似的相关性，当肝脂肪变性中度至重度时，人类肝NK细胞数量减少。由于样本量较小，无法确定这些样本中的IL-12是否如实验观察到的那样上调，尽管先前的研究已经证明人类脂肪肝中的促炎细胞因子增加43然而，本文的发现为人类提供了第一条证据，表明肝脂肪变性可能确实是肝淋巴细胞群的关键调节因子。
总之，这些结果证明了肝脂肪变性诱导的IL-12生成与常驻NKT细胞的丢失之间的联系，并暗示NKT在抑制T小时脂肪肝内1型细胞因子的产生。此外，我们首次提供证据表明人类脂肪肝和肝NKT细胞丢失之间存在类似的联系。一些问题仍然存在，包括促进KC相关IL-12表达的刺激物的性质，以及IL-12如何介导其对肝NKT细胞群的影响的明确机制。此外，NKT细胞丢失对脂肪肝可能产生的其他影响也很有趣。众所周知，NKT细胞和NK细胞在肿瘤细胞监测和清除中都发挥着重要作用，NKT和/或NK细胞功能的破坏可能使肝脏易患包括致癌在内的继发性疾病。总之，目前的研究提供了脂肪肝内NKT细胞耗竭的重要新机制信息，并确定了潜在的新治疗靶点，以保护肝脏的关键常驻免疫细胞群。
致谢
赠款支持：这项工作得到了美国国家酒精滥用和酗酒研究所的资助，由Ian N Hines获得AA016563，Richard A Rippe获得AA014243，以及ABMRF/酒精研究基金会（Ian N Hanes）的资助。
缩写
| αGal | （α-半乳糖神经酰胺） |
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脚注
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