循环乳腺肿瘤细胞上皮和间充质成分的动态变化

摘要

大多数癌症相关死亡是由转移引起的，即癌细胞从原发肿瘤通过血液传播到新的器官部位(1). 根据对人类肿瘤细胞系和小鼠模型的研究，上皮-间充质转化（EMT）的异常激活与这一过程有关(2,三). 免疫组织化学方法识别肿瘤中的EMT因存在反应性间充质基质细胞而变得复杂(4,5)循环肿瘤细胞（CTC）的分析因依赖上皮标记物将癌细胞与周围间充质来源的造血细胞分离而受到阻碍(6,7). 为了应对这些技术挑战，我们利用上皮和肿瘤特异性抗体优化了CTC的微流控捕获，然后我们使用该技术分析乳腺癌患者CTC中的EMT。

我们建立了一种可量化的双比色RNA原位杂交（ISH）测定法，以检测肿瘤细胞七种合并上皮（E）转录物[角蛋白（KRT）5、7、8、18和19；EpCAM（上皮细胞粘附分子）和CDH1（钙粘蛋白1）]和三种间充质（M）转录物[FN1（纤连蛋白1）、CDH2（钙粘蛋白2）和SERPINE1/PAI1（蛇毒肽酶抑制剂，E分支）]。这些探针在细胞系中得到验证，以确认上皮癌细胞与间充质癌细胞中的差异表达，以及在污染CTC制剂的血细胞中没有表达(表S1和图S1A). 验证小鼠上皮性或间叶性乳腺癌细胞异种移植中E/M RNA-ISH分析后(图S1B)，我们对原始人类乳腺癌标本进行了检测。

在大多数E中⁺癌细胞，与M⁺基质细胞中，我们检测到少量双表型E⁺/M（M）⁺原发性肿瘤和引流淋巴结中上皮组织学清晰的细胞(图1、A和B). M标记物和肿瘤特异性标记物（HER2）的双RNA-ISH染色证实了这种间充质细胞作为肿瘤衍生细胞的特性(图1C). 我们对包含多种不同组织学亚型的多原发性乳腺癌的组织微阵列（TMA）的双E⁺/M（M）⁺细胞。通过这项检测，我们发现良性乳腺组织(N个=6例）和浸润前导管原位癌（DCIS）病变中的肿瘤细胞(N个=7例）仅为上皮细胞，而反应性基质细胞仅为间充质细胞。相反，我们发现侵袭性乳腺癌的所有三种主要组织学亚型均含有上皮形态的罕见肿瘤细胞，这些上皮形态均用E和M标记物染色：ER/PR⁺亚型（平均值=3.3%，范围0-10%，N个=20例）；HER2型⁺亚型（平均值=2.7%，范围0至10%，N个=9例）；和三重负（TN）（ER⁻/公关⁻/HER2型⁻)亚型（平均值=12.1%，范围0-45%，N个=16例）(图1D). 较高的M数⁺原发性TN乳腺癌中的肿瘤细胞与这类乳腺癌中富含间叶标记物（包括波形蛋白）的情况一致(8,9). 一些TN病例在肿瘤肿块中部有成簇的细胞，这些细胞对E和M标记物均呈强阳性，但在组织学上与邻近的E标记物无明显区别⁺肿瘤细胞(图1D). 因此，人类原发性乳腺肿瘤含有罕见的癌细胞，它们共同表达间充质和上皮标记物。

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图1

人类乳腺肿瘤EMT标记物的RNA-ISH分析。对混合上皮（E）（红点，箭头）和间充质（M）（深蓝色点，箭头(A类)原发肿瘤和(B类)导管ER患者肿瘤浸润淋巴结1例⁺/公关⁺型乳腺癌。(C类)HER2（红色圆点，箭头）和M（深蓝色圆点，图标）表达的RNA-ISH分析⁺原发性乳腺肿瘤。(D类)癌前DCIS组成的TMA中E和M双阳性肿瘤细胞的定量（占肿瘤细胞总数的百分比）(N个=7例）和ER⁺/公关⁺(N个=20例），HER2⁺(N个=9例）和TN(N个16例）乳腺癌。来自TN案例的代表性图像显示在右侧。E、 红点；M、 深蓝色圆点；细胞核用苏木精浅蓝色染色。比例尺：（A）至（D），20μm；插件，10μm。

为了将EMT分析扩展到CTC，我们使用了微流体HB（人字形）芯片(10)用针对EpCAM、EGFR（上皮生长因子受体）和HER2（人类上皮生长因子2受体）的抗体鸡尾酒从血液中捕获CTC(图S2). 将具有上皮细胞（MCF7和SKBR3）和间充质细胞（MDA-MB-231）特征的人乳腺癌细胞系注入血液中，并捕获到三抗体涂层CTC芯片上，以确保捕获效率为80-90%。表达EMT诱导转录因子LBX1的MCF10A细胞(11)用于优化CTC芯片捕获细胞的基于定量免疫荧光的E和M RNA-ISH检测(图S3). 使用该分析，我们定义了五类细胞，从纯上皮细胞（E）到中间细胞（E>M，E=M，M>E）和纯间充质细胞（M）(图S3和图2A).

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图2

转移性乳腺癌患者CTC中EMT标记物的RNA-ISH分析。(A类)基于E（绿点）和M（红点）标记物的RNA-ISH染色，从转移性乳腺癌患者分离的五种类型CTC的代表性图像。比例尺，5μm(B类)基于乳腺癌组织学亚型[小叶、导管和U（未知）]的E和M RNA-ISH染色以及分子分类（ER/PR、HER2、TN）对CTC中EMT特征的定量。基于RNA（E）的每3毫升血液中的CTC数⁺M） 或蛋白质（CK）染色如下所示。(C类)五名对治疗有临床反应的患者（前）和五名治疗中有进展性疾病的患者（后）的CTC根据E/M比率进行分级。显示了乳腺癌的亚型、每位患者的治疗方案和治疗天数。用于抑制图中所示信号通路的药物如下：MET+VEGF（血管内皮生长因子）、卡波佐丁尼；AI（芳香化酶抑制剂）来曲唑；PI3K（磷脂酰肌醇3-激酶）、BKM120、INK1117和BYL719；PI3K/mTOR（雷帕霉素的哺乳动物靶点），SAR245409；MEK（MAP激酶激酶），MSC193639B；EGFR/HER3（人表皮生长因子受体3），MEHD7945A。所用的化疗药物有顺铂、紫杉醇和阿霉素。肿瘤基因型见表S2。

为了确定CTC阳性评分的临界值，我们首先分析了五名健康献血者的样本。在五个标本中的一个标本中发现了两个间充质细胞（中位数为0，范围为每3毫升0至2个细胞）。为了设定一个保守的阈值，我们建立了每3毫升5个细胞作为CTC阳性评分的截止值。接下来，我们分析了41名处于转移性乳腺癌不同治疗阶段的患者的血样。17名患者（41%）CTC评分为阳性，EMT特征因组织学亚型而异(图2，A和B). 小叶型癌患者的CTC（通常为ER⁺/公关⁺)主要是上皮细胞，而TN亚型的主要是间充质细胞。有趣的是，HER2患者的CTC⁺乳腺癌，其原发肿瘤通常含有少量E⁺/M（M）⁺细胞也主要是间充质细胞(图2B). 值得注意的是，CTC的基于细胞角蛋白的标准蛋白染色与RNA-ISH在上皮性CTC评分方面具有可比性，但在间叶性CTC的病例中显著低估(12).

接下来，我们比较了其中10例患者治疗前后血样的CTC特征。五名对治疗有反应的患者显示CTC数量减少和/或M成比例减少⁺与E相比⁺后处理样品中的CTC(图2C). 相比之下，5名在治疗期间患有进展性疾病的患者显示M的数量增加⁺处理后样品中的CTC。我们从一名ER/PR指数患者身上获得了系列标本⁺小叶癌。该患者最初对实验方案有反应，出现耐药性，然后对标准化疗有短暂反应(图3). 大量M⁺CTC在第一个时间点很明显。实验方案的首次临床反应伴随着CTC数的下降和转向以E为主⁺细胞。经过7个月的治疗，患者出现疾病进展，这与M增加有关⁺CTC。这些细胞数量再次下降，并转换为E型⁺化疗方案第二次反应期间的表型。3个月后，患者再次出现疾病进展，并转为M型⁺CTC公司(图3).

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图3

纵向监测指标患者CTC的EMT特征。基于RNA（E和M标记）检测方法的KRAS-和PIK3CA-突变ER/PR患者每3 ml血液中的CTC计数图⁺小叶性乳腺癌患者在使用靶向PI3K（GDC0941）和MEK（GDCO973）通路的抑制剂治疗期间连续采样，然后进行阿霉素化疗。基于RNA-ISH染色的EMT特征的彩色编码定量显示在每个时间点的上方。治疗史和临床反应记录在图表上。P、 疾病进展；R、 治疗反应）。M（M）⁺在时间点1、8和12检测到簇。下图显示了不同时间点的CTCs E（绿色）和M（红色）标记染色和CK（红色）、CD45（绿色）或血小板标记CD61（绿色）蛋白染色图像。显示处理3ml血液后在整个CTC芯片上检测到的单个CTC（S-CTC）数量以及CTC簇（C-CTC）内的CTC数量。细胞核用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚（DAPI）（蓝色）染色。比例尺，10μm。疾病进展（P）或治疗反应（R）的标准在补充材料。

M的增加⁺索引患者的CTC伴随着多细胞CTC簇的出现，范围从4到50个细胞，其中一簇有~100个肿瘤细胞(图3,图S4、和电影S1). 这些簇在以E为主的样本中不存在⁺CTC。晚期癌症患者中可见CTC簇(10)可通过不同的CTC隔离平台进行检测(13,14). CTC簇在ISH中M标记强阳性，E标记弱阳性，上皮细胞角蛋白抗体染色弱(图3). 这一观察结果与EMT导致高度迁移的单个细胞而不是带有间充质标记物的细胞簇的普遍假设相矛盾(2,三). 然而，与最近的观察结果一致，即与肿瘤细胞结合的血小板释放转化生长因子β（TGF-β），可能在循环中诱导EMT(15)，CTC簇染色显示大量粘附的（CD61阳性）血小板(图3). 我们检测到M⁺CTC簇由2至20个细胞组成，不仅在指数患者中，而且在另外两名患者中，均为ER/PR患者⁺乳腺癌(图S5).

为了确定导致乳腺癌患者EMT的CTC内的信号通路，我们对其进行RNA测序，使用单分子平台避免与罕见模板相关的扩增偏差(16,17). 由于捕获的CTC受到大量白细胞的污染，我们通过配对的抗EpCAM捕获和模拟捕获CTC芯片处理每个样本，使我们能够从富含CTC的细胞中减去粘附血细胞的数字基因表达（DGE）图谱。来自指数患者的CTC富集细胞群在五个连续时间点的DGE图谱鉴定了45个富集基因，与来自10名健康献血者的类似处理的血液样本进行比较，这些样本用于测量抗EpCAM捕获背景[基于排列的统计模型应用于五个时间点中的每一个，错误发现率（FDR）阈值为0.15](图4和表S3). 丰富的转录物包括上皮角蛋白KRT 8和19、乳腺肿瘤标记物、乳腺珠蛋白（SCGB2A2和SCGB2A1）和三叶因子1和3（TFF1和TFF3），其中最丰富的（TFF1）在该患者的原发肿瘤和转移淋巴结中高度表达(图S6). CTC相关转录物在基因集富集分析（GSEA）数据库中识别出12个特征，FDR<0.25(图4和表S4). 与乳腺癌骨复发中基因特征上调相关最强(P（P）= 1.32 × 10⁻⁷; FDR=0.000767），这是值得注意的，因为患者在CTC分析时有转移性骨病变。

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图4

富含CTC转录物的RNA序列分析。热图表示从治疗期间的多个时间点采集的索引患者中富含CTC的转录本。将患者的5个时间点（第1行至第5行）与10名健康献血者（HD）的相同处理血液样本（第6行至第15行）进行比较，得出45个基因的CTC特征。170个基因的EMT特异性特征来自于比较M⁺带有E的集群富集CTC（第4行）⁺CTC。红色和蓝色分别表示相对较高和较低的基因表达。GSEA数据库中显示了45个基因CTC签名和170个基因EMT簇CTC签名的基因签名类别，有助于富集的基因以绿色突出显示。括号中给出了每个类别中的丰富签名数。

另外一组170个转录物在间充质优势时间点捕获的CTC中富集，特征是多个（>18）M⁺CTC集群(图4和表S5). SERPINE1/PAI1和FN1是RNA-ISH小组中使用的两种间充质探针，是CTC簇相关转录物中含量最多和第三丰富的转录物。GSEA数据库鉴定出717个基因特征（FDR为0.25）(图4和表S6)与EMT相关的表达变化显著丰富，包括与核心EMT特征的显著重叠(18) (表S7)（90人中有11人；P（P）= 8.1 × 10⁻⁸; 比值比=9.8）。此外，细胞外基质（ECM）和ECM相关膜受体（包括整合素和白细胞介素受体）的富集可能与聚集现象有关。浸润性导管癌和小叶癌中报告的特征、治疗耐药性以及TGF-β、白细胞介素-6和WNT（LEF1）信号通路也被发现。其中，TGF-β最为显著(P（P）= 2.96 × 10⁻¹¹)是间充质转化的有力发起人(2)直接参与血小板诱导的EMT(15). 在M中未检测到蜗牛、鼻涕虫或其他成熟的EMT转录调控因子的表达⁺CTC簇，但叉盒蛋白C1（FOXC1）(图4)，一种在细胞培养模型中诱导EMT的转录因子(19,20)检测到。RNA-ISH显示FOXC1在CTC和原发性乳腺癌的局部区域以及指数患者和其他病例的肿瘤浸润淋巴结中的表达(图S7). 因此，随着TGF-β的激活，FOXC1的异常表达可能有助于人类乳腺癌的EMT。

总之，我们已经在人类乳腺癌标本中提供了EMT的证据，无论是在原发肿瘤中的罕见细胞还是在CTC中更为丰富。这些发现与小鼠肿瘤模型的结果一致，包括最近使用Kras/Tp53胰腺癌和Her2转基因乳腺癌谱系追踪的研究(21,22)并检测波形蛋白染色和/或CK⁻癌症患者的CTC(23–25). 值得注意的是，我们发现间充质标志物的表达与CTC簇而不是单个迁移细胞之间存在显著的相关性。这些粘附细胞的间充质标记物的表达可能是由经过EMT的单个细胞增殖成这样的细胞簇引起的，或者是由血液中预先存在的CTC簇的间充质转化引起的。血小板释放的TGF-β介导上皮细胞的间充质转化(15)我们在间充质CTC簇中观察到强烈的TGF-β信号，支持了这一观点，其中许多簇携带附着的血小板。维持细胞-细胞和细胞-基质连接的成组细胞的集体迁移与癌症转移有关(26,27)随着CTC簇在血液中循环，可能会增加生存信号(17,28,29). EMT作为治疗耐药的潜在生物标志物和乳腺癌潜在药物靶点的临床重要性值得进一步研究。

补充材料

致谢

脚注

参考文献和注释