真核应激颗粒通过颗粒吞噬和Cdc48/VCP功能清除

总结

简介

mRNA翻译、定位和降解的控制在基因表达的适当调节中起着重要作用。这种转录后控制在许多生物条件下都受到重视，包括应激反应、胚胎发生和突触可塑性(Spriggs等人，2010年;Medioni等人，2012年;Doyle和Kiebler，2011年;Gkogkas等人，2010年). 理解转录后控制机制的关键问题包括理解信使核糖核蛋白复合物（mRNP）的形成以及细胞如何控制这种mRNP的翻译、定位和降解。

在过去的十年中，人们已经清楚，真核细胞中的非翻译mRNP通常会聚集成保守和动态的细胞质mRNP颗粒，称为P-体和应激颗粒(埃里克森和莱克·安德森，2011年;安德森和凯德莎，2009年;Buchan和Parker，2009年). 当翻译起始受到限制时，通常会观察到应激颗粒，应激颗粒由与一些翻译起始因子和RNA结合蛋白相关的mRNA组成，因此被认为是翻译起始过程中停滞的mRNP池(安德森和凯德莎，2009年;Buchan和Parker，2009年). P-体由与翻译阻遏物和mRNA衰变机制相关的mRNA组成，虽然通常在细胞中以适度水平存在，但当非翻译mRNP的池较大时，它们会增加(Parker和Sheth，2007年).

P-体和应激颗粒很有意思，因为它们与许多重要的细胞过程有关，包括正常的mRNA降解(Sheth和Parker，2003年)，无意义介导的衰变(Sheth和Parker，2006年;Franks等人，2010年)，miRNA功能(Bhattacharyya等人，2006年;Leung等人，2006年)，病毒复制(贝克汉姆和帕克2008)、和蜂窝(Arimoto等人，2008年;高原和前田，2012年). 此外，P-体和应激颗粒与神经元中的mRNP颗粒有关，mRNP颗粒参与突触处的信使核糖核酸运输和翻译控制，与胚胎发生中的mRNP颗粒有关，其中母体信使核糖核酸被储存(安德森和凯德莎，2009年;Buchan和Parker，2009年).

最近，一些退行性疾病中出现了应激颗粒。例如，肌萎缩侧索硬化（ALS）、额颞叶变性（FTLD）、脆性X综合征、脊髓小脑共济失调-2、包涵体肌病（IBM）和多系统蛋白病（MSP）等疾病可能是由已知应激颗粒蛋白的突变引起的，这些蛋白往往会增加聚集的趋势(伊藤和铃木，2011年;Didiot等人，2009年;Nonhoff等人，2007年;Kim等人，2013年). 此外，ALS、FTLD和其他一些退行性疾病的一个特征是含有多种应激颗粒因子和RNA的细胞质聚集体的积累(杜威等人，2012年;伊藤和铃木，2011年;金斯伯格等人，1998年). 这导致了一种假设，即应激颗粒或某些相关mRNP聚集物的不当形成或持续存在可能与这些疾病的发病机制有关。有趣的是，含缬氨酸蛋白（VCP）的突变会导致ALS、FTLD和MSP，其特征都是TDP-43和在某些情况下其他应激颗粒蛋白在细胞质聚集体中的病理积聚(Johnson等人，2010年;Salajegheh等人，2009年;Kim等人，2013年)增加了VCP参与应力颗粒动力学的可能性。

应力颗粒和P体的形成基于两个原则。首先，它们的组装需要非翻译RNA。其次，单个mRNP通过mRNP结合蛋白上的二聚或聚集结构域聚集在一起。例如，酵母中P-体的组装部分由Edc3蛋白上的二聚结构域和Lsm4蛋白上的“朊病毒结构域”驱动(Decker等人，2007年;Reijns等人，2008年). 同样，TIA1蛋白上的朊蛋白结构域促进哺乳动物细胞中应激颗粒的形成(Gilks等人，2004年)和mRNA结合蛋白通常包含这种易于聚集的朊蛋白样结构域或低复杂性结构域(Decker等人，2007年;Kato等人，2012年;Kim等人，2013年). RNA结合蛋白中这种聚集域的普遍存在是其在形成应激颗粒和P-体中正常作用的一部分，这表明它们为产生病理聚集蛋白的突变提供了重要靶点。

鉴于应激颗粒和P-体的生物学作用，以及它们与退行性疾病的联系，一个重要的目标是了解控制应激颗粒和P体从细胞中组装、分解和清除的机制。为了确定参与调节这些mRNP颗粒的蛋白质，我们在面包酵母确定改变应激颗粒或P-体的突变。我们在正常生长条件下而非应激条件下检测了酵母突变体，因为这使我们能够更好地区分产生构成应力颗粒或升高P-体的突变，可能是由于分解或清除机制的缺陷所致。我们鉴定了100多个影响应激颗粒和/或P-体的高度互联的基因。其他分析提供了证据，证明这些mRNP颗粒的清除受自噬和Cdc48/VCP功能的影响，从而确定了从细胞中清除这些集合物的新机制，这也可能在清除哺乳动物细胞中的有毒RNP以限制病理学方面发挥作用。

结果

影响P-体和应激颗粒组装的蛋白质的鉴定

基于显微镜的4249个非必需基因缺失筛查(表S2)英寸酿酒酵母用于确定缺失改变P-体或应激颗粒组装的基因。对于该筛选，将应激颗粒组分Pab1-GFP和P-体组分Edc3-mCh引入到着丝粒质粒上的每个菌株中。在P-体较小的良好生长条件下对每个突变菌株进行显微镜检查，使我们能够检测到P-体的增加和减少，并且几乎完全没有应力颗粒，从而使我们能够识别具有本构应力颗粒的突变菌株。

我们鉴定了125个突变体，这些突变体具有可复制的应激颗粒和/或P-体表型（见下文）。对于每个突变体，通过重复实验验证表型，通过PCR和测序分析验证基因缺失。在屏幕删除点击的子集中，Pab1-GFP的表达水平仅显示出适度的变化，因此观察到的表型通常不太可能是由于颗粒蛋白表达水平的改变(图S1). 表型对应激颗粒和P-体的影响以及表型的严重程度不同（总结于表S1和表S3; 中的示例图1A)包括与P-体相关的应激颗粒增加（81个基因）、不同于P-体的应激颗粒增多（20个基因），P-体增加（28个基因）和P-体减少（23个基因）以及Pab1和Edc3的肺泡内积累（1个基因）。这些子类别总计超过125个，因为一些突变体具有多个表型。在大多数情况下，观察到的Pab1-GFP病灶包含另一种应力颗粒成分Pub1-mCh，表明它们代表应力颗粒(图S2).

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图1

影响应激颗粒和P-体组装的基因筛选综述

A.）典型的筛查表型（对数增长）。Pab1-GFP和Edc3-mCh分别作为应激颗粒和P-体标记物。P-体局部应力颗粒示例(rtc2Δ、cho2Δ和rlf2Δ)，增加了P-body(pgd1Δ)P体减少(rp28bΔ)如图所示。B.）125次按GO-术语分类的屏幕点击。C.）对屏幕点击的已知物理和遗传联系进行网络分析。另请参见图S3和表S1.

根据GO术语分析，我们筛选出的125个基因表现出不同的功能(图1B)，但网络分析显示，由100/125次屏幕点击形成的一个显著互联的遗传和物理网络，包括448个非冗余连接(图1C; P值5.34×10⁻⁶，参见实验程序）。这些相互联系表明，这些因素形成了一个以前未知的调节mRNP颗粒形成的网络。

几个突变体映射到酵母细胞中的特定复合物或通路，通常在每个分组中具有相似的表型(图S3A,表S1). 例如，THO和TREX-2复合物中的多个缺陷(高功率1Δ,mft1型Δ,第三囊Δ,thp1Δ，thp2Δ和tho2型Δ）在转录与mRNA输出之间起耦合作用，显示出结构性应力颗粒，并且在较小的Pab1细胞核聚积亚群中。类似地，prefoldin复合体三个亚单位的突变(吉米4Δ,功率因数1Δ,万向节5Δ）使P体减少(图S3A). 在最后一个例子中，我们观察到液泡ATP酶复合物的五个亚单位的缺失(vma11型Δ,vma16型Δ,vma2型Δ,vma4型Δ和vma3型Δ），一名陪同人员需要进行集会(vma21型Δ）增加了应力颗粒(图S3A). 由于Vma1亚单位最近被鉴定为mRNP结合蛋白，液泡ATP酶可能通过直接接触mRNAs影响应激颗粒动力学（Mitchell等人，2013），我们观察到Vma2在应激条件下与P-体和应激颗粒共定位(图S3B). 另外，空泡ATP酶可能通过改变膜动力学影响应激颗粒，从而影响自噬(Yamamoto等人1998年;Mijaljica等人，2011年; 见下文）。

酵母应激颗粒和P-体可以作为自噬的靶点

一个重要的结果是，一些破坏自噬的突变(第8天Δ,第11天Δ,第18天Δ,周一Δ，以及甲醚1Δ）增加了本构应力颗粒，这通常与P体有关(图2A,表S1). 此外，我们观察到Pab1-GFP和Edc3-mCh在肺泡内隔室（称为IVC）中的积聚第15页Δ突变体(图2A). 此外，在第15天Δ还包含应力颗粒的其他成分，包括Pbp1、Ded1和Pub1(图S4). 这与Atg15是一种液泡脂肪酶的事实一致，它有助于从自噬运输途径中打破靶向液泡的囊泡(Teter等人，2001年). 这些观察结果表明，应激颗粒和P-体可以通过自噬靶向液泡，因此在自噬缺陷菌株中，应激颗粒和P-体在胞质溶胶中积累，或者在自噬囊泡分解的后期步骤有缺陷时在液泡内积累，如在第15天Δ应变。

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图2

一些自噬和Cdc48复合因子表现出应激颗粒表型

A.）缺乏自噬因子的对数生长菌株表现出应激颗粒和P-体蛋白的积累和/或错误定位。在非允许温度下，W303株背景ts等位基因Cdc48、Ufd1和Npl4相对于WT表现出增加的应激颗粒。数字表示基于3个独立实验的每个应变中应力颗粒焦点/细胞的平均数量。另请参见图S4和表S5.

与此解释一致，在野生型细胞中，我们观察到Pub1-mCh或Edc3-mCh病灶与Atg11-GFP或Atg19-GFP之间存在少量共定位(图S5-S6,表S5). Atg11和Atg19都有助于将货物蛋白装载到吞噬细胞组装位置的自噬囊泡中(尤里米苏和克林斯基，2005年)同时，Atg19也被纳入到目的地为液泡的自噬体中。鉴于自噬受损可能导致应激颗粒/自噬中间产物的大量积累，我们进一步检测了Pub1-mCh和Atg19-GFP在一个组织中的共定位周一Δ应变（在自噬体/液泡融合之前会损害自噬）和第15天Δ应变（导致IVC）。重要的是，我们看到Pub1与Atg19在周一Δ背景，还可以观察到Atg19与Pub1在IVC中的明确共定位第15天Δ背景(图S6,表S5)认为共同定位是应激颗粒与自噬体短暂相互作用的结果，自噬小体靶向液泡。

我们还观察到，应力颗粒在ubx2型Δ应变，而虚拟机1Δ应变显示P体减少(表S1). Ubx2和Vms1都与Cdc48相互作用，Cdc48是VCP的酵母同源物，是一种能促进自噬的AAA-ATP酶(Krick等人，2010年;Meyer等人，2012年)包括以大核糖体亚单位为靶点进行核糖体吞噬(Ossareh-Nazari等人，2010年). 这些观察结果表明，Cdc48在靶向应激颗粒和/或P-体进行自噬方面可能也很重要。为了测试这种可能性，我们检测了Cdc48的一个条件等位基因对先前描述的自噬缺陷的影响(Krick等人，2010年)酵母细胞中应激颗粒的积累。我们观察到，在限制性温度下，Cdc48失活导致应激颗粒的强烈积累，这表明Cdc48在应激颗粒清除中发挥作用(图2B). 虽然表型没有Cdc48等位基因强，但我们也观察到Cdc48相互作用蛋白Ufd1和Npl4的条件等位基因中应激颗粒增加(图2B;表S5)提示这些蛋白也可以影响应激颗粒的动力学。

上溢试验确定了将应激颗粒靶向液泡的途径

Cdc48蛋白能以多种方式影响应激颗粒动力学。Cdc48利用ATP水解的能量重排含有泛素化蛋白质的复合物(Stoltz等人，2011年)，并能将蛋白质靶向蛋白酶体（例如。Meyer等人，2012年;Stoltz等人，2011年)以及促进自噬(Krick等人，2010年;Meyer等人，2012年;Ossareh-Nazari等人，2010年). 为了确定Cdc48是否影响mRNP颗粒的自噬，我们研究了Cdc48或其他自噬基因的失活如何影响含应激颗粒或P-体标记物的IVC的形成第15天Δ应变。如果应激颗粒和/或P-体的自噬需要Cdc48，我们预计Cdc48激活后包含这些成分的IVC会减少第15天Δ应变与第15天仅Δ。相反，如果Cdc48通过一种不相关的机制影响应激颗粒，那么在Cdc48活性失活后，下腔静脉室应保持不变。

这一分析第15天Δ双突变体揭示了两个重要的观察结果。首先，我们观察到ATG8、ATG11或MON1的缺失促进自噬(Wang等人，2002年;尤里米苏和克林斯基，2005年)，显著减少了第15页Δ背景(图3A-B). 第二，我们观察到温度敏感型Cdc48-3等位基因导致IVC水平在限制温度变化一到两个小时后显著而渐进地降低，而IVC水平则在限制温度下变化一个小时或两个小时第15天Δ对照细胞在相同条件下实际略有升高(图3C-D). IVC水平在cdc48-3 atg15温度变化前的Δ应变，可能表明功能部分丧失，应力颗粒相对更丰富第15天Δ控制细胞，与Cdc48在清除中的作用一致。我们对这些观察结果的解释是，应激颗粒可以在依赖自噬机制和Cdc48的过程中靶向液泡。此外，由于Cdc48活性的失活减少了IVC在第15页Δ应变，这表明Cdc48增强了应激颗粒对自噬的靶向性。

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图3

Atg15诱导的IVC因自噬途径和Cdc48的上游突变而减少

A.）BY4741背景菌株处于早期稳定阶段。IVC存在于atg15Δ自噬因子在自噬体-泡膜融合时或融合前的二次突变降低了菌株的数量。B.）A中数据的定量，基于3个独立实验的平均值+/-标准差。P值（*=<0.05，**=<0.005）相对于atg15Δ表明。C.）W303菌株背景，在34°C中暑0、1或2小时后的早期稳定阶段进行检查。Cdc48失活导致atg15缺失导致IVC减少。D.）基于至少3个重复实验+/-标准偏差P值的C、平均值数据定量，如上所示。另请参见表S5.

当去盖被抑制时，自噬对RNP颗粒的靶向性增加

应力颗粒和可能的P-体被靶向自噬提供了调节这些结构清除的另一种机制。这是除了翻译起始之外的，翻译起始可以通过促进mRNAs恢复翻译来减少P-体和应激颗粒(Brengues等人，2005年;Bhattacharyya等人，2006年)以及去盖和5'至3'降解，这可以减少P体内的mRNA(Sheth和Parker，2003年). 由于这些RNP颗粒可能有多种命运，这表明其中一种途径的减少会增加其他途径。例如，我们假设去盖或5'至3'外核降解减少，导致P体、应激颗粒和非降解mRNA的积累(Sheth和Parker，2003年;Buchan等人，2008年)可能导致mRNP进入自噬的流量增加。为了验证这一预测，我们分析了第15天Δ承载xrn1号机组去盖酶的Δ缺失或温度敏感等位基因(dcp2-7型). 与第15页Δ应变，我们观察到具有下腔静脉室的细胞数量增加，下腔静脉的相对大小和强度增加xrn1Δatg15Δ应变，以及dcp2-7atg15型转变到限制温度后的Δ应变(图4). 这一观察提供了额外的证据，表明应激颗粒可以作为自噬的靶点，并表明当mRNA去盖被阻断，细胞积累了更多的RNP颗粒时，这一途径会增加。

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图4

细胞质mRNA衰变受损增加IVC颗粒蛋白的积累

A.）RP840背景菌株处于早期稳定阶段。温度变化的菌株在37°C下放置1hr（下一排）。B.）A中数据的定量，基于至少3个重复实验的平均值+/-标准差。P值（*=<0.05，**=<0.005）相对于atg15Δ表明。另请参见表S5.

自噬对哺乳动物细胞应激颗粒清除的影响

P-体、应激颗粒和自噬过程的保存意味着mRNP颗粒也将成为其他真核细胞自噬的靶点。该模型预测，抑制哺乳动物细胞中的自噬将导致本构应力颗粒的积累，并会降低应力消除后清除这些颗粒的速度。为了测试这种可能性，我们检测了在无应力和缓解应力后ATG7纯合缺失的MEF中的应力颗粒。

对内源性应激颗粒成分的检查显示，有两个观察结果表明，自噬影响应激颗粒清除率。首先，在没有任何应激的情况下，我们观察到atg7−/−MEFs显示具有清晰可见应激颗粒的细胞百分比较小但一致，而相应的野生型MEFs细胞没有显示具有应激颗粒的电池(图5A，D-E); 在atg3−/−MEF系中也观察到类似的结果(图S7C). 第二，我们观察到，虽然在野生型和atg7−/−MEF中，应力颗粒在热冲击响应下强烈形成(图5B、D)，当温度恢复到37°C时，大多数应力颗粒从野生型MEF中清除，同时在7−/−MEF中持续2小时(图5C-D). 这些观察结果表明，哺乳动物细胞中至少有一部分应激颗粒被自噬清除。与这种解释一致，我们观察到促进自噬的药物（雷帕霉素或3-MA；Wu等人，2010年)提高亚砷酸盐应激颗粒的清除率(图S7A、B). 相比之下，自噬抑制剂沃特曼宁可减弱应激颗粒清除(图S7A、B).

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图5

哺乳动物的应力颗粒清除因自噬缺陷而受损

A.）atg7−/−MEF显示，即使在没有外源性应激源的情况下，细胞水平也很低，具有清晰可见的应激颗粒。B.）在43°C下热冲击1hr，导致WT和atg7−/−MEF中形成强大的应力颗粒。C.）从43°C变回37°C后，野生型MEF中的应力颗粒在几分钟内清除，但在atg7−/−MEF中持续检测（2小时）。比例尺等于10μm。D） A-C中数据的定量，平均值基于至少3个重复实验+/-SEM。E）实时定量PCR验证野生型和atg7−/−MEF中atg7的表达水平。另请参见图S7.

VCP对哺乳动物细胞应激颗粒清除的影响

Cdc48对酵母中应激颗粒的影响表明，哺乳动物同源VCP可能在应激颗粒清除中起作用。为了验证这一假设，我们通过siRNA或化学抑制VCP活性来耗尽哺乳动物细胞中的VCP功能，并检查了热休克和恢复期间应激颗粒的形成和清除。我们观察到，无论是siRNA敲除(图6A-D)或对HeLa细胞中VCP的化学抑制(图6E-F)导致应力颗粒清除率显著降低，表明VCP是哺乳动物细胞有效清除应力颗粒所必需的。此外，由于内源性VCP在不同的胁迫条件下（热应激、渗透应激、氧化应激；图7A)最简单的模型是VCP直接作用于应力颗粒以促进其清除。

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图6

VCP对应力颗粒清除至关重要

A.）通过免疫荧光检测应激颗粒标记物G3BP的HeLa细胞。用非靶向siRNA处理的细胞在43°C（2hrs）热休克时表现出应力颗粒聚集，并在恢复到37°C时迅速清除应力颗粒。用VCP-靶向siRNA处理的细胞显示出正常的应力颗粒组装，但这些应力颗粒在回到37°C（2小时）后无法清除。比例尺等于10μm。B.）量化A中的数据，平均值基于至少3个重复实验+/-SEM.C）。和D.）Western blot和定量A细胞中VCP蛋白水平，平均值基于至少3次重复实验+/-SEM.E.）通过免疫荧光检测应激颗粒标记物TIAR和eIF3b的HeLa细胞。VCP化学抑制剂的预处理会损害应激颗粒的清除。用载体（DMSO）或特异性抑制剂Eer1处理细胞（每个细胞用8μM Eeyarestatin I预处理4小时Wang等人，2010年); DBeQ（根据Chou等人，2011年); ML240（根据Chou等人，2013年). 比例尺等于10μm。F.）量化E中的数据，平均值基于至少3个重复实验+/-SEM。

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图7

VCP被征募用于应激颗粒，VCP中的致病突变诱导含有疾病蛋白TDP-43的构成性应激颗粒

A.）对HeLa细胞进行内源性VCP和应激颗粒标记物eIF4G染色。VCP被招募用于三种不同刺激诱导的应激颗粒：43°C热休克2小时，20μM克霉唑孵育1小时，或0.6M山梨醇孵育1h。比例尺等于10μm。B.）用表达野生型或突变型（A232和R155H）VCP-GFP的质粒转染HeLa细胞，并对其进行eIF3b和TDP-43染色。突变型而非野生型VCP的过度表达导致含有疾病蛋白TDP-43的结构性应力颗粒的形成。比例尺等于10μm。

VCP对哺乳动物细胞应力颗粒清除的需求增加了VCP致病突变可能损害应力颗粒动力学的可能性。事实上，包括ALS、FTLD和MSP在内的VCP相关疾病的特征都是应激颗粒成分TDP-43、hnRNPA1和/或hnRNPA2的细胞质内含物的积累(Neumann等人，2006年;Neumann等人，2007年;Salajegheh等人，2009年;Kim等人，2013年). 引人注目的是，我们观察到HeLa细胞过度表达VCP疾病相关突变A232E和R155H，显示出包含eIF3亚单位、TDP-43和VCP本身的应激颗粒的组成外观(图7D). 这些VCP病理等位基因中构成性应力颗粒的积累与以下假设一致，即受损的应力颗粒动力学可能是VCP突变引发的疾病以及RNA-结合蛋白TDP-43、FUS、，hnRNPA1和hnRNPA2B1。

讨论

在这项工作中，我们鉴定了100多个基因，这些基因参与调节酵母中的应激颗粒和/或P-体。这些蛋白质显示出密集的物理和遗传相互作用网络，表明它们揭示了以前未知的控制mRNP颗粒动力学的蛋白质网络。考虑到RNP颗粒在翻译和mRNA降解中的作用，这组蛋白质将包含与mRNA生物发生和功能有关的多种因素（Edc2、Lsm6、Mlp1、Pap2、Rnh70、Rpl35b、Rpl39、Rpl42a、Rps28b、Sto1、Tif3、Trm12、Sro9和Xrn1），这一点并不意外。令人惊讶的是，我们还观察到THO或TREX-2复合物中的缺陷导致了应力颗粒的构成，这可能是因为一些新输出的mRNA在进入翻译时存在缺陷。另一个有趣的突变体集中包括prefoldin复合物中的缺陷，该复合物减少了P小体，并可能反映出未能正确组装mRNP颗粒组装和贩运所涉及的细胞骨架结构(Aizer等人，2008年;Loschi等人，2009年). 还观察到影响各种信号通路（例如Kcs1、Cmk1、Mds3）和有趣的细胞过程（例如染色质修饰/组装-Gcn5、Hst1、Iki3、Isw1、Rlf2、Set2、Swc5、Swd3和Swr1）的突变。未来研究的一个重要领域将是了解这些蛋白质如何在分子细节上影响RNA颗粒动力学，以及这种异常组装的生理后果。

对这些突变体的分析提供了一些证据，证明酵母应激颗粒和P-体可以通过自噬作用靶向液泡(图S8)我们称之为颗粒吞噬。首先，在自噬体-泡膜融合前抑制自噬的突变积累了应激颗粒(图2)这与自噬过程不断清除应激颗粒相一致。其次，缺乏Atg15脂肪酶的菌株会分解液泡内的自噬小泡，在IVC中积累应激颗粒和P-体标记物，这与自噬囊泡在IVC内的积累相一致第15天Δ应变(图2). 第三，结合第15天自噬早期阻滞的Δ缺失减少了IVC中应激颗粒和P-体标记物的积累，并经常增加应激颗粒的细胞质积累(图3). 第四，当去盖或5'至3'mRNA降解被抑制，导致mRNP颗粒水平增加时，我们观察到在IVC内应激颗粒标记物的积累更大第15天Δ应变(图4). 这表明，在缺乏正常水平的mRNA降解的情况下，RNP颗粒的自噬靶向性增强。综上所述，我们得出结论，应激颗粒和P-体，以及其中的mRNA可能通过自噬作用靶向液泡。

一些观察结果表明，酵母应激颗粒比P-体更容易成为自噬的靶点。首先，自噬缺陷突变体的应激颗粒比P-体增加得更多(表S1). 第二，英寸dcp2-7型和xrn1号机组Δ突变体显示P-体和应激颗粒的积累，我们发现应激颗粒标记Pab1在液泡中的积累大于P-体成分Edc3(图4). 第三，我们迄今为止的分析确定了四个已知的应力颗粒因子第15天ΔIVCs（Pab1、Pub1、Pbp1和Ded1–图S5)而只有Edc3被观察到处于中等水平；IVC中未检测到Dcp2和Lsm1（未显示数据）。一个可能的模型解释了应激颗粒在自噬靶向中的偏倚，即P体中的mRNP也可以降解，或者可以通过mRNP重塑进入应激颗粒(Buchan等人，2008年). 因此，如果自噬与这些事件相比通常较慢，那么大多数mRNP在成为自噬靶点之前将转变为应激颗粒型mRNP。

一些观察结果表明，应激颗粒通过自噬作用靶向降解细胞器在真核生物（包括哺乳动物）中是保守的。首先，自噬缺陷的MEF显示出低水平的本构应力颗粒，这与应力颗粒分辨率的缺陷一致(图5A,图S7C). 其次，atg7−/−MEF在消除热应激后清除应激颗粒方面存在缺陷(图5B-D). 第三，我们观察到3-MA和较小程度的雷帕霉素可以刺激自噬(Wu等人，2010年)，增加氧化应激缓解后应激颗粒清除的速度(图S7A、B). 相反，沃特曼宁对自噬的抑制减缓了应激颗粒的清除速度(图S7A、B). 第四，通过酵母突变或哺乳动物细胞的药物作用抑制空泡ATP酶功能，导致SG增加(表S1,表S5,图S7D). 这是相关的，因为空泡ATP酶与广泛的囊泡贩运事件有关，通常与质子泵活动无关，包括哺乳动物自噬体与溶酶体的成熟和融合(Klonsky等人，2008年)，真空-针孔融合(Peters等人，2001年)和吞噬体-溶酶体融合(Peri和Nusslein-Volhard，2008年). 最后，在秀丽线虫已有研究表明，P颗粒是与应激颗粒和P小体相关的RNP颗粒，可以通过自噬从卵裂球中清除(Zhang等人，2009年).

应力颗粒和P-体的自噬降解为积聚在这些结构中的mRNP提供了额外的命运。这种命运可能对应激颗粒内的mRNP特别重要，这些mRNP也可以恢复翻译，并可能在调节应激反应中发挥重要作用，特别是在长期应激期间，其中，与应激颗粒相关的mRNP无法恢复翻译，可能会以液泡/溶酶体为基础进行降解。此外，该途径提供了一种新的机制，真核生物mRNA可以通过该机制降解，人们预计，对于mRNA的一个子集来说，这是一种普遍的降解途径。事实上，这种途径可以解释为什么基于miRNA的mRNA降解会受到膜流量变化的影响，因为基于miRNA的抑制机制与内体区室有关(Gibbings等人，2009年). 与此相关的是，Ago2和Dicer似乎是选择性自噬的靶点，从而对基于miRNA的抑制产生影响(Gibbings等人，2012年).

一些观察结果还表明，Cdc48及其哺乳动物同源VCP在应力颗粒清除中起作用。首先，Cdc48的温度敏感等位基因以及相关Ubx2、Npl4和Ufd1蛋白的突变显示了应激颗粒的积聚(图2,表S1). 其次，使用siRNAs或VCP抑制剂的组织培养细胞中VCP活性的缺失会导致应激颗粒的清除缺陷(图6). 第三，VCP的致病性突变导致培养细胞中应激颗粒的组成性积累(图7)含有TDP-43，是ALS、FTLD、IBM和MSP患者病理性细胞质内含物的主要定义成分(Neumann等人，2006年;Neumann等人，2007年;Salajegheh等人，2009年;Kim等人，2013年). 综上所述，这些观察结果表明，CDC48/VCP是有效清除应力颗粒所必需的，这种功能可能与其在病理中的作用有关。

一个尚未解决的作用是Cdc48/VCP在应力颗粒清除中的特异性功能。因为Cdc48功能的抑制减少了血管内皮细胞中应激颗粒的存在第15天Δ背景(图3)我们认为，Cdc48在酵母中的部分功能是促进这些mRNP颗粒的自噬。泛素化可能参与调节应激颗粒和P-体动力学，因为Cdc48/VCP利用ATP水解从多种细胞复合体中分离泛素化蛋白(Stolz等人，2011年)，哺乳动物细胞中的应激颗粒严重泛素化(Kwon等人，2007年)我们观察到，功能未知的E3泛素连接酶Hel2的缺失导致应激颗粒增加(表S1). 此外，VCP通过其已知的结合伙伴HDAC6促进泛素化蛋白聚集体的自噬清除，HDAC6自身结合泛素化蛋白质，并调节哺乳动物细胞中的应激颗粒组装(Ju等人，2008年;Kwon等人，2007年). 由于VCP积聚在应力颗粒中(图7)一种可能的模型是，Cdc48/VCP复合物作用于应激颗粒的某些泛素化成分，以促进RNP颗粒的分解和/或靶向自噬的方式改变mRNP复合物。然而，泛素也可能通过蛋白酶体影响应力颗粒动力学，因为我们发现PRE9和POC4基因的突变会影响蛋白酶体功能，增加构成性应力颗粒(表S1)以及抑制哺乳动物蛋白酶体活性诱导应激颗粒(Mazroui等人，2007年).

我们的观察对理解RNP聚集体在某些退行性疾病中的作用具有重要意义。首先，将应激颗粒靶向液泡/溶酶体进行降解意味着，在某些退行性疾病（如ALS、FTLD、IBM和MSP）中积累的这些颗粒的异常形式也可能通过这一过程被清除。值得注意的是，TDP-43是ALS、FTLD和MSP中最常见的病理性细胞质内含物成分，优先通过自噬清除(Wang等人，2010年;2012). 与这一概念相一致，最近研究表明，在酵母神经退化模型系统中，Cdc48失活也能增强TDP-43的毒性(Armakola等人，2012年). 因此，增强应激颗粒和相关RNP聚集体自噬的机制可能具有治疗各种退行性疾病的潜力。

这些结果也加强了以下假设：ALS、FTLD和一些相关的病理学是由于应激颗粒的过度形成或稳定引起的。观察结果首次表明，应激颗粒组分TDP-43、FUS、hnRNPA1、hnRNPA 2和Atx2的突变增强了它们的自组装或聚集，可能导致这些疾病，并导致应激颗粒或相关RNP聚集物在模型系统和患者组织中的积聚(Kim等人，2013;杜威等人，2012年;2011年伊藤和铃木). 引人注目的是，VCP突变导致的病理谱与这些RNA结合蛋白中的聚集倾向性突变相同。鉴于VCP/Cdc48在应激颗粒清除中的作用，以及VCP中的病理突变导致应激颗粒的构成，我们认为VCP突变和RNA结合蛋白中的超聚集突变的病理学相似，因为它们都导致应激颗粒积聚和/或持续存在。这也增加了一种令人兴奋的可能性，即我们在酵母中发现的导致构成应力颗粒形成的突变可能会识别出候选基因，当人类发生突变时，这些候选基因有助于哺乳动物细胞和退行性疾病中构成应力粒的形成。

实验程序

补充材料

致谢

脚注

参考文献