肝损伤的结果取决于修复反应的效率，即用健康的肝实质替换受损的肝组织。慢性肝损伤的修复缺陷会导致肝硬化，这是一种以肝脏细胞组成发生剧烈变化为特征的瘢痕状态。在瘢痕形成过程中，祖细胞和肌成纤维细胞（MF）的过度生长尤为突出(1)由于这些细胞类型对受损肝脏的成功再生至关重要(1,2)它们在肝硬化中的积累表明，瘢痕形成可能是因为再生机制过早停滞。因此，为了恢复健康的伤口愈合，有必要确定调节肝脏修复所需细胞命运的关键信号的特征并确定其优先级。
受损成人肝脏的重建利用几个高度保守的信号通路，在胎儿发育过程中协调器官发生，包括Wnt、Hedgehog（Hh）和Notch。(三)在胚胎发生过程中，这些途径相互作用，调节其靶细胞的存活、增殖和分化，以便发育器官适当地充满组织特异性功能所需的所有细胞类型。例如，Hh和Notch之间的串扰控制胚胎干细胞的命运(4)斑马鱼神经祖细胞(5)和果蝇眼睛前驱体。(6)在癌症生物学中，Hh和Notch之间的细胞自主串扰的重要性也正在显现。Notch和Hh信号通路的过度表达发生在化疗耐药肿瘤干细胞亚群中，靶向Notch和Hh耗尽了该人群。(7)然而，当受损的成人肝脏再生时，是否会发生类似的串扰，涉及哪些细胞类型，以及在缺陷修复过程中这种信号是否会被解除管制，尚不清楚。同样不确定的是，受损成人肝脏中这些新发现的途径是否/如何符合肝硬化发病的经典模式，以及它们在这一过程中是否比成熟的成人肝脏生长调节剂，如转化生长因子β（TGF-β），这通常被认为是导致成人肝脏修复缺陷的原因。(1)
因此，本研究的目的是研究Notch信号是否以及如何调节肝MF损伤相关的生长。我们将重点放在来源于HSC的MF上，因为成人HSC是TGF-β反应性细胞，也受发育形态发生途径（如Wnt和Hh）的影响，后者在成人肝脏修复过程中重新激活。成人HSC需要Hh信号成为并保持MF(8)最近对肝脏受损的成年小鼠进行的血统追踪研究表明，一些MF成为多能祖细胞，再生肝细胞、胆管细胞和HSC。在平行实验中，Cre重组酶介导的对表达MF基因的细胞中典型Hh信号的敲除，即α-平滑肌肌动蛋白（ASMA），在胆汁淤积性肝损伤期间阻止MF积累并抑制导管细胞的生长。(9)Hh通路调节的自分泌和旁分泌信号可能都参与其中。例如，已知Sonic hedgehog配体可以促进Jagged-1的转录(10)MF-derived Jagged-1被认为以旁分泌方式促进Notch反应性肝祖细胞的导管分化。(2)以前的工作表明HSC本身也可能具有Notch信号。(11)最近，Chen等人报道了DAPT，一种阻断Notch信号传导的γ-分泌酶抑制剂，降低了大鼠HSC系（HSC-T6）中各种MF基因的表达。(12)他们还发现DAPT抑制CCl4-结果显示，TGF-β、蜗牛和各种间充质基因的肝脏表达降低，但E-钙粘蛋白上调，表明阻断Notch可促进间充质-上皮转化。(13)然而，早期对培养的HSC的研究表明，Notch-1和Hes1的诱导与ASMA表达和增殖的抑制相关，并且表明敲低Notch-1的表达可以促进HSC的生长。(14)
实际上，Notch对MF分化和生长的影响是复杂的，并且似乎因MF前体的类型而异。Notch信号抑制成肌细胞前体和某些类型成纤维细胞的肌纤维母细胞分化。(15,16)相反，它增强了肺MF前体的MF分化(17)气道上皮细胞(18)皮肤成纤维细胞。(19)激活Notch还可以促进肾细胞的上皮细胞向间充质细胞转化(20)以MF为代价刺激心脏祖细胞的扩张(21)并促进上皮-间充质转化过程，增强肿瘤干细胞的干样特性。(22)
Notch信号在发育过程中对胆道形态发生至关重要。(23–25)如前所述，成人肝祖细胞的命运也由Notch决定：增加Notch信号传导促进胆道谱系的分化，而抑制Notch途径使祖细胞向肝细胞命运转移。(2)去调节的Notch信号与肝细胞癌和胆管癌的发病机制有关。(26,27)尽管越来越多的证据表明Notch通路参与肝癌和纤维化，但尚不清楚Notch如何与其他与这些疾病相关的关键信号通路相互作用，或者Notch信号如何在一种类型的肝细胞（例如MF）中传递可能影响成人肝脏修复所需的其他类型肝细胞（例如上皮祖细胞）的积累。
在本研究中，我们评估了以下假设：HSC中的Notch通路激活通过一种涉及上皮-间质样转变的机制刺激他们成为（并保持）MF，这种转变需要与典型（即TGF-β非依赖性）Hedgehog信号相互作用。
材料和方法
完整方法可用于补充材料/方法.
动物
雄性C57BL/6小鼠和烟雾tm2麦克/J（Smo/flox）小鼠取自Jackson实验室（ME Bar Harbor）(28). Smo/flox小鼠与ASMA-Cre-ER杂交T2段转基因小鼠(29)生成双转基因（DTG）小鼠，用三苯氧胺治疗可诱导ASMA阳性细胞中Smo的条件性缺失。(9)8-12周龄小鼠接受胆管结扎（BDL）或假手术14天。其他8-10周龄野生型小鼠采用高脂肪饮食喂养，并腹腔注射载体（橄榄油）或CCl4（1μL/g体重，在橄榄油中预稀释1:3）每周两次，持续2周，并在最后一次CCl后72小时处死4注入。(30)动物实验符合美国国立卫生研究院和杜克大学机构动物护理和使用委员会对人道动物护理的要求。
免疫组织化学
制备福尔马林固定、石蜡包埋的肝脏用于免疫组织化学。(9)使用的协议和抗体列于补充材料/方法.
分子技术
如前所述进行qRT-PCR和免疫印迹。(31)
细胞隔离
采用标准方法从C57BL/6小鼠中分离出原代HSC。按照描述对制剂的纯度进行了严格分析。(9)
Notch和Hh信号传导的药理学操作
第4天，用γ-分泌酶抑制剂DAPT（10μM，Sigma-Aldrich，St Louis，MO）或平滑激动剂GDC-0449（1μM，Selleck Chemicals，Houston，TX）处理原代HSC培养物3天。对照组用二甲基亚砜治疗。603B细胞以同样的方式处理2天。
统计
结果表示为平均值±SEM。分析使用Studentt吨测试。P（P）<0.05被认为是显著的。
结果
肝损伤时Desmin表达细胞中Notch信号的激活
我们在小鼠BDL模型中发现Notch-2、Jagged-1和几个Notch靶基因（Hes1、Hey1、Hey2和HeyL）的mRNA上调()与之前的报告一致，成人肝损伤激活Notch信号。(2,23)除了导管细胞（已知的Notch靶点）(23)，基质细胞在BDL后表达Notch-2、Jagged-1和Hey2(,补充图1A). 其中一些基质细胞与HSC标记物Desmin共同染色，表明MF-HSC在肝损伤期间发生激活的Notch信号。定量免疫组织化学显示，约60%的Desmin（+）细胞共表达Notch-2和/或Jagged-1，30%的细胞共表达Hey2。从BDL小鼠分离的HSC的FACS分析证实了这些发现，与假对照组的HSC相比，其Notch-2、Jagged-1和Hey2增加(,补充图1B).
肝损伤增加Desmin表达基质细胞的Notch信号（A） 假手术或BDL手术后14天WT小鼠肝脏总mRNA的qRT-PCR分析，以检测Notch通路基因的表达*p<0.05与sham，n=4。（B） BDL小鼠肝脏中Notch-2、Jagged-1或Hey2（棕色）与Desmin（绿色）的双重免疫组化显示这些标记物的共同定位（插图）。在10个随机选择的字段中，还量化了Desmin+细胞中双阳性细胞的百分比*p<0.001与sham，n=3只小鼠/组。（C） 假手术或BDL手术后14天从WT小鼠分离的HSC的FACS分析ASMA、Notch-2、Jagged-1或Hey2的表达。Desmin被用作HSC的标记物。（D） 高脂饮食/CCl处理14天的WT小鼠肝脏总mRNA的qRT-PCR分析4.*p<0.05，**p<0.01与高脂肪饮食控制相比，n=3。（E） 高脂饮食/CCl中Notch-2、Jagged-1或Hey2（棕色）和Desmin（绿色）的双重免疫组化4小鼠肝脏显示这些标记物的共同定位（插入）。放大倍数×40。在10个随机选择的字段中，还量化了Desmin+细胞中双阳性细胞的百分比*p<0.001与.HF控制，n=3只小鼠/组。
我们还检查了用高脂肪（HF）饮食±CCl治疗的小鼠4持续2周以引起肝窦纤维化。与HF饮食喂养的对照组相比，用HF饮食/CCl治疗的小鼠4Notch-2、Jagged-1、Hes1、Hey1和Hey2以及导管标志物角蛋白19（Krt19）的mRNA表达增加(). 如门脉纤维化BDL小鼠所示()定量免疫组化也显示CCl小鼠Desmin-阳性细胞中Notch-2、Jagged-1和Hey2表达增加4-诱发窦性纤维化(,补充图1C).
HSC激活过程中Notch信号的上调在体外
虽然已经确定胆管细胞及其前体能够进行Notch信号传导(24,25,27)尚不确定原代HSC和/或其后代（例如MF-HSC）是否对Notch产生反应。因为免疫组织化学和FACS揭示了在纤维化肝脏中积聚的Desmin表达细胞中的Notch信号成分()，我们评估了Notch通路基因在原代小鼠HSC（新鲜分离的HSC和7天培养激活的MF-HSC）中的表达(). HSC的结果与小鼠导管细胞系（603B）的结果进行了比较，后者是Notch信号的阳性对照(). FACS显示，603B高水平表达胆管细胞标记物、Krt19、祖细胞标记物（Sox9、FN14和CD24）和Notch通路成分（Notch-2和Jagged-1），证实这些细胞是具有Notch信号功能的未成熟导管型细胞(). FACS同样显示HSC表达调节Notch信号的蛋白质，包括Notch配体、Jagged-1、Notch-1和Notch-2受体，以及Numb，一种Notch信号阻遏物(,补充图2A). QRT-PCR分析很容易证明这些因子的mRNA()而另一个Notch配体（Jagged-2）和其他Notch受体（Notch-3和Notch-4）的表达水平低得多(补充图2B).
在原发性HSC转分化期间激活Notch信号（A） 静止（新鲜分离，第0天）和肌纤维母细胞（培养第7天）HSC的FACS分析。结蛋白和α-平滑肌肌动蛋白（ASMA）分别用作静止或肌纤维母细胞性HSC的标记物。（B） 静态和肌纤维母细胞性HSC中Notch抑制剂（Numb）、受体（Notch-1和Notch-2）、配体（Jagged-1）和靶基因（Hes1、Hey1、Hey2和c-Myc）的qRT-PCR分析。结果与导管祖细胞（603B）中的基因表达进行比较，*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，n=3。
Notch-responsive肝祖细胞（603B）共同表达导管、肝细胞、HSC和间充质标志物（A） FACS分析证实603B是具有活跃Notch信号的小鼠导管祖细胞。灰色线表示同型对照。（B） 603B的FACS分析显示，其他导管标记物（Krt7和HNF6）、肝细胞标记物（HNF4α、AFP和白蛋白）、Hh信号因子/靶基因（Ptc、Gli1和Gli2）、间充质标记物（Vimentin和ASMA）和HSC-相关标记物（Desmin和GFAP）（C）也有表达通过qRT-PCR分析比较603B与原代小鼠肝细胞（mHep）和新鲜分离或培养激活的原代小鼠HSC（分别为d0 mHSC和d7 mHSC）的基因表达，n=3/组。#表示无法检测的信号。
与表达Notch-1和Numb蛋白的细胞相对富集的新分离（第0天）HSC相比，MF-HSC显示Notch-1与Numb的表达要低得多，但Jagged-1和Notch-2的表达要高得多(,补充图2A)与之前的报告一致，该报告显示在大鼠HSC培养激活期间Notch-1表达降低。(11)因此，在MF转分化期间，调节Notch信号的蛋白表达发生了重大变化。为了确定当静止（Q-）HSC转变为MF-HSC时，通路活性是否也发生变化，进行qRT-PCR分析以评估各种Notch靶基因（Hes1、Hey1、Hey2和c-Myc）的表达(). 在HSC激活期间，Hey2和c-Myc mRNA表达显著增加。Notch靶基因的诱导与Jagged-1和Notch-2 mRNA的上调同时发生，与Notch-1和Numb mRNA的下调同时发生。结果表明HSC在成为MF时激活Notch信号。有证据表明HSC中的几个Notch靶基因（Hes1、Hey1、Hey2）mRNA水平通常等于或高于具有公认Notch信号能力的导管型细胞中的水平，这一可能性得到了支持().
Notch反应性肝细胞的表型和基因型相似性
Notch调节双功能肝上皮祖细胞的命运(2,25)成年小鼠的血统追踪证据表明，双功能肝上皮祖细胞和HSC来源于受Hh途径控制的共同多功能祖细胞。(9,32)因此，可以想象，在肝损伤期间，Notch与Hh相互作用以指导成年祖细胞的分化。我们开始通过FACS进一步表征603B细胞来研究这个问题()，并使用qRT-PCR比较603B细胞、成熟肝细胞（原代小鼠肝细胞）和新鲜分离或培养激活的原代HSC中的基因表达().
FACS显示，尽管603B细胞中97-99%表达广为接受的导管祖细胞标记物（Krt19、Krt7、Sox9），但只有约三分之一表达胆汁相关转录因子HNF6。HNF4-alpha是一种肝细胞相关转录因子，约占50%，表明603B细胞能够沿着胆道和肝细胞谱系分化。与这一概念一致，几乎所有细胞（97-99%）都表达成肝细胞（也称为卵圆细胞）的既定标记，如CD24、FN14和白蛋白。超过80%的603B也表达假定的HSC标记物GFAP，这表明603B细胞可能具有多潜能（即能够分化为肝细胞、胆管癌和HSC）。事实上，603B中约三分之一的快速Desmin和约25%的ASMA阳性。导管、肝细胞和HSC标记物的共同表达发生在正在经历上皮-间质转化的Hh反应性多能干肝祖细胞中。(9)99%的603B共表达Krt7（上皮标记物）、波形蛋白（间充质标记物）和一个或多个Hh-靶基因（Ptc、Gli1、Gli2），显示处于上皮-间充质转化过程中的多潜能肝祖细胞表型().
QRT-PCR分析提供了额外证据，证明603B细胞是过渡型多能干肝祖细胞。与健康成年小鼠新鲜分离的原代肝细胞相比，603B表达的Hh靶基因（Ptc、Gli2）、胆管细胞相关基因（如Krt19和HNF6）和HSC相关基因（例如Desmin和GFAP）的mRNA水平显著升高，但HNF4-αmRNA水平明显降低，成熟肝细胞强烈表达的转录因子。据报道，过渡型多能祖细胞(9)与肝细胞相比，603B中的基因表达更类似于HSC。例如，原代HSC和603B表达Krt7、HNF6、AFP、Ptc和Gli2的可比mRNA水平。然而，603B组Desmin和GFAP的mRNA水平显著低于新鲜分离的HSC，并且当HSC经过培养激活成为MF时，这种差异会被放大(). 尽管如此，汇总数据显示Notch反应性肝细胞的基因型和表型相似性，并表明这些细胞具有Hh反应性和固有可塑性（即能够经历上皮-间充质转化）。
DAPT抑制祖细胞和HSC中的陷波信号在体外
为了研究Notch信号在HSC中的功能意义，通过用γ-分泌酶抑制剂DAPT处理培养的原代MF-HSC来抑制Notch通路。HSC的结果与多能干祖细胞（603B）的结果进行了比较，后者是Notch信号的阳性对照。正如预期的那样，603B的研究表明，DAPT治疗显著降低了Jagged-1、Notch-2和Notch靶基因（Hes1、Hey1和Hey2）的表达(). 603B中抑制Notch信号传导抑制了胆管细胞相关基因（Krt7、Krt19、HNF1β和HNF6）的表达，并允许诱导肝细胞谱系标记物（甲胎蛋白（AFP）、HNF1α和HNF4α），这与之前的报道一致，即Notch信号传导的激活驱动肝祖细胞向胆管谱系发展，而其抑制促进肝细胞系分化。(2,24,25)阻断603B中的Notch信号增强了Q-HSC标记胶质纤维酸性蛋白（GFAP）的表达，但减少了MF-HSC标记ASMA和TGF-β的表达，后者是促进发育中胚胎肝祖细胞导管分化的促纤维化细胞因子。(33)Blocking Notch还下调了603B中的关键刺猬靶基因Gli1和Patched（Ptc）。总的研究结果表明，Notch信号与多能干肝祖细胞中TGF-β和Hh途径转导的纤维生成信号相互作用。这一点特别有趣，因为TGF-β和Hh信号都能促进发育中胚胎的上皮-间充质转化(34)Hh已被证明可以刺激成年HSC和祖细胞中的上皮-间质样转变。(8,35)
抑制Notch信号抑制Hedgehog信号并促进导管型祖细胞的间质-上皮样转变和肝细胞分化用DAPT（γ-分泌酶抑制剂）处理603B 48小时后的qRT-PCR分析（a）Notch通路基因、（B）上皮/静止基因和（C）肌成纤维细胞（MF）/刺猬（Hh）基因的变化*p<0.05与二甲基亚砜对照，n=3。
在确认DAPT在Notch反应性肝祖细胞中的表现符合预期后，我们评估了其在HSC中的作用。在这些研究中，原代小鼠HSC培养4天以诱导MF转分化，然后用DAPT再处理3天。如603B()，MF-HSC显示DAPT抑制Notch-2、Jagged-1和几个Notch靶基因（Hey1、Hey2和HeyL）mRNA的表达(). 免疫细胞化学证实mRNA抑制伴随着蛋白表达降低(). MF-HSC中阻断Notch信号也抑制了典型的MF相关基因（ASMA、胶原和TGF-β）和已知由MF-HSC表达的Hh靶基因（Gli2，Ptc和Sonic Hedgehog，Shh）(). 相反，各种上皮基因（骨形态发生蛋白-7、促结蛋白、E-cadherin、AFP、HNF4α和Krt19）和Q-HSC标记物（过氧化物酶体增殖物激活物受体-γ、PPAR-γ和GFAP）的mRNA水平上调(). 免疫细胞化学证实DAPT诱导MF-HSC逆转为更静止的表型，显示ASMA和Ki67（增殖标记）染色减少，油红O染色增加，表明中性脂质积聚(). 有趣的是，当Notch信号被抑制，MF-HSC恢复到更静止的表型时，标志肝祖细胞的Notch相关基因Dlk1的mRNA表达(36)和编码其他祖细胞标记（例如Nanog、Oct4和FN14）的mRNA下调(). 因此，在培养诱导的原代MF-HSC转分化过程中，Notch信号被激活，这允许细胞获得具有祖细胞样特征的更多间充质表型。这一过程与Hh信号的激活相关诱导类似，可能受Notch和Hh通路之间的串扰调节，因为HSC需要Hh信号变成MF(8,31)
Notch抑制抑制Hedgehog信号传导并促进原发性HSC间质-上皮样转变用DAPT治疗3天的原发MF-HSC的qRT-PCR分析（A）Notch基因、（B）MF/Hh靶基因、（C）上皮/静止基因和（D）前体基因的变化，*p<0.05与DMSO控制，n=3。（E） DAPT处理的MF-HSC染色，以检测裂解的Notch-2、Jagged-1和Hey2蛋白。比例尺：150μM。（F） 检测DAPT对ASMA HSC表达、增殖（Ki67）和脂质含量（油红O）的影响。
抑制刺猬信号阻断缺口信号在体外
为了进一步检查Notch和Hh信号之间可能的串扰，用Hh信号拮抗剂GDC-0449处理两种Notch响应细胞类型（603B和原代MF-HSC）。GDC-0449直接与Hh共受体Smoothened相互作用并抑制Hh共受体。(37)早期的工作已经证明，GDC-0449重述了MF-HSC中Smoothened基因敲除的作用，这两种方法都抑制了典型的Hh信号传导，从而阻断了Gli DNA结合蛋白的核定位和转录激活。(31)在这两种细胞类型中，拮抗Smoothened导致Notch-2、Jagged-1和Notch靶基因的抑制()，证明典型的Hh通路活性促进Notch信号通路基因的表达。鉴于DAPT是一种特异性阻断Notch信号传导的γ-分泌酶抑制剂，可抑制Shh配体、Gli2（Hh-调节转录因子）和Ptc（Gli的直接转录靶点）的表达()，Notch途径似乎刺激了Hh途径的活性。因此，研究结果确定了一个先前未被发现的Hh-Notch正反馈回路，该回路调节未成熟导管型细胞和MF-HSC中的细胞命运决定。在某些类型的成人肝损伤中，这两种细胞在从门管区向外延伸的纤维化间隔内积聚和混合，导致桥接性纤维化，这是肝硬化的前兆。(38)这表明Notch-Hh相互作用可能通过控制参与肝脏修复的两种关键细胞类型的命运来调节肝硬化的发病机制。
阻断肌纤维母细胞肝细胞的Hedgehog信号抑制Notch信号（A） 用Hh抑制剂GDC-0449或DMSO处理603B 48小时的qRT-PCR分析Hh靶基因（Ptc和Gli1）、Notch基因（Notch-2、Jagged-1、Hey1和Hey2）和上皮基因（AFP和HNF4α）的变化*p<0.05与DMSO控制，n=3。（B） GDC-0449处理3天的原发MF-HSC的qRT-PCR分析*p<0.05，**p<0.01与.DMSO控制。（C–E）ASMA-Cre-ERT2段–Smo-flox（双转基因，DTG）小鼠接受BDL，并从BDL后第4天到第10天每隔一天用载体（VEH，橄榄油，n=3）或三苯氧胺（TMX，n=4）治疗。（C） 肝脏总mRNA的qRT-PCR分析，*p<0.05。（D） Notch-2和Hey2的代表性免疫组织化学和量化。比例尺：100μm*p<0.05，**p<0.01。（E）在肝脏切片中用Desmin（绿色）对Notch-2或Hey2（棕色）进行双重染色，如还量化了Desmin+细胞中Notch-2/Desmin或Hey2/Desmin双阳性细胞的百分比。每只老鼠至少有10个字段*p<0.05，n=3。
MF中的阻断Hh信号抑制陷波信号体内
验证Hh信号调节Notch信号体内如观察到的在体外为了评估这种相互作用对肝脏修复的功能影响，我们使用遗传方法有条件地删除MF-HSC中的Smoothened。通过Smo杂交建立双转基因（DTG）小鼠flox/flox公司ASMA-Cre-ER小鼠T2段老鼠。用三苯氧胺（TMX）治疗这种DTG小鼠可诱导选择性删除漂浮的Smo基因，但仅限于ASMA表达细胞(31)为检测MF-HSC及其后代中Hh信号的影响提供了一个有用的工具。(9)DTG小鼠接受BDL以引起肝损伤和代偿性修复反应。四天后，开始用载体或TMX治疗，并每隔一天给药一次，直到第10天；BDL后第14天处死小鼠进行肝组织分析。在早期的研究中，我们发现这种方法降低了肝脏中Smo的表达，将ASMA（+）细胞的肝脏含量降低了>85%，并显著降低了胶原蛋白基因表达、肝脏羟脯氨酸含量和天狼星红染色，以及Krt19（+）导管细胞的积累。(9)在这项研究中，我们证实TMX降低了Smo和ASMA的表达()，并显示Hh-responsive MF的减少显著减少了Notch-2（+）和Hey2（+）细胞的数量，无论是沿着肝窦（与Desmin（+）共同定位）还是在残留的导管结构中(). 全肝RNA的QRT-PCR分析表明，与对照组相比，TMX治疗的DTG小鼠中Notch-2表达细胞的丢失伴随着Notch靶基因的全肝表达显著降低(). 全肝裂解物的免疫印迹分析证实，Notch信号的抑制伴随着导管型细胞及其祖细胞（如Krt19和HNF6）标记蛋白的预期丢失，伴随着肝细胞富集转录因子HNF4α的诱导(补充图3C). 然而，有趣的是，我们无法检测到Jagged-1 mRNA表达的差异()或蛋白质(补充图3A)在我们的BDL小鼠中，尽管在我们检测的时间点αMSA表达细胞显著减少。免疫组织化学显示Jagged-1在Smo缺失后持续存在的Desmin（+）基质细胞中的共定位，表明与培养物不同，激活的MF-HSC(),体内-活化的HSC在从肌纤维母细胞状态恢复到更静止的HSC表型后，至少一段时间内保持Jagged-1的表达。为了确定Jagged-1在Smo敲除后是否能够激活Notch信号，我们测试了Smo的原代HSC中重组Jagged-1-配体的反应flox/flox公司HSC后的小鼠培养激活MF，并用Cre重组腺病毒载体处理以删除Smo。将结果与Smo进行比较flox/flox公司用对照腺病毒载体（Ad-GFP）治疗HSC。Jagged-1显著增加了对照HSC中Notch 2和Notch靶基因的表达，但对Smo-depleted HSC没有影响(补充图3B). 因此，骨料体内和在体外数据表明，Hh途径调节肝细胞中Jagged-1下游的Notch信号，至少部分是通过促进Notch-2的表达。取消典型的Hh信号可以阻止Jagged-1诱导Notch-2，并足以导致肝细胞对Jagged-1.产生相对抗性，从而抑制Jagged-Notch信号并阻断Notch靶基因的诱导。这阻断了肌纤维母细胞和导管细胞的生长，减少了胆汁淤积性肝损伤期间的纤维化（现有数据和(9)). 鉴于阻断Notch抑制培养MF中的Hh()抑制Notch信号也能降低CCl治疗大鼠的肝纤维化4,(13)Hh和Notch途径可能相互作用控制HSC的命运体内和他们一样在体外未来需要进行实验，有条件地中断MF中的Notch信号，以解决这个问题。
讨论
本研究首次证明原发性HSC利用Notch信号通路调节其转分化。我们发现，当HSC在培养中成为MF时，它们上调Notch配体Jagged-1和Notch-2受体的表达，同时下调Notch-1受体和Numb（一种Notch信号抑制剂）的表达。我们在原代小鼠HSC中的发现与最近在T抗原转化的大鼠HSC系中报道的发现有所不同，该系主要表达Notch-3(12)然而，正如在永生大鼠HSC系中所指出的那样，我们还发现，当用DAPT（一种特殊的Notch信号抑制剂）治疗时，原代MF-HSC恢复为较少的肌纤维母细胞表型。此外，我们还发现，抑制Notch可使原代MF-HSC重新获得Q-HSC标记物（例如GFAP和PPAR-γ），重新累积脂质，变得不太增生，并表达几种代表上皮细胞的基因（例如e-cadherin和Desmoplakin）。阻断Notch信号通路允许原发性MF-HSC中的间质-上皮样转变的证据是新的，但与Notch促进上皮-间质转变的已知能力一致。(39)事实上，我们观察到DAPT还降低了具有多能肝上皮祖细胞特征的未成熟导管细胞系（603B）中的Notch信号传导和间充质基因表达。在此过程中，我们观察到603B不仅表现出导管祖细胞标志物（如HNF1、HNF6、Krt19）的预期下调和肝细胞祖细胞标志物（如HNF4α和AFP）的相互上调，而且还表现出Q-HSC基因GFAP的表达增加。
有证据表明，肝细胞和胆管细胞的Notch调节祖细胞也可以分化为表达HSC标记物的Notch敏感性细胞，这与早期在成年小鼠中进行的血统追踪研究一致，该研究表明这种双功能肝上皮祖细胞和HSC具有共同的血统(32)以及最近的一项血统追踪研究，该研究证明ASMA和GFAP表达细胞在成人肝损伤期间产生肝细胞和导管细胞。(9)来源于HSC的MF表达多潜能祖细胞的几个标记，包括Oct4(40)已知其他成人上皮组织含有分化（非干细胞）细胞亚群，这些细胞能够去分化为干细胞样细胞；(41)这种非干细胞通过上皮-间充质转化与进入干细胞状态密切相关。(42)这些发现促使人们推测，成人组织中的干细胞隔室可能会被微环境中的上下文信号所补充，这些微环境可以重新激活具有内在表型可塑性的成熟细胞亚群中的多潜能因子，如Oct4。(41)
在肝损伤期间，肝脏微环境急剧变化，健康成人肝脏中不表达的因子，如Jagged和Hh配体，会累积。肝脏修复所需的许多细胞类型都具有Hh反应性，包括HSC和双功能肝祖细胞。在这些细胞中激活Hh信号在全球范围内影响其命运，引发上皮-间质样转变，刺激增殖，提高生存率。(43)在这里，我们首次证明Hh与Notch相互作用，以协调原发性HSC中细胞命运的变化。我们发现，用DAPT阻断Notch信号抑制了Hh靶基因的表达，如Ptc，而Smoothened的直接拮抗剂GDC-0449则降低了Notch-2、Hes1、Hey2和HeyL的表达。MF-HSC需要Notch和Hh通路之间的串扰来保留其肌成纤维细胞表型，因为阻断任一通路都会抑制典型MF标志物（如ASMA和胶原）的表达，同时诱导静止标志物（如PPAR-γ和GFAP）的重新表达。603B的平行研究证实，类似的Hh-Notch相互作用调节多能干肝祖细胞的细胞命运决定。此外，由于我们发现DAPT抑制MF-HSC和祖细胞系中TGF-βmRNA的表达，并且据报道GDC-0449抑制了MF-HSC中TGF--β的表达，因此可能涉及与其他关键修复相关信号通路的串扰。(44)TGF-β与其受体相互作用，启动独立于Smoothened、(45)这表明Notch-Hh串扰可能促进其他信号通路的激活，这些信号通路对下游靶点重新施加作用。
因此，为了阐明Hh-Notch相互作用在成人肝脏修复中的最终生物学相关性，我们使用Cre重组酶驱动的方法靶向ASMA表达细胞，并删除Smoothene以消除BDL诱导的持续胆汁淤积性肝损伤小鼠的典型（即TGFβ-非依赖性）Hh信号。我们发现，敲低MF中的Hh信号显著抑制Notch信号，使各种Notch靶基因的整个肝脏表达降低40-60%。这抑制了表达导管标记物的细胞的聚集，如Krt19和HNF6（与相应的车辆治疗对照组相比，p<0.05和0.005）。正如这里生成的数据和我们早期工作中所预期的那样(9,31)阻断MF中的Hh信号显著减少了BDL后胶原蛋白生成细胞的积累并降低了肝纤维化。然而，与我们的预测相反，MF的缺失并没有显著降低Jagged-1在肝脏的表达。免疫组织化学将Jagged-1定位于Smo缺失后持续存在的Desmin（+）基质细胞，表明当Hh信号被阻断时MF-HSC会恢复到静止状态体内保留Jagged-1。然而，Hh缺乏的细胞对Jagged-Notch信号传导具有相对抵抗力，因为用重组Jagged-1处理Smo-depleted细胞未能诱导Notch-2或增加Notch调节基因的表达。给出HSC和HSC衍生MF固有塑性的现有和已发表证据(40)需要进行更多的研究，以确定BDL小鼠MF中Smo敲除后观察到的结果是否反映了Hh-Notch相互作用的中断，该相互作用控制这些创伤愈合细胞中的上皮-间充质样/间充质-上皮样转变。无论如何，Hh信号影响受损成年小鼠肝脏中Notch通路活性的新证据补充了证明培养的成年肝细胞中这两条信号通路之间相互促进串扰的数据。都说了另一种方式在体外和体内，激活Hh通路刺激Notch信号，后者进一步增强促成纤维细胞Hh信号。新发现的正反馈回路提供了一种以前未被怀疑的机制，有助于解释为什么最近的一项研究发现，用Notch抑制剂治疗大鼠可以降低CCl4-诱导肝纤维化。(13)
总之，我们的最新发现补充了其他研究小组的工作，同时也扩展了越来越多的证据，证明成人肝脏修复是由重新激活的形态发生信号通路控制的，这些通路在发育过程中协调器官发生，如Notch和Hedgehog。这些途径在成人器官修复过程中明显协同作用，并可能在发育过程中协调。在成人肝脏中，这些机制似乎涉及对保留高水平固有可塑性的成人肝细胞亚群的基本命运决定的调节。尽管需要进行更多的研究来澄清这种见解的细微差别，但它已经确定了许多新的诊断和治疗靶点，可以利用这些靶点来改善成人肝损伤的结果。
