癌症研究。作者手稿；PMC 2013年8月30日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院510652
3,3'-二吲哚甲烷抑制雷帕霉素的哺乳动物靶点抑制血小板衍生生长因子-D-高表达PC3细胞的侵袭和血管生成
密歇根州底特律韦恩州立大学医学院卡马诺斯癌症研究所病理学系
要求重印：Fazlul H.Sarkar，病理学系，Barbara Ann Karmanos癌症研究所，韦恩州立大学医学院，740 Hudson Webber癌症研究中心，4100 John R，底特律，MI 48201。电话：313-576-8327；传真：313-576-8389；在rakrasf的ude.enyaw.dem. 摘要
血小板衍生生长因子D（PDGF-D）是一种新发现的生长因子，已知其可调节多种细胞过程，包括细胞增殖、转化、侵袭和血管生成。最近的研究表明，PDGF-D及其同源受体PDGFR-β在前列腺癌组织中表达，提示PDGF-D可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用。然而，PDGF-D在肿瘤发生中的生物学作用尚不明确。在本研究中，我们发现PDGF-D-过表达PC3细胞（稳定转染PDGF-D cDNA的PC3细胞，称为PC3 PDGF-D）表现出快速生长速度和增强的细胞侵袭性，这与雷帕霉素哺乳动物靶点（mTOR）的激活和Akt活性降低有关。雷帕霉素抑制mTOR活性，同时导致Akt活化，这可能减弱mTOR抑制剂的治疗效果。相反，B-DIM（来自Biorense，Inc.的BR-DIM；一种化学预防剂）显著抑制PC3 PDGF-D细胞中的mTOR和Akt，这与细胞增殖和侵袭降低有关。此外，来自PC3 PDGF-D细胞的条件培养液显著增加了人脐静脉内皮细胞的管形成，而B-DIM治疗可抑制其管形成，同时PDGF-D-全长和活性形式减少。我们的结果表明，B-DIM可以通过灭活PDGF-D过度表达前列腺癌中的mTOR和Akt活性，作为一种新型高效的化学预防和/或治疗剂。
引言
血小板衍生生长因子D（PDGF-D）是一种新发现的生长因子，通过激活其同源受体PDGFR-β，可以调节多种细胞过程，包括细胞增殖、转化、侵袭和血管生成(1,2). PDGF-D由疏水性假定NH组成2-末端信号肽2-末端CUB结构域、铰链区域和包含胱氨酸结基序的COOH末端生长因子结构域(三). 几份报告表明，PDGF-D的CUB结构域必须在细胞外被裂解，以使COOH末端生长因子结构域激活，从而使PDGF-D与其受体结合(三,4). 众所周知，生长因子，如PDGF和表皮生长因子，可以通过激活受体酪氨酸激酶来激活磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）/Akt，从而与哺乳动物雷帕霉素靶点（mTOR）通路相关。
mTOR蛋白激酶通过接收生长因子下游Ras和PI3K的刺激信号，已成为控制许多细胞过程的关键分子，例如细胞生长和细胞分裂(5). mTOR通过磷酸化两个主要靶点调节翻译速率和细胞增殖，这两个靶点是真核生物翻译起始因子4E（eIF4E）-结合蛋白1（4E-BP1）和核糖体蛋白S6激酶（S6K1和S6K2）。磷酸化后，4E-BP1从eIF4E中释放，允许eIF4E与其他翻译起始因子组装，以启动cap-dependent翻译。eIF4E被认为可以增强具有复杂5′非翻译区二级结构和/或上游开放阅读框的转录物的翻译，这些转录物通常编码与增殖反应相关的蛋白质。S6K1直接磷酸化40S核糖体蛋白S6，进而促进核糖体的生物生成(6). 最近的研究表明，由mTOR调节的S6K和4E-BP1是细胞运动所必需的(7)和S6K，Akt/mTOR通路的下游靶点，已被证明通过负反馈机制抑制PI3K/Akt通路(8–13).
mTOR存在于细胞内两种不同的复合物（mTORC1和mTORC2）中：mTORCl由mTOR、GβL、raptor和PRAS40组成，而mTORC2中包含mTOR，GβL，rictor和SIN1。该raptor复合物对雷帕霉素敏感，部分通过磷酸化S6K和4E-BP1调节细胞生长和增殖。含有蓖麻的复合物对雷帕霉素不敏感(14–16). 雷帕霉素是一种特异性mTOR抑制剂，与FK506结合蛋白12（FKBP-12）相互作用，随后在FKBP.12–雷帕霉素结合域与mTOR结合，从而抑制mTOR与其底物的相互作用(17). 雷帕霉素及其类似物在许多肿瘤细胞系中强烈抑制细胞增殖并诱导凋亡(18,19)在有限的临床试验中增加患者的生存率(18). 然而，最近的研究表明，雷帕霉素对mTOR的抑制可能导致Akt的激活，这是由于消除了组成性激活的mTOR介导的反馈抑制，这可能会减弱mTOR抑制剂的治疗效果(20–23). 这些结果表明mTOR是癌症治疗的靶点；然而，必须开发新的mTOR抑制剂，不仅抑制mTOR途径，而且不会激活Akt。
十字花科蔬菜中吲哚-3-甲醇的二聚产物3,3′-二吲哚基甲烷（DIM）已被证明能抑制人前列腺癌细胞的生长并诱导其凋亡(24,25). 我们已经证明，DIM通过抑制PI3K活性和Akt活化来调节其生物活性(25,26). 然而，没有报告表明B-DIM诱导的侵袭和血管生成抑制是否可以通过下调mTOR通路介导。在本研究中，我们发现PDGF-D过度表达通过负反馈机制导致mTOR活性增加和Akt失活。mTOR的激活将PDGF-D介导的致癌信号传导到其下游靶点S6K和4E-BP1，以控制细胞生长、侵袭和血管生成。雷帕霉素是mTOR的抑制剂，已被证明可使mTOR信号失活但激活Akt，而B-DIM治疗可抑制PC3 PDGF-D细胞中的细胞生长、侵袭和mTOR激活，而不会激活Akt。此外，经B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞条件培养基（CM）可减少人脐静脉内皮细胞（HUVEC）的管形成。因此，我们认为B-DIM可以通过抑制mTOR和Akt活性，从而抑制PDGF-D过度表达前列腺癌的侵袭和血管生成，从而作为一种新型有效的化学预防和/或治疗剂。
材料和方法
细胞系和培养
前列腺癌细胞系PC3细胞和转染后的细胞系保存在添加了5%胎牛血清（FBS）、2mmol/L谷氨酰胺、10μmol/L HEPES、100单位/mL青霉素和100μg/mL链霉素的RPMI 1640（Invitrogen）中。所有细胞在5%CO中培养2-37°C下的增湿大气。
过表达PDGF-D的稳定细胞系的建立
PDGF-D过度表达的PC3细胞系的建立之前已有描述(27). 简言之，用pcDNA3-PDGF-D转染PC3细胞：将用Geneticin选择的His或相应的空载体pcDNA3-Neo与存活细胞合并在一起以排除伪影，称为PC3 PDGF-D或PC3 Neo。
试剂和抗体
BR-DIM，以下称为B-DIM，是一种具有较高生物利用度的配方DIM，由Michael Zeligs博士（BioResponse，Boulder，CO）善意提供，并在DMSO中溶解以制备50 mmol/L储备溶液，并在−20°C下以多份样品储存。抗人PDGF-D抗体购自Invitrogen。抗mTOR，phospho-mTOR（Ser2448)，p70S6K，磷酸化-p70S6K（Thr389)、4E-BP1、磷酸化-4E-BP1（Thr37/瑟46)，Akt，磷酸化Akt（丝氨酸473)和猛禽是从细胞信号技术公司购买的。β-肌动蛋白和PI3K抑制剂的单克隆抗体LY294002购自Sigma-Aldrich。抗人Bcl-2抗体来自Dako North America，Inc.。雷帕霉素来自EMB Biosciences，Inc。
小干扰RNA和转染
使用DharmaFECT3小干扰RNA（siRNA）转染试剂（Dharmacon）用mTOR、raptor或对照siRNA（100 nmol/L，Santa Cruz Biotechnology）转染PC3 PDGF-D细胞。转染24小时后去除培养基，细胞在无血清培养基中培养24小时。收集培养基，离心去除细胞碎片，并保存在−70°C下进行试管形成分析；然后收集细胞进行侵袭试验或制备细胞裂解物进行Western blot分析。
侵入试验
根据制造商的说明，使用BD BioCoat肿瘤侵袭检测系统（BD Bioscience）测定细胞侵袭。简单地说，将悬浮在无血清培养基（含有10和25μmol/L B-DIM或DMSO）中的PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞以及转染有mTOR、raptor或对照siRNA的PC3 PDGF-D细胞接种到系统的上室。井底充满了完整的介质。培养24小时后，用37°C下PBS中的4μg/mL Calcein AM对细胞进行1小时染色。荧光标记细胞在荧光显微镜下拍照。在485/530 nm的激发/发射波长下，在ULTRA多功能微孔板阅读器（TECAN）中读取入侵细胞的荧光。
Matrigel公司在体外HUVEC试管形成分析
在含有0.5%FBS的RPMI 1640中培养的PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞用B-DIM或DMSO处理48小时。用mTOR、raptor或对照siRNA转染PC3 PDGF-D细胞。收集CM，离心，转移到新鲜试管中，并储存在−70°C。如前所述进行HUVEC试管形成分析(28).
蛋白质印迹分析
将PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞接种在5%的FBS中培养24小时。用PBS清洗细胞，并用B-DIM在5%FBS中处理48小时。从培养物中收集CM。通过从培养皿中刮取细胞并用冷PBS洗涤两次，获得来自不同实验的细胞裂解物。将细胞沉淀悬浮在125mmol/L Tris-HCl（pH 6.8）中，超声处理10秒，并加入等体积的4%SDS。将裂解物煮沸10分钟。使用BCA蛋白质分析（Pierce）测定蛋白质浓度。如前所述，使用CM或细胞裂解物进行蛋白质印迹分析(28).
WST-1分析法的细胞增殖研究
将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在96个培养皿中，并培养24、48、72小时。或者，将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在96个培养皿中并培养24小时；用10和25μmol/L B-DIM或1、10和100 nmol/L雷帕霉素处理细胞72小时。对照细胞用二甲基亚砜作为载体对照。培养后，将细胞与细胞增殖试剂WST-1（Roche Applied Science）在37°C和5%CO的培养基中培养4小时2使用超多功能微孔板阅读器（Tecan）在450/595 nm处测定分光光度吸光度。
数据分析
图中的实验代表了三个或更多不同的重复。数据以平均值±SE表示。各组之间的比较由双尾Student’st吨测试。P（P）数值<0.05被认为具有统计学意义。
结果
PDGF-D显著增加PC3细胞增殖
PDGF-D是细胞增殖、趋化性和转化的有力刺激物。为了评估PDGF-D的有丝分裂活性，我们检测了正常生长条件下PC3-Neo和PC3-PDGF-D-细胞的生长速率。培养48小时和72小时后，与PC3-Neo相比，PC3-PDGF-D分别增加了1.6倍和2.4倍().结果表明，PC3 PDGF-D细胞中PDGF-D的表达和活性形式均高于PC3 Neo（可忽略或不在检测水平）。这些结果表明，PC3细胞暴露于PDGF-D可加速细胞增殖。由于已知生长因子激活mTOR通路以控制细胞增殖和存活，我们研究了PC3 PDGF-D细胞中mTOR和细胞存活因子的状态。
PDGF-D促进PC3细胞增殖。A类将PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞接种在5%FBS中的96个平板中，并培养24、48和72小时。细胞在37°C和5%CO的培养基中与细胞增殖试剂WST-1培养4小时2使用超多功能微孔板阅读器在450/595 nm处测定分光光度吸光度。点数，平均值(n个= 6);酒吧，东南部**，P（P）与对照组相比<0.01。B类PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞在含有5%FBS的培养基中孵育48小时，培养基中PDGF-D的全长和活性形式。
PDGF-D显著上调mTOR通路，增强生存因子Bcl-2，并导致Akt失活
由于PDGF-D显著增加PC3细胞增殖，并且生长因子可以通过激活PI3K/Akt激活mTOR通路，从而刺激细胞生长和增殖，因此我们测试了PDGF-D-过度表达PC3细胞中mTOR途径是否被激活。为了评估mTOR通路的活性，我们检测了磷酸化mTOR（p-mTOR）及其两个下游靶点磷酸化4E-BP1（p-4E-BPl）和磷酸化S6K（p-S6K）。我们发现PDGF-D显著增加了p-mTOR、p-4E-BP1和p-S6K的水平。我们还发现，在PC3 PDGF-D细胞中，作为主要生存因子的Bcl-2显著增强(). 此外，PDGF-D也增加了PDGF-D-过度表达LNCaP细胞中mTOR信号的活性（数据未显示）。这些结果表明，mTOR通路和Bcl-2可能通过激活PDGF-D信号通路，促进长期刺激诱导的前列腺癌细胞增殖。
PDGF-D诱导mTOR通路的激活和生存因子Bcl-2的表达，同时Akt失活。A类将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在5%FBS中的100-mm板中。48h后，制备细胞裂解物，并对等量的蛋白质进行凝胶电泳。使用抗磷酸化-mTOR（Ser2448)，mTOR，磷酸-p70S6K（Thr389)、S6K、磷酸-4E-BP1（Thr37/瑟46)，4E-BP1，磷酸化-Akt（Ser473)、Akt和Bcl-2。β-肌动蛋白作为负荷控制。B类对PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中磷酸化-mTOR、磷酸化-p70S6K、磷酸化-4E-BP1、磷酸化-Akt和Bcl-2的表达进行定量分析，并将条带的相对密度归一化为β-actin（PC3-Neo，赋值为100%）。柱，平均值(n个= 4);酒吧，东南部**，P（P）与PC3 Neo相比<0.01。C类将PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞接种并培养24 h。细胞用10 nmol/L雷帕霉素处理(R（右）)，10μmol/L LY294002(L（左）)，10 nmol/L雷帕霉素与10μmol/L LY294002联用(R+L（R+L）)，或DMSO控制(C类)培养8小时后，制备细胞裂解物，并对等量的蛋白质进行凝胶电泳。使用抗磷酸化Akt、Akt和磷酸化p70S6K（Thr389)和p70S6K。β-肌动蛋白作为负荷控制。
丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶Akt是mTOR的主要上游调节因子。我们试图确定PDGF-D过度表达PC3细胞中的Akt活性是否发生改变。有趣的是，我们发现PDGF-D中的p-Akt减少——在较高的传代中过度表达PC3细胞（从第10代到第30代；)但在前面的段落中没有（第7段，数据未显示）。由于在PDGF-D过度表达的PC3细胞中Akt总表达上调，我们测试了Akt活性的抑制是否是由于PC3 PDGF-D细胞中mTOR通路的激活/过度激活所致。在本实验中，我们测试了mTOR抑制剂雷帕霉素对Akt磷酸化的影响。10 nmol/L的雷帕霉素增加了PC3-Neo尤其是PC3-PDGF-D细胞中Akt的磷酸化，这表明Akt失活是由mTOR途径介导的负反馈调节所致(). PI3K是Akt的上游调节器；因此，我们试图确定雷帕霉素诱导的Akt激活是否依赖于PI3K。如所示PI3K抑制剂LY294002逆转了雷帕霉素诱导的PC3-Neo，尤其是PC3-PDGF-D细胞中Akt的激活，表明细胞长期暴露于PDGF-D-激活mTOR通路，进而通过PI3K依赖性方式抑制PC3-PDGF-D细胞的Akt活性。这些结果表明，长期暴露于PDGF-D诱导的mTOR过度激活是Akt失活的原因。
雷帕霉素抑制mTOR活性并诱导Akt活化，而B-DIM在PDGF-D-过度表达PC3细胞中抑制mTOR通路而不激活Akt
雷帕霉素是mTOR的一种特异性抑制剂，被认为通过抑制mTOR与其底物的相互作用而对mTOR活性产生影响。在这项研究中，我们发现雷帕霉素抑制PC3-Neo，尤其是PC3-PDGF-D细胞中的p-S6K和p-4E-BP1。然而，雷帕霉素导致PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞中Akt的激活(). 有趣的是，雷帕霉素处理下调了mTOR在Ser位点的磷酸化2448在PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞中(). 这些结果支持了先前的研究，表明mTOR是S6K的底物之一，并且mTOR在Ser2448由S6K介导(29,30). 因此，雷帕霉素抑制S6K1活性，这反过来又降低了血清中mTOR的磷酸化2448这些结果表明mTOR是癌症治疗的靶点。然而，雷帕霉素治疗介导的Akt活化可能会减弱mTOR抑制剂的治疗效果，这表明必须开发新的mTOR抑制物，不仅抑制mTOR通路，而且不会激活Akt。
B-DIM和雷帕霉素抑制mTOR通路，雷帕霉素而非B-DIM导致PC3 PDGF-D细胞中Akt的激活。将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在5%FBS中的100-mm板中。24小时后，用10nmol/L雷帕霉素处理细胞0.5至48小时(A类)或用0、10和100 nmol/L雷帕霉素处理8小时(B类). 如上所述接种细胞，并用10μmol/L B-DIM处理0.5至48 h(C类)或用0、10和25μmol/L B-DIM处理16小时(D类). 制备细胞裂解物，并对等量的蛋白质进行凝胶电泳。使用抗mTOR、phospho-mTOR（Ser2448)，p70S6K，磷酸化-p70S6K（Thr389)、4E-BP1、磷酸化-4E-BP1（Thr37/苏氨酸46)、Akt和磷酸化Akt（Ser473). β-肌动蛋白作为负荷控制。
研究表明，DIM通过诱导细胞凋亡和G1前列腺癌细胞的细胞周期阻滞(25). 我们试图确定B-DIM是否抑制mTOR通路。在本研究中，我们发现B-DIM处理抑制PC3 PDGF-D细胞中4E-BP1和S6K的磷酸化(). 如上所示，雷帕霉素治疗通过mTOR通路的负反馈调节导致PI3K/Akt激活增强，这表明mTOR抑制剂激活PI3K/Akt通路实际上可能使肿瘤更具侵袭性。因此，我们试图检测B-DIM是否诱导Akt激活。为此，我们测试了B-DIM对Akt磷酸化的影响。B-DIM显著降低PC3 PDGF-D细胞中4E-BP1和S6K的磷酸化，同时Akt失活(). 此外，B-DIM还抑制了mTOR在Ser2448与雷帕霉素类似().
B-DIM通过减少PDGF-D全长和活性形式部分抑制细胞生长
雷帕霉素已被证明能诱导细胞周期阻滞和抑制细胞增殖。PDGF-D过度表达通过上调mTOR通路导致PC3细胞增殖增加。因此，我们推测雷帕霉素在抑制PC3 PDGF-D细胞增殖方面比PC3 Neo细胞更有效。我们测定了在雷帕霉素存在下PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞的生长速度，发现雷帕霉素显著抑制PC3-PDGF-D细胞增殖(). 另一方面，B-DIM不仅抑制了PDGF-D过度表达的PC3细胞的mTOR通路活性，还抑制了Akt的激活，这与抑制细胞生长相一致，表明与雷帕霉素相比，在不激活Akt情况下，PC3 PDGF-D细胞对B-DIM处理更敏感().
B-DIM比雷帕霉素更有效地抑制细胞增殖，B-DIM减少PDGF-D的全长和活性形式。PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在96周板中。24小时后，用0、1、10和100nmol/L雷帕霉素处理细胞(A类)或用0、10和25μmol/L B-DIM处理(B类)处理后，将细胞与细胞增殖试剂WST-1在37°C和5%CO的培养基中孵育4 h2通过使用超多功能微孔板读取器在450/595nm处测定分光光度吸光度。相对于PC3 Neo对照组计算活细胞，赋值为100%(n个= 6; #,P（P）<0.05和*，P（P）与PC3 Neo或PC3 PDGF-D对照组相比<0.01）。C类和D类将PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞接种在5%FBS中的100-mm板中。24 h后，用0、10和25μmol/L B-DIM在0.5%FBS中处理细胞48 h。收集CM并制备细胞裂解液。CM和等量的蛋白质进行凝胶电泳，并使用PDGF-D抗体进行Western blot分析。
为了确定B-DIM对PC3 PDGF-D细胞增殖的抑制是否部分是由于PDGF-D的表达和激活受到抑制，我们通过Western blot分析研究了CM和细胞裂解物中PDGF-D-的全长和激活形式。我们发现10和25μmol/L B-DIM均显著降低CM和细胞内裂解物中PDGF-D的活化和全长形式(). 这些结果表明，B-DIM对PC3 PDGF-D细胞增殖的抑制部分是由PDGF-D-表达减少以及PDGF-D活化形式介导的。
B-DIM抑制PC3 PDGF-D细胞侵袭
mTOR通路不仅控制细胞生长和增殖，还调节细胞侵袭。最近的研究表明，组成活性形式S6K的表达足以诱导卵巢癌细胞的侵袭和迁移(31). 在这项研究中，我们发现PDGF-D的过度表达诱导了mTOR通路的激活，导致S6K磷酸化增加。因为我们发现B-DIM处理抑制活性PDGF-D和S6K的磷酸化，我们推测B-DIM可能抑制PC3-PDGF-D细胞的细胞侵袭。正如预期的那样，PDGF-D过度表达的PC3细胞表现出更强的侵袭性，而B-DIM治疗显著抑制了PC3 PDGF-D细胞的侵袭性().
B-DIM抑制PC3 PDGF-D细胞的侵袭，而经B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞中的CM可减少HUVEC的管形成。A类使用BD BioCoat肿瘤侵袭检测系统测定B-DIM治疗对细胞侵袭的影响。侵袭性细胞用4μg/mL钙化蛋白AM染色。B-DIM（10和25μmol/L）显著降低PC3 PDGF-D细胞的侵袭性。B类在含有0.5%FBS的培养基中培养的PC3 Neo和PC3 PDGF-D细胞用B-DIM或DMSO处理48 h。收集CM进行血管生成分析（由HUVEC形成管）。将HUVEC接种在涂有生长因子-降低基质的八周培养箱的每个孔中。将培养箱培养8或24小时。使用带数码相机的倒置显微镜拍摄每个孔。使用从NIH网站下载的软件图像分析程序Scion Image对小管/毛细管长度进行图像分析。C类，入侵细胞的相对荧光值。该值表示侵入细胞的相对数量。D类，使用软件图像分析程序Scion image对小管/毛细血管长度进行图像分析。内皮细胞孵育8h后累积管长的量化(左边)和24小时(正确的).柱，平均值；酒吧、SE；n个= 4. #,P（P）与CMN.*相比<0.01，P（P）< 0.05; **,P（P）与CMD相比<0.01(CMN公司，来自PC3 Neo细胞的CM；CMD公司，来自PC3-PDGF-D细胞的CM；CMDB10公司10μmol/L B-DIM处理PC3 PDGF-D细胞的CM；命令2525μmol/L B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞CM）。
B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞CM诱导的HUVEC管状形成减少
mTOR激活增加血管内皮生长因子的表达，从而介导血管生成(32)雷帕霉素通过抗血管生成抑制肿瘤生长(33). 在本研究中，我们发现B-DIM抑制PC3 PDGF-D转染细胞中mTOR的激活。因此，我们假设B-DIM可能抑制mTOR激活诱导的血管生成。为了验证这一假设，我们通过将经B-DIM或DMSO处理的PC3-Neo和PC3-PDGF-D细胞的HUVEC与CM孵育来进行试管形成试验。与PC3-Neo相比，来自PC3-PDGF-D细胞的CM显著增加了HUVEC的管形成。重要的是，经10和25μmol/L B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞中的CM可减少HUVEC的管形成().
通过敲除mTOR和猛禽减少PC3 PDGF-D细胞的侵袭和血管生成
为了确认mTOR通路是否与PC3 PDGF-D细胞的侵袭和血管生成增加有关，我们使用特定寡核苷酸通过siRNA敲低了mTOR和猛禽的表达（圣克鲁斯生物技术）。mTOR和猛禽基因敲除显著抑制PC3 PDGF-D细胞的侵袭(,左边). 此外，来自PC3 PDGF-D细胞的CM通过敲除mTOR或猛禽减少了HUVEC的管形成(,正确的).显示用mTOR或猛禽siRNA转染PC3-PDGF-D细胞分别导致mTOR和猛禽表达显著降低，同时p-S6K和p-4E-BP1水平降低。这些结果表明，mTOR激活有助于PC3 PDGF-D细胞的侵袭和血管生成，这是通过使用PC3 PDGF-D细胞中的CM形成HUVEC来确定的。
mTOR和raptor的敲除减少了PC3 PDGF-D细胞的侵袭，而来自PC3 PDGF-D的CM通过mTOR或raptor的击倒减少了HUVEC的管形成。A类，PC3 PDGF-D细胞转染mTOR、raptor或对照(反对的论点)siRNA。转染48小时后，收集细胞进行侵袭试验。B类，细胞按上述方法处理。收集CM用于试管形成分析。C类，入侵细胞的相对荧光值代表入侵细胞的比较数量(左边). 内皮细胞孵育8h后累积管长的量化(正确的).柱，平均值(n个= 4);酒吧，东南*，P（P）< 0.05, **,P（P）与对照组相比<0.01。D类Western blot分析显示转染mTOR、raptor或对照siRNA的PDGF-D细胞中mTOR，raptor，p-S6K和p-4E-BP1的表达水平。以β-肌动蛋白作为负荷对照。
讨论
PDGF-D已在许多肿瘤细胞系中表达(4). 最近的研究表明PDGF-D在前列腺肿瘤组织中表达(27)提示PDGF-D可能在前列腺癌的发生发展中起重要作用。然而，PDGF-D在肿瘤发生中的生物学和机制作用尚不明确。为了检测PDGF-D在前列腺癌进展中是否起作用，将人全长PDGF-DcDNA稳定转染PC3细胞。我们发现用PDGF-D转染的PC3细胞（PC3-PDGF-D细胞）表现出快速生长和增加侵袭在体外与mTOR活性高水平和Bcl-2表达增加有关，但Akt活性降低。此外，来自PDGF-D的CM–过度表达PC3细胞诱导HUVEC的管形成。然而，PDGF-D诱导血管生成的机制尚不清楚。最近的研究表明，来自转染Bcl-2的人皮肤微血管内皮细胞的CM足以在大鼠角膜实验中诱导新生血管，还发现促血管生成化学因子白细胞介素-8（CXCL8）和生长相关癌基因-α（CXCL1）的表达转染Bcl-2的细胞明显高于对照细胞(34). Anai等人(35)发现反义寡核苷酸敲低Bcl-2抑制人PC3前列腺癌异种移植物的血管生成。在我们的研究中，与PC3-Neo细胞相比，PDGF-D过度表达的PC3细胞中Bcl-2的表达明显更高。因此，Bcl-2诱导的促血管生成因子可能是CM从PC3 PDGF-D细胞诱导HUVEC管形成的原因。
我们还观察到PDGF-D以全长和活性形式存在于PC3细胞的培养液和细胞裂解液中，这表明能够蛋白水解激活PDGF-D的蛋白酶在PC3细胞中表达。综上所述，这些结果表明，活化的PDGF-D可以通过激活mTOR通路促进细胞增殖和侵袭。生长因子介导的PI3K/Akt/mTOR通路已被证明通过磷酸化mTOR下游靶点S6K和4E-BP1来控制细胞生长、增殖、侵袭和血管生成(36). 在本研究中，我们发现PDGF-D-过度表达的PC3细胞通过激活mTOR下游靶点，如S6K和4E-BP1，并伴随Akt失活，显示出生长优势。这些结果与最近的研究一致，研究表明组成性激活的mTOR可以通过负反馈抑制降低PI3K/Akt的激活(8–13).
Akt是mTOR通路的上游效应器，通过磷酸化结节性硬化复合物2（TSC2）激活mTOR，TSC2是一种mTOR抑制剂。TSC1和TSC2形成具有GTPase活性的异二聚体，抑制活性Rheb，这是mTOR激活所需的一种小GTPase(37). 最近的一项研究表明，当mTOR在TSC1或TSC2缺陷细胞中通过负反馈调节环被激活时，由血清或生长因子介导的Akt的激活被抑制(12). 这种反馈抑制回路归因于S6K对IRS-1的抑制作用，IRS-1通过胰岛素样生长因子-I和胰岛素介导PI3k/Akt激活(11,12,21,23). 然而，除了胰岛素外，生长因子是否能激活mTOR通路，这可能通过负反馈机制与Akt失活有关，目前尚不清楚。在本报告中，我们发现PC3细胞长期暴露于PDGF-D导致mTOR过度激活，从而使Akt失活。我们还发现，PI3K抑制剂LY294002阻止了雷帕霉素诱导的Akt活化，这表明PI3K活性是通过过度激活的mTOR途径介导的Akt-负反馈抑制所必需的。综上所述，这些结果表明癌细胞分泌PDGF-D，进而激活mTOR通路以促进肿瘤细胞增殖、侵袭和诱导血管生成，同时通过PI3K/Akt通路的失活使细胞对这些生长因子的刺激脱敏。这些结果进一步表明，PDGF-D水平较高的肿瘤的生长可以通过抑制mTOR及其下游靶点来抑制。
雷帕霉素（Rapamycin）是一种细菌衍生的大环内酯酯，临床上已被证实是一种免疫抑制剂，并已被证明是一种很有前景的抗肿瘤药物。在这项研究中，我们发现雷帕霉素处理显著抑制PC3 PDGF-D细胞的增殖，而在PC3 Neo细胞中观察到较少的增殖抑制。同时，雷帕霉素治疗显著降低了S6K和4E-BP1的磷酸化，但在24小时的治疗期间激活了Akt。这些结果表明，mTOR通路的过度激活是生长优势的原因，反过来，在PC3 PDGF-D细胞中，Akt通过负反馈调节而失活。有趣的是，雷帕霉素治疗不仅抑制了mTOR下游靶点S6K和4E-BP1的磷酸化，而且还抑制了Ser的mTOR磷酸化2448最近的研究表明，mTOR是S6K的底物之一，并且mTOR在Ser2448由S6K介导(29,30). 因此，S6K可以通过正反馈调节调节mTOR活性。众所周知，磷酸化位点Ser2448mTOR位于COOH末端调控区内，一旦缺失，mTOR活性就会升高在体外和细胞内。因此，这个COOH末端调控区域被称为“阻遏域”，因此，Ser2448mTOR导致mTOR活性增强。在本研究中，雷帕霉素治疗导致S6K失活，进而导致mTOR在Ser2448这些结果有力地表明，雷帕霉素可以作为一种有前途的抗肿瘤药物，用于许多mTOR途径过度激活的肿瘤。然而，S6K不仅是mTOR的正调节因子，也是PI3K/Akt通路的负因子。因此，雷帕霉素对S6K的抑制可能导致Akt的激活，这是由于消除了激活的mTOR通路介导的反馈抑制，这可能会减弱mTOR抑制剂的整体治疗效果，进一步表明迫切需要开发新的和新颖的药物。
DIM和B-DIM（一种具有更高生物利用度的配方DIM）已被证明可以抑制人类前列腺癌的细胞增殖、侵袭、血管生成和肿瘤生长(24,25,28). 在本研究中，我们发现B-DIM显著抑制PC3 PDGF-D细胞的增殖和侵袭，这与显著抑制mTOR、S6K和4E-BP1磷酸化、减少PDGF-D-表达和减少PDGF-活性形式有关。此外，经B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞中的CM抑制血管生成（HUVEC的管形成）。更重要的是，在PDGF-D过度表达的PC3细胞中，B-DIM对mTOR通路的抑制并没有导致Akt的激活。最近的研究表明，长期雷帕霉素治疗可以抑制mTORC2组装，从而抑制Akt活化(38,39). 在本研究中，我们发现雷帕霉素处理导致Akt活化。然而，B-DIM不仅抑制了mTOR，还抑制了Akt，这可能是由于mTORC2组件的扰动所致。
总之，我们发现PDGF-D诱导了PC3细胞的增殖和侵袭，而来自PC3 PDGF-D细胞的CM显著增加了血管生成（HUVEC的管形成），这可能是由mTOR的过度激活介导的。雷帕霉素抑制PC3 PDGF-D细胞的增殖，抑制mTOR通路的活性，但诱导Akt的激活。相反，B-DIM强烈抑制PC3 PDGF-D细胞的增殖和侵袭，并在PDGF-D-过度表达的PC3细胞中抑制mTOR活性而不激活Akt，这在一定程度上是由于全长形式和活性形式PDGF-D.此外，经B-DIM处理的PC3 PDGF-D细胞中的CM减少了血管生成（HUVECs的管形成），这表明B-DIM可能是一种更有前景的药物，由于B-DIM介导的PDGF-D-信号的下调以及mTOR和Akt活性的抑制，可能有助于前列腺癌的预防和/或治疗。
致谢
拨款支持：国防部前列腺癌研究项目DAMD17-03-1-0042和国家癌症研究所，NIH拨款5R01CA108535-04（F.H.Sarkar）。
脚注
注：D.Kong和S.Banerjee为这项工作做出了同等贡献。
工具书类
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