结缔组织生长因子在2-AAF/PHx大鼠肝再生过程中卵圆细胞反应中的作用

抑制消减杂交文库的构建

从Thy-1中生成抑制消减杂交（SSH）文库⁺卵圆形细胞和非实质细胞分别作为测试者和驾驶员群体。Thy-1泳池⁺从2-AAF/PHx后9-11天的20个肝脏中分离出卵圆形细胞。从3只正常大鼠肝脏中分离出非实质细胞。Thy-1型⁺流式细胞术分离细胞是根据已发表的方法进行的。⁵根据制造商的说明，使用RNEasy试剂盒（QIAGEN，Chats-worth，CA）和Poly（A）Purist mRNA纯化试剂盒（Ambion，Austin，TX）从两个群体中分离出总RNA和polyA RNA。

根据制造商的说明，使用Clontech PCR-Select cDNA消减试剂盒（Clontech Laboratories Inc，Palo Alto，CA）进行SSH。将鉴定的聚合酶链反应（PCR）产物克隆到PCR 4.1质粒载体中（TA克隆试剂盒；Invitrogen，Carlsbad，CA）。纯化质粒的序列分析揭示了cDNA插入物的身份，并使用BLAST算法与已知DNA序列进行了比较。

Northern Blot分析

在Northern分析中，每组由3只动物组成，在PHx后0、3、5、7、9、11和13天的时间点进行测试。使用RNAstat试剂（德克萨斯州Friends-wood Tel-Test公司）从snap冷冻肝组织中制备总RNA。总计RNA（约20μg）用于Northern分析。从cDNA文库中获得的大鼠CTGF克隆用作探针。TGF-β1和I型前胶原的探针是使用已发布的引物序列通过PCR产生的。¹⁷纤维结合蛋白和AFP探针来自包含相应互补DNA序列的质粒（Genebank/EMBL登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_019143.1”，“term_id”：“9506702”，“term_text”：“NM_019143-1”}}NM_019143.1号,{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_012493.1”，“term_id”：“6978470”，“term_text”：“NM_012493.1}NM_012493.1). 与[³²P] -dCTP标记探针（Amersham Life Science，Piscataway，NJ），42°C，50%甲酰胺；5×氯化钠、磷酸钠和EDTA；5×Denhart、2%十二烷基硫酸钠（SDS）和10%右旋糖酐硫酸盐。

西方分析

用5′GCTAGCCCTCCTGCCGCCCCGACCCCCCCCACATGCCC3′和5′GGATCCCACATCTCCTCCATACATCTTTCCTGT3′引物集，通过逆转录PCR扩增出全长CTGF cDNA，并将其克隆到含有标记表位序列的标记-pGEM载体中（WY Song博士的慷慨馈赠）。测序证实了克隆结果。通过SpeI消化释放CTGF互补DNA和标记序列，并进一步克隆到pFastBac载体（Invitrogen）中。根据制造商的说明，CTGF-flag蛋白在Sf9昆虫细胞中表达。

从RIPA缓冲液中的肝匀浆中提取总蛋白（50 mTris-HCl，pH 7.4；1%NP-40；0.25%Na-deoxycholate；150 mmol/L NaCl；1 mmol/LEDTA；1 mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）；1μg/mL抑肽酶、亮肽和胃蛋白酶抑制素；1 mmol/L钠_三VO（旁白）₄; 1 mmol/L NaF），在10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳凝胶中分离，并电转移至聚偏二氟乙烯（PVDF）膜。在含有4%体表面积和0.1%吐温20的Tris缓冲盐水（TBS）中封闭膜。使用兔抗鼠CTGF抗体（马萨诸塞州剑桥Abcam）作为一级抗体，在含有5%牛奶和0.1%吐温20的TBS中稀释1:2000。使用小牛抗兔IgG（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）作为二级抗体，稀释度为1:5000。使用ECL plus试剂盒（Amersham Life Science，Piscataway，NJ）进行检测。

组织染色和原位杂交

在相同的肝脏切片上进行免疫荧光染色和原位杂交。根据先前公布的方法，用4%多聚甲醛和0.05%戊二醛灌注肝脏。¹⁸分析前，在−20°C下切割6μm厚的冰冻切片，并在40°C下干燥过夜。

原位杂交前进行免疫染色。切片在含有1mmol/L CaCl的TBS中洗涤₂，在−20°C下在甲醇中渗透，并用蛋白质阻断剂阻断（宾夕法尼亚州匹兹堡Thermo Shandon）。用小鼠抗鼠Thy-1抗体（加州圣地亚哥PharMinen）以1:50的稀释度对载玻片进行染色。Alexa Fluor 594标记的山羊抗鼠（分子探针，Eugene，OR）用作稀释度为1:500的二级抗体。

免疫染色后立即进行原位杂交。杂交是根据非放射性原位杂交应用手册（瑞士巴塞尔罗氏）中公布的协议进行的。大鼠CTGF cDNA的430-bp区（Genebank/EMBL登录号{“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_022266”，“term_id”：“78214357”，“term_text”：“NM_022265”}}NM_022266号)被放大¹³并克隆到PCR4 TOPO载体中。来自两个方向的线性化克隆用作使用T7 RNA聚合酶合成地高辛（DIG）-核糖探针的正反义模板。切片在含有40%去离子甲酰胺、10%硫酸右旋糖酐、1×Denhardt溶液、4×标准柠檬酸盐（SSC）、10 mmol/L DTT、1 mg/mL变性和剪切的鲑鱼精子DNA的缓冲液中与5 ng/μL DIG标记的RNA反义或义探针在58°C下杂交40小时。杂交后，在2×SSC中清洗玻片，然后在1×SSC内清洗玻片。接下来，样品在10μg/mL RNA酶中消化，并在0.1×SSC中洗涤以去除非杂交RNA；使用抗DIG-碱性磷酸酶（瑞士巴塞尔罗氏）和硝基蓝四唑氯化物（NBT）/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）底物进行颜色检测。

定量实时PCR

使用ABI PRISM 5700序列检测系统（加利福尼亚州福斯特市Perkin-Elmer Applied Biosystems）进行两步定量实时PCR反应。CTGF引物基于已发表的序列¹⁴进行了以下修改。使用Qiagen RNA试剂盒提取总RNA，并通过DNase I处理去除任何DNA污染（德克萨斯州奥斯汀Ambion）。按照制造商的指示，使用第一链cDNA合成试剂盒（Invitrogen；Carlsbad，CA）用随机六聚体反转录总RNA。使用SYBR Green PCR Core试剂盒（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行扩增反应。扩增条件如下：在500 nmol/L正向和反向引物、5 mmol/L MgCl、50℃下2分钟，95℃下10分钟，然后在95℃下40个周期，15秒，60℃下1分钟₂、50 mmol/L KCl、10 mmol/L-Tris缓冲液（pH 8.3）、200μmol/L dATP、dCTP、dGTP、400μmol/L dUTP、0.25单位AmpErase UNG（Applied Biosystems；加利福尼亚州福斯特市）和1单位AmpliTaq。

为了进行AFP RNA定量，购买了AFP探针和引物（Applied Biosystems，使用以下扩增条件对DNA酶I处理过的RNA样品进行一步实时PCR：48℃下30分钟，95℃下10分钟，然后在95℃下40个周期，15秒，60℃下1分钟；18s核糖体RNA的0.5μmol/L引物和2.0μmol/L探针（Applied Biosystems）用于1步和2步实时PCR。比较C_T型采用针对18s核糖体RNA表达水平的（阈值周期）法进行定量。

伊洛普治疗和体内BrdU标记

如前所述，10只大鼠接受2-AAF/PHx。其中一半通过尾静脉注射伊洛普，另一半注射磷酸盐缓冲盐水（PBS）溶液作为对照。对于伊洛前列素治疗，伊洛前列素在乙醇（开曼化学公司，密歇根州安娜堡）中的储备溶液在使用前立即在PBS中稀释至5μg/mL。从PHx后第1天开始到终点前一天（PHx后的第5、7和9天），每天通过尾静脉给药约33μg/kg的伊洛普。在第7天和第9天的时间点，每组杀死两只大鼠。为了进行体内BrdU标记，在处死前2小时注射1×PBS中的50 mg/kg BrdU。按照标准方案对肝脏切片进行BrdU染色和H&E染色。

Thy-1型⁺卵巢细胞似乎是卵巢细胞辅助肝再生中CTGF的主要来源

通过两种方法研究了卵圆细胞本身是CTGF来源的可能性。首先，CTGF基因在分类Thy-1中的表达⁺卵圆细胞用实时定量PCR检测。与正常肝脏相比，在统计学上显著增加了3.5倍(P（P）<.05）在CTGF中检测到Thy-1⁺2-AAF/PHx后第9天处死动物的细胞。相反，在同一时间点处死的动物的未分类和总肝提取物显示CTGF仅增加2.2倍(图3A类). 富集的Thy-1中CTGF的高表达⁺卵圆形细胞群表明Thy-1⁺卵圆形细胞是CTGF的来源。

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图3

Thy-1型⁺卵圆细胞表达CTGF转录物。(A类)实时PCR显示，与正常肝脏相比，2-AAF/PHx后大鼠全肝和Thy-1分选卵圆细胞中CTGF的诱导。N表示正常肝脏。正常肝脏中的值被任意指定为1个单位。数据表示平均值±SD（n≥3）*P（P）<0.05。(B类)原位杂交阴性对照的意义探讨CTGF公司(200×). Thy-1型⁺2-AAF/PHx处理后第9天获得的卵圆细胞如图所示(C类)和(E类)染色为红色CTGF公司反义探针(D类)和(F类)显示CTGF转录物的深棕色信号。蓝色箭头表示Thy-1中CTGF转录物的共定位⁺椭圆形细胞。的图像B类,C类、和D类取200×。E类和F类取400×。E类和F类were the large magnifications ofC类和D类分别是。

采用Thy-1免疫荧光染色和CTGF信息原位杂交定位CTGF消息。抗Thy-1抗体清楚标记了门脉周围卵圆形细胞群(图3C类和E类). 尽管并非所有表达CTGF转录物的细胞都是Thy-1⁺，有许多Thy-1⁺表达CTGF的卵圆细胞(图3D类和F类). 作为对照，sense CTGF核糖探针未与门管区的任何细胞杂交(图3B类). 免疫染色和原位杂交的交叉标记支持实时PCR结果显示Thy-1⁺卵圆细胞表达CTGF。

卵巢细胞辅助肝再生过程中TGF-β1、I型前胶原和纤维连接蛋白的协同表达

已经证实，CTGF是TGF-β1成纤维特性的下游介体，在许多生物过程中刺激ECM基因的表达。在这里，我们进行了Northern blot分析，以比较CTGF诱导模式与TGF-β1和其他2个ECM基因的诱导模式：I型前胶原和纤维连接蛋白。第3天诱导TGF-β1(图4)，就在CTGF诱导之前。TGF-β1的水平在第9天达到最大值，随后下降。这种模式与TGF-β1刺激2-AAF/PHx后CTGF转录的概念一致。

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图4

卵圆形细胞辅助肝再生中TGF-β1、I型前胶原和纤维连接蛋白的协同表达。Northern blot分析显示，2-AAF/PHx治疗后，TGF-β1和ECM蛋白与CTGF同时诱导。GADPH被用作负荷控制。

CTGF可以诱导ECM基因。2-AAF/PHx后发现I型前胶原和纤维连接蛋白上调，在第7天和第9天达到最大表达(图4). 这与CTGF的诱导相吻合。这些结果支持了以下假设：CTGF是通过TGF-β1介导的信号通路诱导的，最终导致肝再生过程中ECM的合成。

在2-AAF/PHx模型中，Iloprost抑制CTGF的诱导而不影响TGF-β1的诱导

合成的前列环素衍生物，伊洛斯特，已被证明在硬化性疾病和小鼠伤口愈合模型中阻断TGF-β1诱导的CTGF合成。给2-AAF/PHx治疗的大鼠腹腔注射伊洛普（33μg/kg/天），试图抑制CTGF诱导。选择三个时间点，即PHx后第5天、第7天和第9天，代表2-AAF/PHx模型中CTGF表达的初始和峰值，用于Northern分析。在接受伊洛前列素治疗的动物中，在所有3个点几乎无法检测到CTGF信息水平(图5). 在尾静脉注射PBS的对照动物中观察到预期的强烈CTGF诱导。有趣的是，TGF-β1的诱导似乎不受伊洛普的影响，伊洛普治疗组和未治疗组动物在所有三个时间点的TGF-。这些结果表明，在2-AAF/PHx模型中，伊洛普可有效阻断CTGF诱导，而不影响TGF-β1的上调。

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图5

在2-AAF/PHx治疗后，伊洛普阻断CTGF的上调，但不影响TGF-β1的诱导。Northern blot分析表明，2-AAF/PHx治疗大鼠的CTGF上调被阻断，而TGF-β1的表达不受伊洛普的影响。GADPH被用作负荷控制。

由NIH DK58614和NIH DK60015赠款支持。

作者感谢Marda Jorgensen和Heather M.Hatch对免疫组织化学的技术建议，感谢Naohiro Terada博士和Rafal Witek对手稿的准备。