肿瘤浸润调节性T细胞的Fc依赖性耗竭共同定义了抗CTLA-4疗法对黑色素瘤的疗效

α-CTLA-4增加肿瘤特异性CD4的数量⁺淋巴结中的T效率和T调节细胞，但可防止肿瘤内T调节细胞积聚

鉴于T eff/T reg细胞比率被认为会影响免疫治疗的结果(Quezada等人，2011年)，我们重点研究了调节T eff和T reg细胞数量以响应α-CTLA-4的机制。追踪肿瘤/自身抗原特异性CD4⁺T细胞，我们使用了一种最近开发的TCR转基因小鼠，它可以产生CD4⁺I-A上呈现的黑素细胞分化抗原Trp1/gp75特异性T细胞^b条（以下简称Trp1 T细胞；Muranski等人，2008年). 大约10%的Trp1 T细胞表达调节转录因子Foxp3(图2 A)，之前的研究已经证明Trp1Foxp3⁻细胞（Trp1T-eff细胞）促进自身免疫性白癜风的发展，而Trp1Foxp3⁺细胞（Trp1T调节细胞）抑制它(谢等人，2010).

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图2。

α-CTLA-4增加肿瘤特异性CD4的数量⁺淋巴结中的T效率和T调节细胞，同时防止肿瘤内T调节细胞积聚。用1.5×10攻击小鼠⁵B16-BL6第0天，用5×10过户⁴CD4细胞⁺第45页第1页⁺Trp1 T在第3天，并在第3、6和8天用GVAX或GVAX+α-CTLA-4治疗。（A） CD4表达Foxp3⁺Vβ14⁺转移前从Trp1 SJL RAG tan小鼠分离的细胞。（B和C）CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺来自淋巴结（B）和肿瘤（C）的Trp1 T细胞。（D） 肿瘤内CD4表达Foxp3⁺CD45.1型⁺Trp1 T细胞。按照上述方法对小鼠进行治疗，但也不进行治疗或使用α-CTLA-4单药治疗。n个=每组5只小鼠。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。实验重复了两次。

B16-BL6植入后3天，小鼠接受50000 CD45.1⁺Trp1 T细胞与GVAX或GVAX和α-CTLA-4联合静脉注射。使用CD45.1标记物定量Trp1的积累。在实验过程中，GVAX处理小鼠淋巴结中Trp1T eff和Trp1T-reg细胞均蓄积(图2 B). 然而，Trp1T reg细胞优先积累（与高水平增殖相关抗原Ki67的表达有关；未发表的数据），导致T eff/T-reg细胞比率降低。α-CTLA-4增加了两个群体的绝对数量，但没有改变Trp1T eff细胞/Trp1T reg细胞比率(图2 B). 相反，尽管GVAX治疗小鼠的肿瘤中积累了Trp1T-eff细胞和Trp1T reg细胞，但α-CTLA-4显著减少了Trp1 T reg的细胞数量，显著增加了肿瘤内Trp1T-eff细胞/Trp1T-reg细胞的比率(图2 C). 重要的是，α-CTLA-4作为单一疗法也减少了肿瘤内Trp1T调节细胞的积累(图2 D)表明肿瘤内T调节细胞数量的减少并不依赖于GVAX的给药。三个不同的α-CTLA-4克隆将肿瘤浸润Trp1T调节细胞的数量降低到不同的水平(图3)，这表明这些结果可能不仅仅依赖于α–CTLA-4单克隆抗体阻断CTLA-4的能力。

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图3。

多个α–CTLA-4克隆减少了肿瘤内Trp1 T调节细胞的数量。按照图2带有α-CTLA-4克隆4F10、9D9或9H10。结果显示肿瘤内CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺Trp1 T细胞。n个=每组5只小鼠。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。实验重复了两次。

α-CTLA-4诱导肿瘤浸润性CTLA-4快速消除⁺T调节细胞

为了了解α-CTLA-4治疗后肿瘤内Trp1T调节细胞数量的调节机制，我们评估了Trp1Treg细胞清除的动力学。用GVAX单药治疗小鼠至第10天，以使Trp1T调节细胞浸润强劲(图4 A). 在整个实验过程中，或在第10天用α-CTLA-4单剂量处理小鼠，然后在1天后处死。令人惊讶的是，这两种治疗都显著减少了肿瘤浸润Trp1T调节细胞的数量(图4 A)表明耗竭是一种潜在机制。

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图4。

肿瘤特异性T调节细胞迅速被α-CTLA-4从肿瘤中自动清除。（A） 用1.5×10攻击小鼠⁵B16-BL6第0天，用5×10过户⁴CD4细胞⁺CD45.1型⁺Trp1 T在第3天，并在第3、6和8天用GVAX或GVAX+α-CTLA-4治疗。一些小鼠没有接受进一步治疗，或在第3-10天或仅在第10天接受α-CTLA-4治疗，然后在第11天处死。结果显示肿瘤内CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺Trp1 T细胞。n个=每组9-10只小鼠。（B和C）野生型和CTLA-4-huTg小鼠按照图2结果显示肿瘤内CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺Trp1（B）和CD4⁺CD45.1型⁻内源性多克隆T细胞（C）。（D） CTLA-4型^+/+和CTLA-4^−/−将Trp1 T细胞转移到野生型小鼠中，然后按照图2结果显示肿瘤内CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺Trp1 T细胞。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。实验重复两次并合并。

为了研究α–CTLA-4单克隆抗体与Trp1T调节细胞的直接结合是否介导耗竭，我们将Trp1 T细胞转移到表达人而非小鼠CTLA-4（CTLA-4-huTg；Peggs等人，2009年). 用GVAX和抗小鼠CTLA-4（9H10克隆不与人CTLA-4结合）处理后，表达Trp1T reg细胞的小鼠CTLA-4(图4 B)，但不是内源性多克隆T调节细胞-表达人CTLA-4(图4C)α-CTLA-4抗体和CTLA-4之间的直接相互作用⁺Trp1T调节细胞需要介导肿瘤的耗竭。

为了证实α-CTLA-4治疗是否通过直接结合和耗尽表达CTLA-4的T调节细胞而不是阻断CTLA-4功能来消除肿瘤浸润的Trp1T调节细胞，我们采用了从CTLA-4转移Trp1 T细胞的方法^+/+或CTLA-4^−/−Trp1 TCR转基因动物，然后测量肿瘤内Trp1T调节细胞对GVAX或GVAX和α-CTLA-4的反应。而α-CTLA-4的加入导致肿瘤浸润CTLA-4的数量显著减少^+/+Trp1 T调节细胞，肿瘤浸润CTLA-4的数量无变化^−/−α-CTLA-4治疗后观察到Trp1细胞(图4 D). 这些数据表明，肿瘤中肿瘤反应性T reg细胞数量的减少并不依赖于“阻断”CTLA-4介导的调节，因为肿瘤反应性Trp1细胞上的CTLA-4基因消融并没有导致肿瘤中Trp1T reg的清除。

CTLA-4的快速消除⁺Trp1T调节细胞支持耗竭作为潜在机制，尽管其他机制，如Foxp3表达缺失⁺单元格(Zhou等人，2009年)，或Foxp3分化减少⁻至Foxp3⁺细胞（转化；Benigni等人，2006年;Moo-Young等人，2009年)也可以解释Trp1T调节细胞的减少。为了测试这些可能性，我们使用了Trp1Foxp3^GFP公司报告小鼠在Foxp3启动子下表达GFP以测量转化，并同源标记（CD45.1和/或CD45.2）Trp1T eff细胞（Foxp3⁻)和Trp1T调节细胞（Foxp3⁺)用于跟踪治疗反应中每个隔室的命运的子集。Trp1GFP基因⁻（Foxp3⁻)转移到未经治疗或接受GVAX、α-CTLA-4或GVAX+α-CTLA-4治疗的荷瘤小鼠体内的细胞未能上调GFP或Foxp3(图5 A)，表示Foxp3⁻到Foxp3⁺转化并没有促进肿瘤内Trp1T reg细胞的积累。因此，这些数据还表明，α-CTLA-4不能通过阻止转化来从肿瘤中消除Trp1T reg细胞。为了测试T调节细胞室中Foxp3表达的潜在损失，小鼠被给予CD45.1的混合物^+/+CD25型⁻Trp1T-eff细胞和CD45.1^+/−CD45.2型^+/−CD25型⁺Trp1T调节细胞，然后用GVAX或GVAX+α-CTLA-4治疗(图5 B). 在GVAX+α-CTLA-4治疗后，CD45.1^+/−CD45.2型^+/−CD25型⁺从肿瘤中完全消除Trp1T调节细胞群，以防止Foxp3表达的丢失(图5 B). 此外，在T调节细胞（未显示）中未观察到增殖标记Ki-67的表达存在显著差异，但这是肿瘤浸润T调节细胞丢失的潜在机制。这些数据支持一种模型，即α-CTLA-4通过消耗而不是通过T reg细胞增殖的改变或Foxp3表达的丧失从肿瘤中消除Trp1T reg。

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图5。

肿瘤特异性T调节细胞被α-CTLA-4从肿瘤中清除。（A） CD4细胞⁺GFP公司⁻细胞是从CD45.1中纯化的FACS^+/+B类^W公司RAG公司^−/−Trp1-Foxp3-GFP小鼠，过继性转移到具有三维已建立肿瘤的小鼠中，并按照图2结果显示CD4表达Foxp3⁺CD45.1型⁺肿瘤中的Trp1细胞。（B） 用1.5×10攻击小鼠⁵第0天的B16-BL6，CD25混合物⁻第45页第1页^+/+和CD25⁺CD45.1型^+/−CD45.2型^+/−在第3天过继转移Trp1 T细胞，然后按照图2.（顶部）分选CD25的表型⁻和CD25⁺混合和转移前的Trp1 T细胞。（底部）肿瘤内CD4的绝对细胞数和CD45.2表达⁺CD45.1型⁺Trp1 T细胞。n个=每组5只小鼠。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。实验重复了两次。

T reg细胞耗竭主要由FcγRIV介导

抗体介导的消耗可通过补体介导的裂解发生(Reff等人，1994年;Giorgini等人，2008年;Wang和Weiner，2008年)或抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC；Swanson和Hoppe，2004年;斯图亚特和埃泽科维茨，2005年;Nimmerjahn和Ravetch，2008年). 我们首先使用补体缺乏的C3^−/−老鼠(Giorgini等人，2008年)作为肿瘤反应性Trp1 T细胞的受体，仍然观察到肿瘤浸润性Trp1T调节细胞对α-CTLA-4的反应耗尽(图6 A). 因此，我们调查了ADCC在我们的系统中的潜在参与。在小鼠中，ADCC主要由低亲和力受体FcγRIII和FcγRIV调节(Nimmerjahn等人，2005年;Nimmerjahn等人，2010年;Setiady等人，2010年)，在较小程度上由高亲和力FcγRI(Fossati-Jimack等人，2000年;Tedder等人，2006年;Hamaguchi等人，2006年). 为了确定FcγRs是否介导T reg细胞耗竭，我们使用γ^−/−缺乏所有三种激活FcγRs受体的连锁小鼠(Takai等人，1994年;Clynes等人，1998年). 虽然Trp1T调节细胞(图7 A)和内源性多克隆T调节细胞亚群(图7 B)经α-CTLA-4治疗的野生型小鼠的肿瘤显著减少，γ^−/−链受体小鼠接受α-CTLA-4治疗，表明通过FcγR依赖机制耗竭。消耗也独立于FasL和TRAIL细胞毒性途径发生(图6 B).

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图6。

肿瘤特异性T调节细胞不会被补体、FasL–TRAIL途径或NK/CD8耗尽⁺T细胞。（A–C）按照图2结果显示CD4表达Foxp3⁺CD45.1型⁺补体C3中的Trp1细胞^−/−小鼠（A）、用阻断α-FasL和α-TRAIL抗体治疗的小鼠（B）或用耗尽α-CD8和α-NK1.1抗体治疗的鼠（C）。实验重复了两次。

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图7。

T调节细胞耗竭主要由FcγRIV介导。（A和B）野生型和γ^−/−用B16-BL6攻击小鼠，并按照图2肿瘤内CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺Trp1（A）和CD4⁺第45页第1页⁻内源性多克隆T细胞（B）。n个=每组9-10只小鼠。（C） α-CTLA-4克隆9H10与FcγRI、FcγRAII和FcγROV结合的SPR分析。（D和E）野生型，FcγREII^−/−和FcγRIV^−/−用B16-BL6攻击小鼠，并按照图2肿瘤内CD4的绝对细胞数和Foxp3表达⁺CD45.1型⁺Trp1（D）和CD4⁺CD45.1型⁻内源性多克隆T细胞（E）。（F） 三个不同的α-CTLA-4克隆（4F10，9D9，9H10）与FcγRIV结合的SPR分析。n个=每组7–10只小鼠。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。实验重复三次并合并。

利用表面等离子体共振（SPR），我们确定了α–CTLA-4与不同FcγRs的结合。α-CTLA-4克隆9H10与FcγRI结合的亲和力最高(图7 C). 在ADCC中涉及的两个低亲和力FcγRs中，9H10与FcγRIV结合的亲和力较高，表明其更容易参与衰竭。当我们比较野生型和FcγRIII中α-CTLA-4对肿瘤浸润性T调节细胞的体内耗竭时^−/−和FcγRIV^−/−小鼠，我们观察到FcγRIV中Trp1T调节细胞数部分恢复，内源性多克隆T调节细胞数量完全恢复^−/−，但不在FcγRIII中^−/−老鼠(图7、D和E)，支持FcγRIV在α-CTLA-4治疗后肿瘤浸润性T reg细胞耗竭中的主要作用。有趣的是，我们的三个不同α–CTLA-4克隆与FcγRIV的结合亲和力(图7 F)与体内清除肿瘤浸润T调节细胞的能力相关(图4 A). NK细胞的耗竭，其表达FcγRIII，但没有其他激活FcγRs(Takai等人，1994年;Nimmerjahn和Ravetch，2008年)，不能阻止Trp1T调节细胞对α-CTLA-4的反应(图6 C)，进一步支持FcγRIII在该模型中T调节细胞耗竭中的不必要性。然而，FcγRIV中Trp1T调节细胞的部分恢复^−/−与内源性多克隆T调节细胞室的完全恢复相比，小鼠表明FcγR系统中存在潜在冗余。这可以通过靶分子表达水平的差异来解释，因为Trp1 T调节细胞表达的表面CTLA-4水平高于内源性T调节细胞（参见图9、A和B)，可能增加其对其他FcγRs耗竭的敏感性，以补偿FcγRIV的损失。与此相一致，FcγR与9H10克隆具有高亲和力(图7 C)，也能诱导ADCC(Otten等人，2008年)，提示FcγR在Trp1T调节细胞耗竭中的潜在作用。尽管如此，我们的数据表明FcγRIV是内源性肿瘤浸润性T调节细胞耗竭的关键介质。

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图9。

肿瘤浸润性T reg细胞表达高水平的表面CTLA-4。CD4表达（A和B）表面CTLA-4⁺CD45.1型⁺Trp1（A）和CD4⁺CD45.1型⁻GVAX治疗小鼠肿瘤和淋巴结中的内源性多克隆T细胞（B）（如图2). 阴影直方图表示CTLA-4-huTg小鼠。n个=每组11只小鼠。（C） CD4表面CTLA-4表达的定量⁺Foxp3系列⁺GVAX或GVAX+α-CTLA-4治疗后淋巴结和肿瘤中的多克隆T调节细胞。小鼠接受GVAX或GVAX+α-CTLA-4（克隆9H10）治疗，如图2并在第10天献祭。内源性CD4表面CTLA-4的表达⁺Foxp3系列⁺通过α-CTLA-4克隆4F10染色检测T调节细胞，该克隆未被克隆9H10交叉阻断。n个=每组11–14只小鼠。*，P<0.05；**，P<0.01；***，P<0.001。实验重复两次并合并。

CD11b型⁺FcγRIV⁺巨噬细胞在肿瘤微环境中富集

考虑到小鼠ADCC主要由巨噬细胞介导(Uchida等人，2004年;Tedder等人，2006年;Setiady等人，2010年)接下来，我们评估了肿瘤内巨噬细胞和其他免疫亚群上FcγRIV的表达。如前所示(Nimmerjahn等人，2005年)，FcγRIV的表达仅限于CD11b⁺单元格(图8 A). 赖氨酸6C^你好赖氨酸6G⁻巨噬细胞(Shi等人，2011年)构成CD11b的大多数⁺FcγRIV⁺种群，而Ly6^洛赖氨酸6G⁺中性粒细胞和CD11c⁺I-A公司⁺树突状细胞只是一个次要成分(图8 B). 特别值得注意的是，CD11b⁺相对于淋巴结，肿瘤中的细胞富集了70倍(图8 C)，其中未发生消耗(图2 B). 巨噬细胞特异性标记物Iba1的染色组织切片证实肿瘤中存在巨噬细胞(Graeber等人，1998年)与淋巴结相比，肿瘤中的巨噬细胞密度要高得多(图8 D). 最后，肿瘤内CD11b上FcγRIV的表达显著升高⁺细胞，但在CD11b上几乎检测不到⁺淋巴结细胞(图8 E). 重要的是，α-CTLA-4没有改变CD11b的百分比⁺肿瘤中的细胞(图8 C)或通过肿瘤浸润CD11b表达FcγRIV⁺单元格(图8 E)，表明T reg细胞耗竭不是由于肿瘤中巨噬细胞的数量或功能对α-CTLA-4的反应而普遍增加所致。

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图8。

表达高水平FcγRIV的吞噬细胞在肿瘤微环境中富集。（A–E）按照图2（A）肿瘤内CD11b代表性FcγRIV表达⁺，NK1.1⁺和CD3⁺细胞。（B） 肿瘤内CD45.2的代表性CD11c、I-A、Ly6C和Ly6G表达⁺CD11b型⁺FcγRIV⁺细胞。（C） CD45.2上CD3和CD11b的表达⁺淋巴结和肿瘤中的细胞。n个=每组10只小鼠。（D） GVAX治疗小鼠淋巴和肿瘤中Iba1和Foxp3的表达。棒材，100µm。（E） CD11b表达FcγRIV⁺淋巴结和肿瘤中的细胞。阴影直方图表示CD11b表达FcγRIV⁺来自FcγRIV的细胞^−/−老鼠。n个=每组10只小鼠。*，P<0.05；***，P<0.001。实验重复两次并合并。

肿瘤浸润性T调节细胞表面CTLA-4表达升高

α-CTLA-4对肿瘤内Trp1T调节细胞和内源性T调节细胞的选择性耗竭(图2 C和7亿)表明α-CTLA-4优先与T调节细胞室相关。与此一致，CTLA-4在Trp1T调节细胞上的表面表达显著升高(图9 A)和内源性T调节细胞(图9 B)与对应的效应器相比。此外，与内源性T reg细胞相比，Trp1T reg细胞表达更高水平的表面CTLA-4(图9、A和B)并且更容易被α-CTLA-4耗尽(图7，A和B). 此外，与淋巴结相比，肿瘤中表面CTLA-4的表达增加，而淋巴结中没有出现缺失(图2、B和C). 最后，在α-CTLA-4治疗后，T reg细胞区室的表面CTLA-4水平仅在肿瘤部位显著降低(图9 C). 这些数据表明，肿瘤中T调节细胞的缺失与T调节细胞亚群增加的CTLA-4表面表达和CD11b的富集有关⁺FcγRIV⁺肿瘤微环境中的巨噬细胞。

我们要感谢Tsvetelina Pencheva Hoang和Andrew Furness对这份手稿的批判性审查。

T.R.Simpson获得了加拿大卫生研究院博士研究奖的支持。S.A.Quezada由英国癌症研究职业发展奖学金资助，是癌症研究所研究员奖的获得者。K.S.Peggs和F.Arce获得了英国白血病淋巴瘤研究所的资助。

J.P.Allison是加利福尼亚大学授予Bristol-Meyers Squib的知识产权发明人，也是Bristol-Mayers Sgibb的顾问。

作者没有进一步的财务利益冲突。