靶向乳酸代谢用于癌症治疗

摘要

癌细胞中的乳酸稳态

癌细胞通过有氧糖酵解来支持其增殖和合成代谢生长，这一现象被称为Warburg效应(1,2). 有氧糖酵解能迅速产生ATP，并将葡萄糖中的碳转移到合成核苷酸、蛋白质和脂质的前体中。由于这种转换，葡萄糖优先分解为乳酸，而不是通过线粒体氧化磷酸化（OXPHOS）完全代谢为二氧化碳。癌细胞的谷氨酰胺分解代谢也支持合成代谢生长，维持TCA循环中间产物，并调节氧化还原平衡(三–5). 这些活动增加了乳酸的产生，尽管其程度低于葡萄糖分解代谢产生的乳酸。具体来说，谷氨酰胺酶（GLS）引导谷氨酰胺转化为谷氨酸，然后谷氨酸脱氢酶将谷氨酸转化为α-酮戊二酸（αKG），进入TCA循环。然后由αKG生成的苹果酸可以退出TCA循环，并被苹果酸酶（ME）转化为丙酮酸，这有助于通过NADPH的产生实现氧化还原平衡。谷氨酰胺在胰腺导管癌中的替代使用包括谷氨酸和草酰乙酸（OAA）转氨为αKG和天冬氨酸(5). 天冬氨酸退出线粒体并转氨化回OAA和谷氨酸；然后OAA转化为苹果酸，随后转化为丙酮酸。最后，丙酮酸通过乳酸脱氢酶A（LDHA，图​图11).

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图1

癌细胞中的有氧糖酵解和谷氨酰胺解。

癌蛋白驱动参与糖酵解和谷氨酰胺酶解的基因表达，从而产生过量的乳酸。异常PI3K/AKT信号转导和转录癌蛋白HIF-1α和MYC调节GLUT、HK2、TPI、ENO和LDHA的转录。HIF-1α诱导PFKFB3的转录，这有利于PFK1变构激活物F2,6BP的产生。抑癌蛋白p53诱导TIGAR的表达，TIGAR使F2,6BP去磷酸化，阻断PFK1的激活并抑制糖酵解。HIF-1α和MYC调节PKM2亚型的表达和剪接。MYC还调节谷氨酰胺转运体ASCT2和GLS的表达。单羧酸转运体（MCT）输出乳酸和质子，并受HIF-1α和MYC调节。乙酰辅酶A；天冬氨酸；ASCT2，谷氨酰胺转运体；G、 葡萄糖；G6P、葡萄糖-6-磷酸、F6P、果糖-6-磷酸；磷酸二羟基丙酮；GA3P，甘油醛-3-磷酸；1,3BPG，1,3-二磷酸甘油酯；2PG，2-磷酸甘油酯；3PG，3-磷酸甘油酯；磷酸烯醇丙酮酸；苹果酸脱氢酶；谷氨酸-草酰乙酸转氨酶；GLUD1，谷氨酸脱氢酶。

癌症中的致癌病变通过诱导几种糖酵解酶的表达和激活，驱动向有氧糖酵分解和乳酸生成的转变（图​（图1）。1). 首先，异常的PI3K/AKT信号转导诱导高亲和力葡萄糖转运蛋白（即GLUT1和GLUT4）的表达和细胞表面表达，并激活己糖激酶2（HK2）和6-磷酸果糖激酶1（PFK1）(6–8). 其次，转录癌蛋白MYC和HIF-1α诱导几种糖酵解酶的表达，包括HK2、葡萄糖-6-磷酸异构酶（GPI）、PFK1、醛缩酶（ALDO）、二磷酸果糖（FBP）、磷酸三糖异构酶、GAPDH、磷酸甘油酸激酶（PGK1）、烯醇酶1（ENO1）、丙酮酸激酶、肌肉（PKM）和LDHA(9–12). 此外，MYC通过诱导谷氨酰胺转运体ASC样Na的转录增强谷氨酰胺分解代谢⁺-依赖性中性氨基酸转运体（ASCT2；也称为SLC1a5）和抑制microRNA 23a/b（miR-23a/b），这通常阻碍GLS翻译(13,14). 较高的GLS表达导致谷氨酰胺摄取和分解代谢增加，再次增加乳酸生成。第三，癌细胞中出现的前馈通路加快了糖酵解通量：（a）LDHA生成NAD⁺由GAPDH使用；（b） p53抑癌基因的功能丧失突变导致TIGAR（TP53诱导的糖酵解和凋亡调节因子，一种果糖-2,6-二磷酸酶）减少，从而导致果糖-2.6-二磷酸（F2,6BP）增加（图​（图1），1)变构激活PFK1(15,16); 和（c）HIF-1α诱导双功能酶6-磷酸果糖-2-激酶/F2,6BP（PFKFB3）增加F2,6BP水平并激活PFK1(17,18). 第四，MYC诱导选择性剪接因子的转录，以促进PKM2的产生，PKM2是丙酮酸激酶的一种正常胚胎同种型，催化效率低，有利于有氧糖酵解(19,20). 最后，通过MYC或HIF-1α定向诱导丙酮酸脱氢酶（PDH）激酶1（PDK1）使糖酵解偶联到OXPHOS被禁用，PDK1磷酸化并使PDH失活（图​（图11和参考文献。21,22).

正常细胞和癌细胞中的乳酸稳态需要由溶质载体16a家族的四个成员运输，该家族由12个膜传递、促进性和质子连接的单羧酸转运体组成：MCT1（也称为SLC16a1）、MCT2（参考文献中审查。23). 这些转运体引导乳酸通过质膜的流入和流出，癌细胞产生的过量乳酸被MCT清除。转运取决于pH值、乳酸的细胞内与细胞外浓度以及MCT的其他底物水平，包括醋酸盐、丙酮酸、丁酸和酮体(24,25). 质子与乳酸的共传输可防止乳酸的毒性积累和细胞内环境的酸化。因此，MCT的乳酸转运对癌细胞来说是一种治疗脆弱性。

乳酸脱氢酶及其在肿瘤发生中的作用

LDH介导丙酮酸和乳酸的双向转化，是一个新兴的抗癌靶点（图​（图2）。2). LDH是由两种不同的亚单位LDHA和LDHB组成的四聚体，可以组装成五种不同的组合（LDH1由四种LDHB亚单位组成；LDH2包含三种LDHB和一种LDHA亚单位；LDH3包含两种LDHB2种LDHA子单位；LDH 4包含一种LDHB3种LDHA亚单位；LD H5包含四种LDHA分单位）（图​（图22和参考。26). LDHB广泛表达，尽管它是心肌中的主要亚型。LDHA是骨骼肌和其他高度糖酵解组织中的主要亚型。值得注意的是，LDHA对丙酮酸有较高的亲和力，而V_最大值丙酮酸比LDHB减少。鉴于此，LDHA，尤其是LDH5四聚体，将丙酮酸分解为乳酸并产生NAD⁺对其他代谢酶如GAPDH至关重要（图​（图11和参考。27). 相反，LDHB将乳酸转化为丙酮酸，这使得细胞可以将乳酸用作氧化代谢（例如心脏组织和神经元）和/或糖异生（例如肝脏和肾脏）的营养源(27).

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图2

乳酸脱氢酶活性和四聚体。

(A类)LDH介导乳酸和NAD之间的氧化还原偶联转换⁺含丙酮酸和NADH。(B类)功能性LDH酶是一种含有不同比例的LDHA和LDHB亚单位的四聚体。显示了五种LDH四聚体的组成。

LDHA水平升高是许多肿瘤的标志，其中大多数肿瘤具有高度糖酵解作用，高LDHA意味着人类几种恶性肿瘤预后不良(28–30). LDHB与癌症的关系更为复杂；低密度血红蛋白在几种癌症类型中，启动子甲基化使其沉默，但在其他癌症类型中过度表达或扩增，例如在人类肺腺癌中KRAS公司睾丸生殖细胞肿瘤中的突变(31–35). 因此，靶向LDHA、LDHB或两者的抗癌药物的疗效可能因癌症类型和代谢表型而异。

遗传学研究已经提供了原理证据，证明靶向LDHA是癌症治疗的一种有吸引力的策略。首先，选择性敲除LDHA抑制了几种转化细胞系的锚定非依赖性生长(10)以及移植性乳腺肿瘤的体内生长(36). 此外，LDHA的小分子抑制剂FX11可抑制人类胰腺癌和淋巴瘤异种移植物的生长。有趣的是，LDHA的失活或抑制会导致活性氧的产生，而低氧会加剧活性氧的生成，从而导致糖酵解(36–38). 虽然ROS的增加可能是由于丙酮酸盐转向氧化代谢，但MCT1抑制剂的机制研究表明，LDHA活性的丧失可能通过对糖酵解和细胞主要抗氧化剂谷胱甘肽合成的负反馈作用而引发ROS的升高(39).

癌细胞通常不使用乳酸作为营养物质，而是输出乳酸，从而使肿瘤环境酸化(40). 有趣的是，乳酸外流引发局部炎症反应，吸引免疫细胞，如巨噬细胞，巨噬细胞分泌细胞因子和生长因子，从而驱动肿瘤细胞生长和转移(41,42). 事实上，炎症反应通常是肿瘤进展所必需的，炎性细胞数量增加，如肿瘤相关巨噬细胞，意味着预后不良(41). 此外，肿瘤细胞环境中的乳酸会损害适应性免疫反应，使免疫监视失效(43–46). 因此，乳酸似乎也通过非肿瘤细胞介导的炎症和免疫反应促进肿瘤发生。

出乎意料的是，最近一篇关于B细胞淋巴瘤（λ-Myc公司转基因小鼠）表明LDHA对淋巴瘤的发生和发展是不可或缺的(47). 鉴于乳酸在维持恶性状态中的明显重要性以及它容易引发炎症从而促进肿瘤进展，这一发现尤其令人惊讶。作者发现利达严重降低LDHA活性，不影响人类Burkitt淋巴瘤模型中的淋巴magenisis(47). 因此，并非所有癌症都需要高LDHA活性，或者肿瘤细胞代谢可能适应其他获取能量的方式，例如在面临MYC等强致癌突变时，转向OXPHOS。这些发现还表明，如果与其他强制依赖糖酵解的药物联合使用，LDHA抑制剂的疗效将得到增强。

LDHA抑制剂作为癌症治疗药物

LDHA通常被认为是人类安全的治疗靶点，因为在人类中，LDHA基因的20 bp的遗传缺失LDHA公司导致LDHA蛋白丢失的基因只有相对轻微的劳力性肌病症状(48,49). 因此，正在测试几种LDHA抑制剂的抗癌活性（表​（表1）。1). 棉酚（也称为AT-101）是棉籽中的一种天然产物，是一种非选择性LDH抑制剂，可阻止NADH与K（K）_我LDHA和LDHB分别为1.9和1.4μM(50,51). 这种化合物最初是作为抗疟药物开发的，但现在正用于一期和二期临床肿瘤学试验(52–54). 然而，棉酚也抑制GAPDH，GAPDH是一种NAD⁺-依赖酶，因此其抗肿瘤活性可能还包括抑制GAPDH。此外，FX-11是一种棉酚衍生物，对LDHA比LDHB具有选择性(K（K）_我分别为0.05μM和20μM）(55)，在异种移植模型中具有抗肿瘤活性，并有潜力发展成为癌症治疗药物(37,56). 另一种化合物，没食子酸黄素，是使用NCI开放化学收藏从基于结构的筛选中鉴定出来的。在较高浓度（250-μM）下，胆黄素抑制LDH亚型，诱导肝细胞癌细胞株凋亡，并抑制乳腺癌细胞增殖(55,57). 最后，基于N-羟基吲哚的化合物被开发出来，它比LDHB更有效地抑制LDHA，并且这些药物通过微摩尔IC破坏癌细胞系和原代癌培养物的增殖₅₀活动(58). 总的来说，这些药物是LDHA抑制剂的良好起点，尽管显然需要开发更有效和更具选择性的化合物。

表1

LDH和MCT1/MCT2抑制剂

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靶向MCT乳酸盐转运蛋白作为癌症治疗药物

高度糖酵解细胞利用MCT转运体输出LDH产生的乳酸和质子；因此，MCT是细胞内乳酸盐和pH的关键调节因子。然而，MCT功能对于乳酸盐输入使用乳酸盐作为氧化代谢产物的细胞（如心脏和骨骼肌）或使用乳酸盐作为糖异生底物的细胞（如肝脏和肾脏）也是必要的（参考文献综述）。59). MCT1在大多数组织中低水平表达，而MCT4在白色骨骼肌纤维中高水平表达，在其他组织（如睾丸、肺和胎盘）以及一些细胞类型（如软骨细胞、白细胞和星形胶质细胞）中低水平表示。MCT2和MCT3的表达模式更受限制；MCT2主要在肝脏、肾脏和大脑神经元中表达，而MCT3的表达仅限于基底外侧视网膜色素上皮和脉络丛。

MCT转运体的一个显著且可开发的特征是，耳蜗酮免疫球蛋白家族的单膜通过蛋白是其运输到细胞膜表面所必需的。具体来说，MCT1、MCT3和MCT4与CD147（也称为basigin、EMMRIN和OX-47）结合，CD147是它们在细胞表面表达所必需的，而MCT2结合并需要enbigin来实现细胞表面表达(60,61). 值得注意的是，CD147在细胞表面的表达也依赖于与MCT蛋白的共同表达，这种相互作用稳定了两个结合伙伴(62).

Marked increases in the levels ofMCT1型和/或MCT4型是几种人类恶性肿瘤的标志，这些转运体的高水平意味着不良结果。例如MCT1型在乳腺癌、结直肠癌、胃癌、宫颈癌以及神经母细胞瘤和胶质瘤中检测到(63–68). 相反，MCT4型在肾细胞癌以及宫颈癌和前列腺癌中的表达高度升高(65,69,70). 重要的是MCT1型和MCT4型在癌症中，使用小分子抑制剂和/或靶向其耳蜗CD147，例如使用CD147特异性抗体疗法，为禁用这些转运蛋白提供了一个治疗窗口。

虽然基本上对控制MCT2型和MCT3型一些研究揭示了MCT1型和MCT4型表达。MCT4型是HIF-1α的直接转录靶点，在缺氧时显著上调(71,72).MCT4型也在几种组织和细胞类型（如星形胶质细胞）的基础水平表达，尽管基础表达调控的机制尚不清楚。MCT1型在启动子处组蛋白甲基化（H3K27me3）和转录物的miR靶向作用下，胰腺β细胞中的表达通常被沉默(73,74). 此外，MCT1型乳腺癌细胞系MDA-MB-231中有CpG岛启动子甲基化和转录抑制的记录(75). 其他线索似乎也在调节MCT1型表达式。在肌肉细胞中，高强度运动后细胞外乳酸的增加会诱导MCT1型表达，显然是通过ROS的产生(76)，此响应可能与MCT1型在高度糖酵解、氧化的肿瘤细胞和沐浴在乳酸中的相邻基质细胞中进行控制。此外，p53抑制MCT1型转录并降低MCT1型低氧时转录物；因此，肿瘤发生过程中p53的丢失或获得治疗耐药性也会增加MCT1型表达式(77). 第四阶段人类神经母细胞瘤MYCN公司放大表示高水平的MCT1型成绩单(64)表明MYC调节MCT1型转录。增加了MCT1型在表达高水平MYC公司在表达式数组中也已注意到(78,79)，和MYC结合的全基因组染色质免疫沉淀分析表明，MYC与MCT1型正常细胞系和癌细胞系的启动子(80). 总的来说，这些发现表明MCT1可能是MYC的转录靶点，靶向MCT1是一种抑制MYC驱动的恶性肿瘤的有吸引力的策略。

基因敲除研究和几种小分子抑制剂的开发已经确立了靶向乳酸转运蛋白在癌症治疗中的相关性。胶质母细胞瘤（GBM）细胞中MCT1（在某些情况下为MCT2）的敲除或小分子a-氰基-4-羟基肉桂酸（CHC）对MCT的抑制会损害GBM细胞的增殖、迁移和生存(39,63,81). 此外，CHC损害颅内异种移植物中GBM的致瘤潜能(82). 更令人信服的是，使用高度选择性和有效的MCT1/MCT2抑制剂抑制MCT1，该抑制剂最初由阿斯利康开发，用于阻止活化T细胞的增殖（例如，AR-C155858；参考文献。83,84)损害Ras转化成纤维细胞的生长和致瘤性(85). 此外，第二代MCT1/MCT2抑制剂（AZD3965）目前正在进行晚期实体瘤和弥漫性大B细胞淋巴瘤的I期临床试验(86). 然而，这些药物无法清除其他表达MCT1的肿瘤的缺氧区域，因为HIF-1α定向诱导MCT4型(85). 此外，这些药物不与MCT4结合，因此对表达MCT4的肿瘤和转化细胞系无效。MCT4在肿瘤发生中也起着关键作用，敲除实验表明，MCT4是表达MCT4的肿瘤细胞迁移和侵袭所必需的(62,87,88)以及肿瘤细胞与基质细胞在肿瘤微环境中的相互作用（见下文）。因此，显然需要开发具有泛MCT抑制剂功能或选择性禁用MCT4的强效小分子。

靶向MCT伴侣用于癌症治疗

鉴于其对MCTs在细胞膜上的稳定和定位的要求(60)，以CD147为靶点也是一种有吸引力的抗肿瘤策略。一种方法涉及产生人源化抗CD147抗体，该抗体可诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性（ADCC）。这种抗体也可用于将共价连接的药物有效载荷递送到表达CD147/MCT的肿瘤细胞，这将杀死癌细胞，而不管它们的MCT表达状态如何。此外，有机汞试剂第页-氯汞磺酸盐（pCMBS）通过破坏MCT1和MCT4与CD147的结合来抑制它们的活性(89). 从机械上讲，这种破坏是通过pCMBS定向还原CD147类Ig结构域中的二硫键而发生的。然而，这种药物可能是混杂的，可能以其他免疫球蛋白家族蛋白为靶点。通过敲除研究和使用抗CD147抗体，证明靶向CD147是一种有吸引力的方法，这表明，正如预期的那样，CD147功能的丧失显著降低了MCT1和MCT4蛋白的水平，并损害了肿瘤异种移植物的生长(85,90,91). 然而，值得注意的是，CD147在细胞表面广泛表达并与其他蛋白质相互作用，最显著的是基质金属蛋白酶、整合素-β1和亲环素(92). 因此，可能需要选择性靶向CD147-MCT相互作用的方法来建立治疗窗口。

乳酸梭子

在正常条件下，MCT还促进乳酸在细胞群之间的穿梭，例如在产生乳酸并表达MCT1和MCT4的星形胶质细胞和表达MCT2的神经元之间(93). 乳酸的穿梭与酸向细胞外环境的单向输出相反，似乎在肿瘤的发展、生长和转移中起着重要作用。事实上，在癌症中有三种乳酸穿梭模型：“反向华伯格效应”、代谢共生和血管内皮细胞穿梭。值得注意的是，在这些情况下抑制MCT功能有助于MCT抑制剂在体内的抗癌活性。

相反的Warburg效应表明，肿瘤细胞可以刺激邻近的基质细胞进行糖酵解并输出乳酸（以及酮类，也许还有丙酮酸），然后被癌细胞吸收并用于氧化代谢(94). 在这个模型中，癌细胞被认为通过分泌过氧化氢为基质成纤维细胞创造“假低氧”环境(95)激活基质细胞中HIF-1α、糖酵解和MCT4的表达。然后，新生成的乳酸通过MCT4从基质细胞中输出，并通过MCT1导入癌细胞（图​（图3）。三). 为了支持这一模型，对乳腺癌异种移植物的分析表明，PKM2和MCT4确实在基质成纤维细胞中表达，而线粒体质量标记物（TOMM20）、OXPHOS（COX）和MCT1可以在乳腺癌细胞中检测到(96–98). 在共培养实验中，可以重述成纤维细胞中糖酵解的诱导和癌细胞中乳酸的氧化，MCT1的敲除和CHC的抑制证明了肿瘤细胞在这种穿梭中的内在作用(99,100). 然而，逆转Warburg效应在肿瘤中肯定不是普遍存在的，因为许多肿瘤类型具有高度糖酵解和/或表达MCT4。尽管如此，很容易想象这种相互作用如何在肿瘤发展过程中表现出来，例如在ATP生成比合成代谢生长更重要的情况下。

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图3

三种模型的乳酸在癌症中穿梭。

(A类)当癌细胞分泌过氧化氢时，会产生相反的Warburg效应，过氧化氢被认为会在基质中产生假低氧环境。反过来，这会诱导基质成纤维细胞中HIF-1α、MCT4的表达和糖酵解，然后通过MCT4排出多余的乳酸。基质衍生乳酸随后由肿瘤细胞通过MCT1导入，并用作氧化代谢物。(B类)在代谢共生中，肿瘤低氧区的肿瘤细胞通过MCT4流出乳酸，然后由低氧区肿瘤细胞经MCT1导入乳酸，并用作氧化代谢产物。这种穿梭有助于将葡萄糖输送到肿瘤的缺氧区域。(C类)在血管内皮细胞乳酸穿梭器中，肿瘤细胞通过MCT4流出乳酸，MCT4由血管内皮细胞通过MCT1输入。然后，乳酸转化为丙酮酸，丙酮酸激活HIF-1α和NF-κB/IL-8信号。

肿瘤内癌细胞之间的乳酸穿梭也被认为是代谢共生的一种形式(101). 在这个模型中，高度糖酵解、缺氧的肿瘤细胞产生并流出乳酸，然后乳酸被更多氧化肿瘤细胞导入并代谢。这种穿梭被认为有助于葡萄糖从血管系统输送到肿瘤中，以提供缺氧的肿瘤细胞（图​（图3）。三). Sonveaux及其同事已经证明，异种移植瘤的MCT1表达和缺氧区域是相互排斥的(101). 此外，CHC可损害异种移植物肿瘤的生长(101). 这些发现表明，MCT1可以直接将乳酸吸收到依赖OXPHOS的肿瘤细胞中，并且MCT功能对肿瘤生长至关重要。此外，CHC似乎通过迫使氧化肿瘤细胞依赖葡萄糖而非乳酸，有效地使肿瘤的缺氧区域饥饿。为了支持这一模型，在肿瘤异种移植物中，CHC治疗可以引起葡萄糖摄取从严格缺氧区域暂时重新分布到缺氧和非缺氧区域(102).

最后，乳酸穿梭与肿瘤细胞与血管内皮细胞的相互作用有关。这里，乳酸作为一种信号分子而不是代谢中间体发挥作用，在通过MCT1导入后，乳酸诱导内皮细胞迁移、导管形成和肿瘤血管生成。内皮细胞中乳酸诱导的信号传导可能稳定HIF-1α并激活自分泌NFB/IL-8通路(103,104)（图​（图3）。三). 从机械角度来看，HIF-1α的稳定化被认为是通过乳酸转化为丙酮酸来实现的，丙酮酸与αKG竞争以结合脯氨酰羟化酶（PHD），PHD通常是HIF-1β中的羟化脯氨酸残基，并标记它们泛素化和蛋白酶体的破坏(105,106). 为了支持这一模型，MCT1的敲除或抑制可阻止乳酸介导的HIF-1α体外稳定，而CHC可抑制肿瘤异种移植物中的血管生成(103,104). 另一方面，对于大量（超过500个）人类肿瘤，在肿瘤相关血管表面未检测到MCT1(107). 然而，乳酸诱导HIF-1α的能力并不局限于血管内皮细胞，也存在于一些肿瘤细胞系中(105,108).

靶向乳酸代谢和转运的前景

乳酸对肿瘤细胞生物学的许多组成部分（从肿瘤细胞到癌细胞与邻近癌细胞、基质和血管系统相互作用的关键代谢调节剂的内在作用）的新作用，以及LDHA和MCT抑制剂的强大抗癌活性，验证该电路作为下一代癌症代谢疗法的高优先级靶点。首要目标包括开发更有效和选择性的LDHA抑制剂，识别和优化MCT4抑制剂或pan-MCT抑制剂，以及靶向CD147的药物（例如小分子和人源化抗CD147治疗性抗体）。当然，在开发此类药物的过程中，例如，肌肉组织中表达的高水平MCT，会引起对适当治疗窗口的担忧。另一方面，这些药物似乎是安全的，顶级MCT1/MCT2和LDHA抑制剂正在进行临床肿瘤学试验（表​（表1）。1). 因此，真正有希望的是，以乳酸代谢和转运为目标的药物将增加我们的抗癌武器。最后，为了优化此类药物的疗效，显然需要更好地了解乳酸在人类恶性肿瘤中的穿梭，包括针对肿瘤类型和穿梭发生的肿瘤发展阶段的研究。

致谢

脚注

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