酵母中的沉默是一种转录抑制形式，需要组装一种特定的遗传染色质结构，类似于后生动物中的异染色质(1,2). 沉默的染色质在整个细胞周期中受到转录抑制(三)将其与包含调控或组成性表达的大量染色质基因区分开来。在酵母中酿酒酵母沉默信息调节蛋白Sir2p、Sir3p和Sir4p是沉默隐秘交配型位点和端粒所需的特殊染色质相关蛋白(2,4). 遗传和分子研究已经证实Sir3p和Sir4p都与沉默的染色质有关体内，至少部分通过与组蛋白H4 N末端的相互作用(5,6). 此外，Sir3p与组蛋白H4和组蛋白H3的N末端尾部相互作用在体外(7). 这些数据提供了支持染色质-Sir蛋白复合物在建立和/或维持沉默状态中发挥关键作用的证据。最近发现Sir2p是一种独特的NAD依赖性组蛋白脱乙酰化酶(8,9)进一步加强了染色质在转录沉默中的潜在功能重要性（参见参考文献。10).
虽然染色质是Sir介导的转录沉默的关键参与者，但其功能的分子基础尚不清楚。未折叠的“10-nm”染色质纤维可以简单地用作沉默蛋白抑制复合物组装的锚，而不涉及任何高阶染色质结构（例如，参见参考文献。7). 另一种可能性是，Sir3p等蛋白质与高等生物的连接组蛋白类似，以稳定广泛折叠、转录抑制的“30-nm”纤维。或者，通过结合核心组蛋白尾部结构域(11)Sir3p等蛋白质可能导致染色质纤维大规模重组为抑制性“超结构”，其整体结构特性超过典型的10-nm和30-nm纤维。尽管每个模型都涉及Sir3p的基本不同的分子功能，但它们都与现有的遗传和生物化学证据相一致。因此，区分这些可能的Sir3p作用模式需要直接表征Sir3p与染色质结合引起的结构效应。
在这项工作中，我们将杆状病毒表达的重组Sir3p（rSir3p）纯化到>90%的同质性，并对rSir3dp与染色质的相互作用进行了生化研究在体外我们的结果表明，Sir3p以接近1的摩尔比与核小体阵列、单核小体和裸DNA结合，在琼脂糖凝胶上产生了一系列非常大的超移位复合物。rSir3p与核小体阵列的结合被核心组蛋白尾部结构域的蛋白水解去除显著抑制，但并未完全消除。超转移复合物中的连接体DNA在复合物形成后仍能被限制性内切酶切割。综上所述，这些结果表明，rSir3p将单个核小体阵列“交联”为独特的超分子复合物，其结构特性与典型的10-nm和30-nm染色质纤维有根本不同。基于这些数据，我们假设Sir3p的功能至少部分是通过介导经典染色质纤维的全局重组进入专门的高级染色体结构域。
材料和方法
Sir3p纯化。
将表达rSir3p的重组杆状病毒与六个串联C末端组氨酸融合，感染Sf9昆虫细胞。感染40小时后，从收获的细胞中制备核提取物(12). 通过硫酸铵分级、Q-Sepharose色谱和Ni亲和色谱进一步纯化Sir3p。按说明将纯化的蛋白质透析到缓冲液H中(12). rSir3p浓度通过SDS/PAGE后与已知量的BSA标准品进行比较，并通过Bradford试验（Bio-Rad）进行测定。这两种方法得到了相同的结果。
裸DNA、单核小体和核小体阵列的制备。
含有12个串联208-bp重复序列的208-12 DNA模板莱特希努斯从pPol-I 208–12质粒中纯化5S rDNA(13)，如上所述(14). 208–1 DNA片段是由含有10个单位的208–12片段的消化产生的艾娃I/μg DNA在37°C下保持60分钟。pXP10质粒，包含单个爪蟾5S基因克隆到pUC18(15)，用10单位的生态37°C下60分钟的RI/μg DNA。
如前所述纯化鸡红细胞组蛋白八聚体(14). 无尾组蛋白八聚体通过固定化胰蛋白酶有限消化产生，并通过羟基磷灰石色谱纯化(16). 通过18%SDS/PAGE凝胶电泳评估消化程度。只有那些由鉴定的P1-P5肽组成的制剂(17,18)使用了。纯化后，组蛋白八聚体在4°C下储存，并分别加入20μg/ml抑肽酶和亮氨酸蛋白酶。
如前所述，通过盐透析，从完整或胰蛋白酶化的核心组蛋白八聚体及其各自的DNA以1.1摩尔八聚体/摩尔208-bp DNA的比率重建核小体阵列和单核小体(19). 最后的透析步骤是在pH 7.8（TE）条件下，使用含有10 mM Tris●HCl、0.25 mM EDTA和2.5 mM NaCl的缓冲液。如前所述，通过TE缓冲液中的沉降速度来检测重组体的完整性(19).
Sir3p结合研究。
谷胱甘肽S公司-转移酶（GST）融合蛋白表达于大肠杆菌BL21（DE3，pLys E）细胞，并通过将细菌裂解物与100μl谷胱甘肽珠（Amersham Pharmacia）混合在25 mM Hepes KOH（pH 7.6）、0.1 mM EDTA、12.5 mM MgCl中进行纯化2、10%甘油和0.05%Nonide P-40+0.2 M KCl，在4°C下保持60分钟。使用50 mM Tris●HCl（pH 8.0）和10 mM谷胱甘肽从珠中洗脱GST融合产物(20). 通过SDS/PAGE和考马斯染色监测GST尾部融合的纯度。对于融合蛋白结合研究，如所述制备10μg GST或GST融合蛋白，结合到100μl TGD中的GST珠（20 mM Tris，pH 8.0/150 mM NaCl/1 mM DTT/0.1%Triton X-100）(7). 以3 mol Sir3p/mol GST或GST融合的比例添加Sir3p，并在4°C下旋转培养30分钟。用1 ml TGD洗涤珠子五次，并在SDS/PAGE样品缓冲液中洗脱蛋白质。100%的洗脱液和50%的输入物质通过SDS/PAGE进行了分离，凝胶用考马斯蓝染色。
为了研究Sir3p与核小体底物和DNA的结合，将200 ng 208–12个核小体阵列、单核小体或pXP10染色质与Sir3p~208 bp的摩尔比进行培养(第页警报器3p)在室温下培养30分钟。在含有10 mM Tris、0.25 mM EDTA、7.5 mM NaCl和1.75 mM MgCl的缓冲液中进行培养2随后将甘油添加至最终10%的百分比，并在1%琼脂糖凝胶上用1×TBE（30 mM硼酸三钠/2 mM EDTA，pH 8.0）缓冲，在8 V/cm下电泳样品2 h。根据制造商的规范，凝胶用SYBR绿（分子探针）染色。对于可及性研究，相同样品的等分样品用10单位的生态37°C下RI/μg DNA 90 min。通过添加EDTA至最终浓度15 mM，停止消化。将天然核小体阵列和核小体数组加Sir3p复合物加载到1%琼脂糖凝胶（1×TBE）上，并在8 V/cm下电泳2 h。为了测定样品的DNA组成，用10μg蛋白酶K在50℃下处理等分样品60分钟，提取苯酚/氯仿，并沉淀乙醇。将DNA重新悬浮在10μl染料溶液中，并在1%琼脂糖凝胶（1×TBE）上以8 V/cm的速度电泳2 h。
结果
rSir3p的纯化和表征。
利用离子交换和亲和层析相结合的方法，从杆状病毒感染的昆虫细胞中纯化重组全长Sir3p（rSir3p），使其接近同质性。纯化蛋白的SDS/PAGE如图所示。一个90%以上的样品以≈120 kDa的表观分子质量迁移，接近根据其一级序列预测的113 kDa分子质量。用抗rSir3p抗体进行的西方分析产生了与考马斯染色凝胶相同的条带模式（数据未显示），强烈表明次要条带是rSir3G降解产物。在Superdex 2000上通过凝胶过滤对纯化的rSir3p进行初步表征，得到了约170 kDa和约350 kDa的主要洗脱峰（数据未显示），这表明在我们的实验中使用的条件下，rSir3dp的很大一部分以低聚物的形式存在。这一发现与酵母双杂交实验一致，表明Sir3p具有自结合能力(21,22). 通过分析超速离心对rSir3p溶液行为的严格分析尚未完成。
(一个)纯化的rSir3p通过SDS/PAGE进行分析，如材料和方法. (B类)GST融合下拉实验是使用rSir3p和GST单独进行的（通道2）、GST-MyoD（通道8）或GST融合到组蛋白H2A（通道3）、H2B（通道4）、H3（通道5）、H4（通道6）和H4的N末端，谷氨酰胺替代位于K5、K8、K12和K16（通道7）位置，如材料和方法箭头指示洗脱液SDS/PAGE后Sir3p的位置。
为了确定重组rSir3p是否具有结合组蛋白H3和H4 N末端尾部的能力，将rSir3 p与包括GST-H3在内的几个GST融合蛋白孵育T型和GST-H4T型（图。B类). 在这些条件下，Sir3p与GST-H3结合T型以及在较小程度上，GST-H4T型，但不包括GST、GST-myoD、GST-H2AT型，GST-H2BT型或突变型GST-H4T型（图。B类). 因此，纯化的rSir3p结合组蛋白H3和H4尾部结构域在体外正如先前的遗传和分子观察所预期的那样(5–7).
Sir3p与单核小体、核小体阵列和裸DNA的结合。
研究rSir3p是否与核小体相互作用在体外，单核小体重组为208-bpLytechinus公司将5S rDNA片段（208–1 MN）与rSir3p按比例混合(第页Sir3p信号)0.1-25 mol rSir3p/mol 208-bp DNA。rSir3p于绑定到208–1 MN第页警报器3p=1.0–10，如天然1.0%琼脂糖凝胶中的广泛流动性变化所示（图。). 首次在第页Sir3p信号=0.5，而实际上所有208–1 MN都存在于超移络合物中第页Sir3p信号= 2.0–5.0. 值得注意的是，超移物种聚集在第页Sir3p信号=0.5-5.0在天然琼脂糖凝胶上产生“涂片”。涂抹表明在这些条件下存在多种中等大小的rSir3p-208–1MN复合物。重要的是，在第页Sir3p信号=2.0–10，观察到Sir3p-208–1 MN复合物，其大小上限等于4至5-kb线性DNA片段的大小上限（图。，箭头）。这些数据表明，rSir3p与208–1 MN在低浓度下孵育第页Sir3p信号产生一系列中间大小的核蛋白结构，而在rSir3p信号≥ 1. 需要进行更详细的分析，以确定低浓度和高浓度核蛋白复合物的精确数量和化学计量比第页Sir3p信号.
rSir3p将单核小体和裸DNA组装成明确的高分子量复合物。在指定的第页Sir3p信号，样品在1.0%琼脂糖凝胶（1×TBE）上电泳，如材料和方法第2、12、14和24车道包含模拟立方（无rSir3p）208–1 MN和208–1DNA对照。车道1和13包含1 Kb+DNA大小标记（GIBCO/BRL）。箭头表示碱基对中选定标记的大小。
208–1 MN重组后出现少量裸DNA（图。，车道2）未在第页Sir3p信号>0.5，表明Sir3p也与裸DNA结合。为了直接检验这种可能性，对208-1个DNA重复了rSir3p结合实验。与208–1 MN一样，在第页警报器3p> 2.0. 然而，rSir3p与208-MN的结合模式与rSir3dp与208-1 DNA的结合模式不同。例如，在第页Sir3p信号=2.0所有208–1 MN都形成了大型复合物，而208–1DNA中只有约50%（图。，第8和20车道）。此外，在摩尔比小于1的情况下，未观察到中间大小的rSir3p-裸DNA复合物。因此，rSir3p能够与裸DNA结合，尽管与rSir3dp与单核小体结合的特征略有不同。
接下来，我们研究了Sir3p与一种更具生理相关性的底物核小体阵列的结合。这些实验中使用的12聚体核糖体阵列（208–12 NA）是通过将鸡红细胞组蛋白八聚体重组到由208–1 DNA的12个串联重复序列组成的DNA模板（208-12 DNA）上获得的(23). 208–12 NA的内在结构动力学在缺乏这两种情况下已被广泛表征(24,25)和存在(26,27)为解释Sir3p结合对高阶染色质结构的影响提供了坚实的基础。用208–12 NA培养Sir3p第页Sir3p信号=0.1–25如图所示。一个。在第页Sir3p信号=1.0，所有208–12 NA都表现出迁移率的变化，其中很大一部分样品形成的复合物非常大，几乎无法迁移到1.0%的琼脂糖凝胶中。此外，在第页Sir3p信号=1.0时，观察到中等大小的偏移带（图。一个，星号），在第页Sir3p信号= 2.0–5.0. 因为最大的rSir3p核糖体阵列复合物存在于第页Sir3p信号=0.75–10几乎无法进入凝胶，无法确定是否形成了限制性的高分子量络合物。然而，除了配合物的绝对大小外，rSir3p与208–1 MN的结合模式（图。一个)和208–12 NA（图。一个)通常看起来很相似。Sir3p也与208–12 DNA结合（图。B类). 与208-1 DNA一样，Sir3p与208-12 DNA的结合方式与208-12NA的结合方式不同，这取决于迁移物种的不同模式（图。 一个和B类). 将Sir3p与重组到pXP10 DNA上的核小体阵列或仅与裸露的pXP10脱氧核糖核酸孵育，在琼脂糖凝胶上产生与208–12 NA和DNA相同的超移物种模式（数据未显示）。这一结果表明，Sir3p与核小体底物和裸DNA的结合不依赖于DNA序列。重要的是，超移位物种的rSir3p依赖性组装也发生在50–150 mM NaCl和2 mM MgCl中2（数据未显示），证明Sir3p可以在阵列广泛折叠的离子条件下与核小体阵列结合(24–27).
rSir3p将12-mer核小体阵列组装成超分子核蛋白复合物。(一个)完整208–12 NA(B类)208–12 DNA，以及(C类)胰蛋白酶化208–12 NA在指定的第页Sir3p信号，样品在1.0%琼脂糖凝胶（1×TBE）上电泳，如下所述材料和方法箭头表示碱基对中选定标记的大小。
假设Sir3p与GST融合蛋白的组蛋白H3和H4 N-末端尾部相互作用在体外(7)（图。B类)遗传证据表明，这些相互作用对rSir3p结合染色质和沉默染色质的能力很重要体内(5,6)，我们测试了核心组蛋白尾部是否在Sir3p与208–12 NA的结合中发挥作用在体外（图。C类). 用胰蛋白酶化组蛋白八聚体组装的“无尾”208-12 NA与rSir3p在第页Sir3p信号=0.1–25，条件与在1%琼脂糖凝胶上电泳完整208-12 NA和208-12 DNA及产物的条件相同。在没有尾部结构域的情况下，移位带的模式与208-12个DNA的模式非常相似，只有一个例外。在第页Sir3p信号=2.0–10，与无尾208–12 NA孵育后出现中度移位物种，但与208–12DNA孵育时没有出现中度移位。因此，核心组蛋白尾部结构域的去除消除了rSir3p与208–12 NA的大部分（但不是全部）相互作用。这一结果表明，rSir3dp在介导超分子复合物组装的同时，与尾部结构域和其他染色质组分相互作用。
超转移络合物对限制性消化的可及性。
208-12 DNA模板中的每个208-bp重复序列都由包含两个紧密间隔的DNA连接生态RI限制站点(23). 重组成核小体阵列后，大多数生态RI位点存在于连接相邻核小体的连接体DNA区域，可被消化。一小部分位点被交替定位的组蛋白八聚体所阻断，在生态RI消化(28,29)（参见图。C类). 为了确定超转移复合物的形成是否与rSir3p依赖性还原有关生态RI可达性，完整或无尾208–12 NA在第页Sir3p信号=0–5.0，如图所示。并用酶培养。非消化控制（图。一个通道2-5、10-13、18-21）在相同的条件下培养，只是没有酶存在。随后在1.0%琼脂糖凝胶上对样品进行电泳。所有超移物种形成于第页Sir3p信号=1.0–2.0在与生态RI，包括消化前无法通过琼脂糖凝胶迁移的复合物（图。一个). 同样，生态在相同条件下形成的rSir3p-裸DNA复合物的RI消化仅产生208-1个片段。由完整和无尾208–12 NA样品在第页Sir3p信号=5.0也保持完全可访问生态RI消化，尽管最大的复合物存在于第页Sir3p信号=5.0限制性消化后未能通过凝胶迁移（图。一个，车道9）。对照组中，208-12NA以过饱和的组蛋白与DNA摩尔比重组，这会产生含有空间不可接近的非特异性高分子量聚集体生态RI结合位点(19)，不易被消化生态RI，如预期（未显示数据）。
208–12 NA连接子DNA组装成超分子核蛋白复合物后即可获得。(一个)完整208-12 NA、208-12 DNA和胰蛋白酶化208-12核酸复合物的等分样品，组装在指定的第页Sir3p信号与生态RI在37°C下保持90分钟。未消化（−）和消化（+）样品随后在1.0%琼脂糖凝胶（1×TBE）上电泳，如材料和方法. (B类)相同的等分生态完整208-12 NA、208-12 DNA和胰蛋白酶化208-12核酸的RI消化样品一个提取酚氯仿去除结合蛋白并沉淀乙醇。将回收的DNA进行电泳，如一个.车道2、7和12包含部分艾娃我消化了pPol I 208-12，它产生一个208-bp的DNA阶梯。箭头表示碱基对中选定标记的大小。
由生态RI消化没有显示流动性降低的迹象。相反，对于完整和无尾208–12 NA，通过消化超转移复合物释放的物种在第页Sir3p信号=1.0–2.0表明与对照组相比，活动性逐渐减少（图。一个，将7–8和23–24车道分别与6和22车道进行比较）。在1.0%琼脂糖凝胶的分辨率范围内，这种结果可能是由于rSir3p阻塞了少量连续的生态RI位点，从而产生更多的双核小体和三核小体。或者，每个核小体中≥1 rSir3p蛋白的结合可能导致迁移率降低。为了区分这些可能性生态RI消化的复合物在第页Sir3p信号=0–5.0被脱蛋白，所得DNA在1.0%琼脂糖凝胶上电泳（图。B类). 注意控制208–12 NA（通道3和13）不完全消化产生的208-bp条带阶梯。密度定量分析表明，超移位复合物在消化过程中产生的DNA条带的模式和丰度在第页Sir3p信号=1.0–2.0与208–12 NA消化物的差异不显著，尽管在第页Sir3p信号= 5.0. 因此，没有额外的实质性保护生态RI位点与rSir3p介导的复合物在化学计量结合条件下的形成有关，这反过来表明生态rSir3的RI消化第页-208–12 NA复合物（图。一个，车道6–8）为208–1 MN，含有越来越多的结合rSir3p。
讨论
rSir3p已被纯化到接近同质性，其与单核小体、核小体阵列和裸DNA的相互作用已被表征在体外.rSir3p以交联单核小体和短核小体阵列的方式结合到核心组蛋白尾结构域和可能的核小体DNA，形成大的定义“超分子”复合物（见图。). 这些结果表明，rSir3p对高阶染色质结构具有深远的影响在体外然而，rSir3p影响染色质结构动力学的方式与连接组蛋白的方式截然不同，连接组蛋白将典型染色质纤维稳定在局部折叠的“30-nm”构象中(26,27). 例如，连接蛋白组蛋白以0到2.0的摩尔比与208–12 NA结合，导致在1.0%琼脂糖凝胶中形成稍微延迟的复合物(26)与相同条件下由rSir3p结合引起的一系列超位移络合物相反。此外，与Sir3p不同，连接子组蛋白与208–12 NA的结合独立于核心组蛋白尾部结构域(27). 相反，这些数据表明，rSir3p将核小体模板组装成新型的高分子量复合物，其结构特性超过了典型的10-nm和30-nm染色质纤维的结构特性。Sir3p将核小体模板交联成大组装体的能力可能源于这样一个事实，即每个rSir3p单体都可以与H3和H4尾部结构域相互作用，因此每个核小体包含多达四个rSir3p的尾部结构域结合位点（图。). 鉴于rSir3p与胰蛋白酶化核小体阵列和裸DNA的结合模式并不相同（图。B类和B类)并且没有依赖rSir3p的保护生态在r形成的超分子复合物的连接体DNA中的RI位点Sir3p信号≥1（图。)，我们假设rSir3p与核小体结合DNA的相互作用也可能有助于复合物的形成。最后，rSir3p可能与核小体的其他成分相互作用。需要注意的是，rSir3p的齐聚将有助于加强rSir3+核小体相互作用的程度。核小体间交联似乎是其他沉默和/或异染色质相关蛋白的共同特征，如酵母Tup1/Ssn6（R.T.Simpson，个人通讯）和后生动物MENT(30,31)尽管MEN似乎通过一种机制发挥作用(30)这与酵母蛋白不同。
染色质纤维rSir3p依赖性交联到定义的超分子结构的示意图模型。图中所示为通过rSir3p与核心组蛋白H3和/或H4尾结构域的相互作用桥接在一起的两个核糖体阵列的一部分。Sir3p作为低聚物绘制，仅供说明。每个核小体的H3和H4尾域用直线表示。箭头表示生态RI站点。这种机制被认为有助于形成与异染色质和端粒聚集相关的特异的、转录沉默的高阶染色体结构域体内（见正文）。
酵母端粒和交配型位点被广泛用作沉默染色质的潜在分子模型（参见参考文献。2). 在酵母中，沉默的染色质由核小体阵列组成(32,33)和许多特殊的非组蛋白，包括Sir蛋白(2). 这里给出的结果代表了最初的研究，重点是表征纯化的Sir蛋白对染色质结构的影响在体外上述讨论了与染色质纤维结构-功能关系的相关性。在沉默方面，我们从酵母Sir3p开始，部分原因是体内研究表明，Sir3p单独能够调节这两种沉默(34)染色质介导的复制效应(35)至少在某种程度上独立于其他Sir蛋白(6). 尽管以下假设仍有待直接测试，但我们的结果与以下观点一致，即Sir3介导的酵母特定位点特异性高阶染色质结构的组装是实现转录沉默状态的关键组成部分。推测的抑制性染色体结构域的特定结构可能取决于沉默位点的独特核小体定位结构(32,33)以及Sir3p以外的沉默蛋白的存在。端粒和其他异色区域的聚集体内(36)沉默从端粒向内扩散(6,34)和Sir3p介导的染色体纤维“环”(37)所有这些原则上都可以解释为Sir3p和类似蛋白通过核小体间交联促进纤维-纤维相互作用的能力。蛋白质介导的核小体间桥接（图。) (30,31)还提供了一种通用的分子机制，可以解释异染色质的功能和结构方面。用纯化的天然和突变沉默蛋白对这些假设进行测试，将揭示与特定异色态的组装、维持和遗传相关的其他生化见解体内.
