孕激素单倍体缺乏小鼠额颞叶痴呆相关缺陷和神经炎症的分离

Progranulin ELISA。

根据制造商的方案，使用ELISA试剂盒（Adipogen）定量小鼠皮层和血浆中的孕酮蛋白水平。为了分离蛋白质，在裂解缓冲液（10 m）中解剖并均质小鼠皮层米Tris，pH 7.5，10 m米氯化钠，3米米氯化镁₂，1米米EGTA和0.05%v/v NP-40）补充蛋白酶抑制剂（HALT；ThermoFisher）。然后以16000×克在4°C下保持10分钟。收集上清液，并使用考马斯加蛋白质测定试剂（ThermoFisher）测定每个样品中的可溶性蛋白质浓度。将总计100μg蛋白质添加到1×稀释剂中，并一式两份运行样品。为了分离血浆，使用1毫升注射器和23克¾英寸针头从心脏右心室采集血液。EDTA（250米米)包括在收集注射器中，以避免凝血。为了将血浆与细胞相分离，样品以1000×克在摆动式离心机中，在4°C下保持10分钟。然后将小鼠血浆在1×稀释剂中稀释1:200，并重复运行。使用随试剂盒提供的重组小鼠progranulin生成标准曲线。

三个孩子的社交能力。

在三室社交测试中测试小鼠的社交时间，该测试改编自Moy等人（2004）稍作修改。测试是在红灯下进行的。测试箱由UAB机器车间的白色有机玻璃制成，不包含床上用品。在对测试室进行30-90分钟的习惯化后，将一只小鼠放置在中心室中，两个外部室包含空的金属丝笼（光谱多样化设计）。小鼠被允许探索所有三个房间10分钟。10分钟后，将一只新的小鼠（8个月大，雄性，C57BL/6小鼠，习惯于呆在金属笼中）和一个无生命物体（火柴盒车或木块）放在金属笼下。实验鼠被允许探索10分钟。用秒表或视频跟踪系统（CleverSys）对与新型老鼠和无生命物体互动的时间进行评分。通过将与另一只老鼠互动的时间除以与无生命物体互动的时间，计算出每只老鼠的社交比率。为了显示来自多个队列的数据，将社交比率标准化为每个队列中野生型小鼠的平均社交比率100%。

信息素偏好。

为了测试信息素的偏好，我们测量了研究尿液和水刺激物所花费的时间。收集并合并10只雄性C57BL/6小鼠的尿液，然后冷冻直至测试。将尿液或水（50μl）滴在小块滤纸上，然后将其干燥。将滤纸插入组织学盒中，以防止直接接触，将装有尿液和水的盒放在带床上用品的标准鼠笼的对角。将试验小鼠放入笼中5分钟，并用视频跟踪软件（CleverSys）记录每次刺激后5厘米内的时间。

社会支配地位的试管测试。

试管试验改编自Lindzey等人（1961年）来自不同家庭笼子的同性小鼠，在没有任何试验经验的情况下接受了试验，但没有对试管进行习惯化。将小鼠头朝下放入透明塑料管（3.81 cm ID×30.5 cm长）的对侧，同时释放。当一只老鼠的两只爪子离开管子时，试验结束。试验结束时留在试管中的老鼠被认为是获胜者。如果小鼠相互交叉或在2分钟内没有小鼠离开试管，则试验中止。试管用70%乙醇清洗，并在试验之间干燥。

恐惧调节。

实验在快速更换试验室（Med Associates）进行。为了获得恐惧条件反射，将小鼠置于试验箱中，并让其适应180秒。适应后，给予条件刺激（75 Db的白噪音）20秒，同时进行0.5 mA的足部电击（2秒）。该刺激共进行三次，刺激间隔为40秒。视频被记录下来，老鼠静止不动的时间由一个盲人观察者测量。然后这些老鼠被送回了它们的笼子。为了测试基于线索的条件反射，在训练24小时后对小鼠进行测试。在这项测试中，测试室的背景是新颖的，带有三角形不透明的白色有机玻璃插件和留兰香。在最后3分钟内，用白噪音听觉提示将小鼠放置在房间内6分钟。在提示前和提示期间测量冻结。在训练期间，用70%的乙醇在小鼠之间清洁小室，在线索测试期间用异丙醇清洁小室。

发展里程碑。

发育里程碑的评估从出生后第2天开始。每天监测幼犬的体重和身体里程碑的达成情况，如门牙萌出、耳廓脱落和睁眼。此外，还对幼鼠的反射和协调运动进行了评估。为了进行抓握反射，用棉签的木质端轻轻抚摸前爪；如果观察到抓握动作，则记录里程碑的成就。对于水面扶正，幼犬被放在床上，腹部朝上，并计时，直到它们成功扶正。为了评估对悬崖的躲避，幼崽被放在一个6厘米高的泡沫塑料平台的边缘，头和爪子挂在边缘。测量从边缘后退所需的时间，如果时间<10 s，则记录里程碑的完成情况。将小狗面朝下放置在粗糙表面上，以30°角测量负向性。记录幼崽直立所需的时间，当时间小于10秒时记录里程碑的完成情况。为了检查视觉位置，幼崽被尾巴朝着表面向下放低。当幼崽抬起头并将前肢伸向水面时，这一里程碑的成就被记录下来。为了评估空气扶正，将幼犬抱在一个铺好的表面上方30厘米处，并将其腹部朝上。这一里程碑式的成就是在幼崽能够站立着地的那一天记录下来的。通过让老鼠抓住一根小横杆，并测量它们在不摔倒的情况下保持悬浮状态的时间，测试了横杆悬挂里程碑。如果他们可以继续暂停，则对里程碑的成就进行评分。

开放字段。

在开阔场地上测量总行走距离和焦虑程度（Med Associates）。将小鼠置于旷野中进行15分钟试验。活动是通过自动跟踪软件通过红外光束中断来测量的。试验之间用70%乙醇清洗仪器。

水迷宫。

如前所述，使用Morris水迷宫评估空间学习和记忆(Scearce-Levie，2011年). 试验前，所有小鼠均单独饲养至少5天。隐蔽平台培训包括4天的培训，每天进行6次测试（上午三次，下午三次）。平台位于不透明水（20°C）表面以下1.5 cm的固定位置。每只老鼠都被放置在迷宫中，最初面向外墙，在每个试验中都是半随机变化的下降点。当老鼠找到平台并在平台上静止2秒时，试验结束。如果老鼠在60秒内没有找到平台，他们被带到平台上，然后从水池中移出。使用EthoVision视频跟踪系统（Noldus Information Technology）测量性能。在训练结束后1天进行探索性试验。平台被移除，每只老鼠被放置在平台所在地对面的迷宫中。每个试验持续60秒。使用双向方差分析和重复测量来分析找到平台的延迟。

电生理学。

对12月龄小鼠的急性海马脑片进行电生理学检查。小鼠被斩首处死，大脑立即置于冰镇切割溶液（110μ米蔗糖，60μ米氯化钠，3μ米氯化钾，1.25μ米不₂人事军官₄, 28 μ米氯化钠_三, 2 μ米氯化钙，7μ米氯化镁，5μ米葡萄糖和0.6μ米抗坏血酸）。在Vibratome（Vibratom Company）上制备横向切片（400μm厚），并在含有50%切削液和50%ACSF（125μm）的室温溶液中从切片上解剖海马米氯化钠，2.5μ米氯化钾，1.25μ米不₂人事军官₄, 25 μ米氯化钠_三, 2 μ米氯化钙₂, 1 μ米氯化镁₂, 25 μ米葡萄糖）。然后将切片在室温ACSF中平衡45分钟，然后在32°C ACSF下平衡1小时。所有溶液均用95%的O饱和₂和5%CO₂如前所述，在接口室（精细科学工具）中进行电生理记录(Levenson等人，2004年). 海马切片以1 ml/min的速度持续灌注30°C ACSF。使用搪瓷双极铂钨（92%：8%）电极，沿着CA1和CA3区（2200型刺激隔离器，A-M系统）边界对Schaffer侧支进行细胞外刺激。用填充ACSF的玻璃记录电极（1–3 MΩ）在辐射层中记录fEPSP。Clampex用于数据采集，Clampfit用于数据分析（分子器件）。输入/输出曲线是通过以1 V的增量应用0.5至30 V的一系列刺激产生的。三次扫描的平均强度。诱发50%最大fEPSP斜率的刺激强度用于随后的刺激。通过在一系列刺激间隔（10、20、50、100、150、200、250和300 ms）施加连续刺激来测量配对脉冲促进作用。在基线记录20分钟后，通过施加两组间隔20秒、频率为100 Hz、时间为1s的刺激序列来诱导LTP。每20秒记录一次，数据平均为2分钟。采用重复测量的双向方差分析对配对脉冲易化和LTP的数据进行分析。

脊椎密度。

根据制造商的方案，用FD快速GolgieStain试剂盒（FD NeuroTechnologies）对小鼠大脑进行形态学评估。用100 mg/kg Fatal-Plus（Vortech Pharmaceuticals）杀死小鼠并斩首，取下大脑。将大脑半球浸泡在浸渍液中14天，然后将其转移到冷冻保护剂中再放置7天。然后，用冷冻恒温器（徕卡）将大脑切割成200μm的切片，并安装在涂有明胶的载玻片上。安装后，用ddH冲洗载玻片₂O并在显影液中培养。显影后，用浓度增加的乙醇对切片进行复水，并用二甲苯清除。最后，使用EUKITT安装介质（电子显微镜科学）覆盖玻片。

显微镜在MicroBrightField系统（MBF Bioscience）上进行。在100×（油浸）条件下，对CA1锥体神经元上10-40μm二级树突节段进行图像叠加。使用Neuroucida手动追踪所有图像堆栈，并使用Neuroocida Explorer进行分析。

免疫组织化学。

如前所述，在30μm厚的自由漂浮冠状切片上进行免疫组织化学(Palop等人，2011年). 为了获得切片，按照上述方法杀死小鼠，并用生理盐水经心灌注。取下大脑，将其滴入磷酸盐缓冲液（80 m）中4%的多聚甲醛中米纳₂高性能操作₄，200米米不₂人事军官₄pH7.4），并在4°C下放置48小时。在两次PBS洗涤后，将大脑转移到PBS中30%的蔗糖中48小时或直到其下沉。然后在带冷冻阶段的滑动切片机上切割30μm切片（徕卡）。将切片置于低温保护剂（30%乙二醇、30%甘油、40%PBS，v/v/v）中，并在−20°C下保存，直至使用。

用PBS清洗切片，去除冷冻保护剂。用3%H淬火内源性过氧化物酶活性₂O（运行）₂在磷酸盐缓冲液中加入10%甲醇，然后用10%的正常山羊血清（Vector Laboratories）、1%的奶粉和0.2%的明胶进行封闭，以防止非特异性结合。使用在PBS中稀释的以下浓度的初级抗体：3%正常山羊血清和0.2%明胶：Iba1（1:5000；Wako）、GFAP（1:5000；Dako）和c-fos（1:10000；EMD Millipore）。应用种特异性生物素化次级IgG（1:5000；Vector Laboratories），并使用Vectastain Elite亲和素-生物素-辣根过氧化物酶复合物试剂盒（Vector Laboratories。二氨基联苯胺：添加四氯化碳进行检测，并使用Cytoseal 60（电子显微镜科学）用盖玻片安装切片。为了分析Iba1和GFAP，在带有10倍物镜的立式显微镜（卡尔蔡司）上采集了每只小鼠的三个切片的显微照片。阈值设置为仅包括GFAP或Iba1阳性像素。对每幅图像中GFAP或Iba1阳性像素的总数进行量化，然后对三幅图像进行平均。在配备FITC（激发480/30；发射535/40）滤光片立方体的立式显微镜（尼康）上拍摄自荧光图像。使用ImageJ软件计算像素密度。

qRT-PCR。

mRNA水平用定量PCR定量。根据制造商的方案，RNA首先使用Trizol试剂（Invitrogen）制备。从制备的RNA中，使用SuperScript III和随机引物（Invitrogen）生成cDNA。使用LightCycler 480 Probes master mix（Roche）和TaqMan基因表达测定法对肿瘤坏死因子-α（Mm00443258m1）、丙二醇（Mm0033848m1）和β-肌动蛋白（Mm00607939_s1）的cDNA进行定量。在Roche LightCycler 480上进行扩增，并使用ΔΔCt方法对数据进行量化（用户公告2，应用生物系统）。

新颖/社交环境。

如前所述，小鼠暴露在一个新颖的社会环境中(Scearce-Levie等人，2008年). 简单地说，将两只基因型相同、性别相反的小鼠与一种新型卧具和新型嗅觉、触觉和视觉刺激放在笼子里2小时，然后处死。对照组小鼠在其家中的笼子里安然无恙地呆了3天。

如上文所述，对切片进行c-fos或NeuN免疫染色，然后用玻片扫描仪进行扫描（电子显微镜科学）。选择了三个连续切片，间隔300μm，其中尾状核/壳核和杏仁核清晰界定（位于前角后1.0至1.8 mm之间）。对于尾状核/壳核和中央杏仁核（包括杏仁核-纹状体过渡区），外侧边界为外囊，内侧边界为苍白球和内囊（参见图7A类). 从外囊分叉处向内延伸的水平线将尾状核/壳核与杏仁核分开。杏仁核的腹侧边界由外囊尖端之间画出的一条线确定，该线向内侧延伸至内囊或视束，具体取决于前后位置。细胞由对基因型盲的观察者手工计数。任何接触行的单元格都被排除在计数之外。数据表示为通过3个部分计数的所有单元格的总和。

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图7。

杏仁核神经元激活减少Grn公司^+/−老鼠。A类，计算c-Fos和NeuN阳性神经元的区域，包括中央杏仁核（CeA）、尾状核/壳核（CPu）和齿状回（DG）。B–D类，在不同脑区计数活性c-Fos阳性神经元。在休息和家庭环境下，很少有神经元呈c-Fos阳性。B类，大脑杏仁核中c-Fos阳性神经元较少Grn公司^+/−和Grn公司^−/−小鼠在新环境中2小时后（方差分析，第页< 0.05). **第页<0.01与Grn公司^+/+老鼠(事后（post-hoc）测试）*第页<0.05与Grn公司^+/+老鼠(事后（post-hoc）测试）。尾状核/壳核中c-Fos阳性神经元的数量没有差异(C类)或齿状回(D类)海马体。不另作说明，不重要。E类，在新环境中2小时内，不同类型的社交互动次数在各组之间没有差异。如果，缺乏丙谷蛋白的小鼠的杏仁核神经元总数没有差异，因此c-Fos阳性神经元的减少不能归因于神经元丢失，而应归因于激活受损。