结果
作为研究癌症发展中导致DNA损伤和基因组不稳定的早期事件的第一步，我们研究了HPV-16 E6/E7癌蛋白异常激活Rb-E2F通路的影响。为此，我们使用了来自成人皮肤活检的原始角质形成细胞，其体外增殖能力非常差。这些细胞被基于LXSN的逆转录病毒载体感染，该载体不影响细胞增殖或DNA复制(图S1A和S1B在线提供）。用含有HPV-16 E6和E7病毒基因的LXSN载体感染来自同一供体的角质形成细胞。我们使用每个病毒基因的引物，通过RT-qPCR验证E6/E7的表达。使用定量实时PCR（RT-qPCR），我们发现这些角质形成细胞中E6和E7的表达水平比HPV16诱导的宫颈癌（CaSki）细胞系中的水平低约2倍(图S1C)表明角质形成细胞中E6/E7的表达处于生理水平。正如预期的那样，E6和E7转录物仅在感染E6/E7载体的角质形成细胞中检测到，而在同一供体的原代角质细胞中未检测到（数据未显示）。重要的是，E6/E7表达细胞持续增殖至少100天，表明其成功永生。这些结果表明，E6/E7基因被表达，并加强了受感染角质形成细胞的持续增殖。为了研究E6/E7表达诱导的早期事件，实验在E6/E6感染后2-6周、后期桥和微核可见之前在新转化的细胞中进行。
HPV-16 E6/E7表达对细胞DNA复制产生压力
为了研究人乳头瘤病毒（HPV）对细胞DNA复制的影响，我们利用DNA梳理方法，可以对单个DNA分子进行复制分析。用荧光抗体（分别为绿色和红色）检测新合成的带有IdU和CldU标记的DNA(). 研究了从两个人的成人皮肤样本中获得的正常原代角质形成细胞和表达E6/E7蛋白的同一供体角质细胞中2-6周的复制动力学。
原代和HPV-16 E6/E7-表达角质形成细胞的复制动力学（A） 一个标记有IdU（绿色）和CldU（红色）的单个梳理DNA分子示例，显示从两个相邻来源复制。绿色箭头，叉子前进的方向和长度。
（B） 叉车速度（Kb/min）分布。白条，原代角质形成细胞（n=130）；黑条，角质形成细胞表达E6/E7（n=144）。
（C） 来自同一原点的左右叉之间的级数比。原代角质形成细胞（n=156）；角质细胞表达E6/E7（n=194）。
（D） 原点密度分布。白条，原代角质形成细胞（n=67）；黑条，角质形成细胞表达E6/E7（n=93）。
（E） 相邻震源之间的点火时间差异。各组代表不同的相对射击时间（以分钟为单位）。原代角质形成细胞（n=50）；角质形成细胞表达E6/E7（n=89）。
另请参见图S1、图S2,表S1和表S2.
首先，我们分析了E6/E7表达对细胞DNA复制分叉率的影响(). 结果显示，人类原代角质形成细胞的平均复制速率显著降低，从1.3±0.06 Kb/min（n=130）降至表达E6/E7的细胞的0.75±0.05 Kb/min–14). 重要的是，在E6/E7表达后，观察到非常慢的分叉的百分比显著增加(). 对另一位供体角质形成细胞的分析也得到了类似的结果(图S2A). 这些结果表明，病毒E6/E7蛋白表达后不久，DNA分叉进展率显著降低。
来自同一来源的两个复制分支往往表现出相同的复制速率(Conti等人，2007年). 然而，在复制应激条件下，扰动的分叉级数可能导致传出分叉的不对称级数(Di Micco等人，2006年). 因此，我们比较了来自同一供体的原代和E6/E7表达的角质形成细胞中来自同一来源的左右分叉的进展。如前所述(Conti等人，2007年)当左右叉子之比>0.75时，考虑到两个叉子的对称级数。分析显示，与原代细胞相比，E6/E7表达细胞中左右叉形进展的对称性显著降低（p<3×10–6). 在初级复制细胞中，平均比率为0.81±0.01（n=156），只有23%的复制气泡表现出不对称动力学。相反，在E6/E7表达细胞中，发现对称性较差，平均比率为0.71±0.01（n=194），47%的起源显示不对称复制进展(和图S2C). 这表明，E6/E7表达后的短时间内，DNA复制机制的处理能力受到干扰。
先前的研究表明，缓慢的分叉进展与活动起源数量的增加有关(Anglana等人，2003年;Courbet等人，2008年;Ge等人，2007年). 因此，我们通过测量两个相邻来源之间的距离来研究E6/E7蛋白对来源密度的影响。结果表明，原代角质形成细胞的平均起始距离为187±26 Kb（n=67），而E6/E7表达的角质形成细胞核的平均起始间距明显缩短，只有121±24 Kb（n=93）（p<5×10–5). 此外，E6/E7表达后，观察到起源距离很短的分子比例急剧增加(). 其他捐赠者也获得了类似的结果(图S2B和数据未显示）。这些结果表明，E6/E7表达导致激活更多的起源。总之，复制动力学结果表明，在新转化的E6/E7表达细胞中，宿主细胞DNA复制受到显著干扰。
HPV-16 E6/E7的慢性表达导致休眠起源的程序性激活发生变化
休眠起源激活可能发生在S期，以使受扰复制子中的DNA合成得以完成(Ge等人，2007年). 在这种情况下，预计相邻震源的点火时间会有所不同。或者，休眠起源可能已经在G1中被许可为对慢性复制应激的细胞反应(Courbet等人，2008年). 在这种情况下，预计相邻起源之间会有同步复制时间。
为了研究病毒E6/E7表达导致的起源放电动力学，我们估计了分析纤维中每两个相邻起源的相对放电时间(图S2D). 在原代角质形成细胞中，两个相邻来源之间的放电时间平均差异为26±3.1 min（n=50）。表达E6/E7的原代角质形成细胞的放电时间无显著差异（p>0.95）（平均值为26±3.8 min[n=89]）(). 这些结果支持在S期复制开始之前G1休眠起源的程序化激活的可能性。
HPV-16 E6/E7表达导致常见脆性位点杂合性丢失
染色体不稳定可导致杂合性丢失（LOH）。先前的研究表明，在癌症发展的早期阶段，不稳定性优先发生在对复制应激敏感的基因组区域，即脆性位点(Bartkova等人，2005年;Di-Mico等人，2006年;Gorgoulis等人，2005年;Tsantoulis等人，2008年). 在癌症发展的后期，在整个基因组中发现不稳定性(Gorgoulis等人，2005年). 使用单核苷酸多态性（SNP）阵列进行LOH分析。在100或250天内，将原代角质形成细胞和表达E6/E7的角朊细胞的杂合性进行比较。
结果表明，E6/E7表达100天后，整个基因组中1.4%的信息SNP显示LOH，表明E6/E6表达导致基因组不稳定。随着时间的推移，不稳定性急剧增加，250天后，17%的信息性SNP出现LOH。在脆弱位点中，最敏感的复制位点（FRA3B、FRA16D和FRA7G）在100天后显示出4.1%的LOH，这显著高于整个基因组中的发现值（p<0.0024）。250天后，即使是不太敏感的易碎部位也显示出明显更高的LOH频率（p<9×10–4) (表S1)表明沿常见脆弱场地存在优先不稳定性。在几个脆弱的地点，发现了31%（FRA11E）和50%（FRA9G）的显著LOH。这些结果表明，在癌症发展的早期阶段，E6/E7表达引起的复制应激导致最敏感脆弱部位的基因组不稳定性增加，其次是其他脆弱区域的不稳定性。如前所述，在癌症发展的后期阶段，在基因组的脆弱和非脆弱区域发现了大规模的基因组不稳定性(Gorgoulis等人，2005年).
同一实验的拷贝数变异（CNV）分析显示，100天后E6/E7表达细胞中8p染色体丢失，20号染色体全部增加。有趣的是，子宫颈癌细胞中反复观察到染色体20q扩增(Tsantoulis等人，2008年). 对表达E6/E7的细胞进行250天的分析，发现了额外的扩增，这经常出现在宫颈癌中(表S2)，主要位于染色体8q、7p和11q(Harris等人，2003年). 总体而言，LOH和CNV结果表明，在离体和体内细胞增殖和转化过程中发现了类似的不稳定性事件。
表达HPV-16 E6/E7的细胞中的低核苷酸库导致复制应激、基因组不稳定性和致瘤性
复制动态在很大程度上取决于核苷酸库的大小和平衡(Anglana等人，2003年;Courbet等人，2008年). 因此，我们使用高效液相色谱（HPLC）方法研究了E6/E7对核苷酸库的影响。我们的研究结果显示，E6/E7表达2-4周后，四种dNTP的水平下降了2-5倍(和表S3A). 有趣的是，所有核糖核苷酸（rNTPs）的水平也下降了2倍(图S3A和表S3B)，表明核苷酸生物合成在该途径的上游受到干扰。这些结果表明，E6/E7表达细胞中发现的复制扰动和基因组不稳定性是由于支持广泛增殖所需的核苷酸库不足所致。
外源核苷对HPV-16 E6/E7-表达细胞复制动力学、DNA损伤和转化的影响（A） 表达E6/E7的角质形成细胞的核苷酸水平与同一供体原代细胞的水平一致*p<0.05。水平表示为平均倍数变化±SEM（n=3）。
（B） 叉车速度（Kb/min）分布。白条，原代角质形成细胞（n=130）；黑条，角质形成细胞表达E6/E7（n=150）；灰条，表达E6/E7的角质形成细胞在外源性核苷供应下生长48小时（n=155）。
（C） 原点密度（Kb）分布。白条，原代角质形成细胞（n=67）；黑条，角质形成细胞表达E6/E7（n=93）；灰条，表达E6/E7的角质形成细胞在外源性核苷供应下生长48小时（n=89）。
（D） （左）在正常培养基（E6/E7）和提供外源核苷的培养基（E6/E7+AUCG）中生长的E6/E7s表达后出现γH2AX病灶的细胞核示例。细胞核用DAPI染色。（右）具有指示数量的γH2AX焦点的核百分比。原代角质形成细胞（n=51）；角质形成细胞表达E6/E7（n=52）；表达E6/E7的角质形成细胞提供外源性核苷（n=70）。
（E） （左）凤尾鱼在软琼脂中的非依赖性生长示例。（右）每个软琼脂平板的平均菌落数。表达E6/E7的细胞；表达E6/E7的细胞提供外源核苷。每个平板的菌落数表示为平均值±SEM（n=3）。
另请参见图S3和图S4、和表S3.
为了验证这个假设，我们分析了外源性核苷供应是否可以调节E6/E7表达细胞的复制动力学。为此，在补充有四个核苷（a、U、C和G）的培养基中，将表达E6/E7的原代角质形成细胞和角质形成细胞培养2-4周，培养48小时。使用DNA梳评估复制动力学显示，向表达E6/E7的角质形成细胞外源性供应核苷导致复制速率显著增加，平均为1.1±0.06 Kb/min（n=155），而0.75±0.05 Kb/min（n=150）（p=8×10–7)在正常培养基中生长的相同细胞中(). 此外，外源性核苷供应后，原代角质形成细胞的平均复制率达到平均fork率的90%。使用另一位捐赠者的细胞也获得了类似的结果(图S3B). 值得注意的是，外源性核苷供应对正常初级角质形成细胞的复制速率和起源距离没有影响（1.2±0.04 Kb/min[n=83]；129±11 Kb[n=42]）(图S3D和S3E).
随后，我们研究了外源核苷供应对起源距离的影响。根据复制速率，与正常培养基中生长的E6/E7细胞相比，供应核苷的E6/E7表达细胞的平均起源距离显著增加，分别为165±12 Kb（n=89）和120±10 Kb（n=93）（p=8×10–7)分别是。然而，在45%的病例中，E6/E7表达的角质形成细胞的起源距离<80 Kb，在外源性核苷的供应后，这些距离的比例仅为22%(). 使用另一位捐赠者的细胞也获得了类似的结果(图S3C).
我们的LOH结果显示，E6/E7表达后产生复制诱导的DSB。因此，我们进一步研究了外源性核苷供应能否减少这些复制诱导的DSB。为此，我们分析了定位于DSB的γH2AX病灶的形成(Rogakou等人，1998年). 在正常培养基和添加外源核苷的培养基中生长的表达E6/E7的细胞中，使用针对γH2AX的抗体进行2-6周的免疫荧光分析。分析表明，与在正常生长介质中生长的细胞相比，外源性核苷供应后的γH2AX焦点数量显著减少，每个核分别为4±1（n=70）个和9±1.1（n=52）个焦点()（p<7×10–4). 重要的是，在正常角质形成细胞培养基中生长的表达E6/E7的细胞中，40%的细胞核中观察到高水平的γH2AX焦点（每个细胞核>10个焦点），而在48小时内，仅13%的细胞中发现如此高的焦点水平。此外，70%的补充细胞核显示出非常低的焦点水平（0-2），与>90%的原代角质形成细胞的焦点水平相似。
表达全长HPV-16基因组的角质形成细胞（F1细胞）6周后显示出复制应激和DNA损伤，与仅表达HPV-16 E6/E7的细胞中观察到的类似(图S4A–S4C). 重要的是，这些细胞中的复制应激和DNA损伤都可以通过外源性核苷供应来挽救(图S4A–S4C)表明复制诱导的DNA损伤确实是由HPV-16 E6/E7癌基因的表达引起的，并且不受其他病毒蛋白表达的影响。
然后我们研究了核苷酸库是否可以调节致癌诱导的细胞转化。我们使用测量软琼脂中凤尾鱼非依赖性生长的普通体外转化试验对此进行了测试。在正常培养基中生长的细胞在软琼脂中显示出显著的（p=0.02）凤尾鱼非依赖性生长，而在富含核苷的培养基中培养的细胞形成罕见和小菌落：每个平板分别为25.3±6和2.3±1菌落（n=3）(). 值得注意的是，E6/E7表达细胞的外源性核苷供应并不影响细胞增殖(图S4D)表明外源性核苷供应后软琼脂集落形成减少并不是由于细胞增殖率降低。
总之，我们的结果表明，E6/E7表达后，低核苷酸库会导致复制扰动，导致基因组不稳定，并增加致瘤潜力。
表达细胞中的低核苷酸库周期素导致复制应激和基因组不稳定性
我们进一步研究了细胞癌基因对Rb-E2F通路的异常激活是否也会导致正常DNA复制所需的核苷酸库不足。为此，我们表达了人类细胞周期蛋白E在人类癌前病变和癌性病变中经常过度受压。细胞周期蛋白E在控制G1/S转换中起主要作用，因为它介导Rb磷酸化，使Rb失活并促进E2F的释放。与病毒E7癌基因一样，cyclin E活性导致G1缩短并迫使细胞进入S期(Hwang和Clurman，2005年).
通过逆转录病毒感染，我们表达了人类细胞周期蛋白E来自健康供体的人原代成纤维细胞或永生化包皮成纤维细胞（BJ细胞）。的表达式细胞周期蛋白E经RT-qPCR和western blot验证(图S5A). 首先，我们测量了表达细胞周期蛋白E或空白对照载体2–4周，在衰老之前阻止组织培养细胞中的细胞分裂。结果显示，rNTP池在以下情况下减少了50%（p=0.03）细胞周期蛋白E表达式(和表S3D). 重要的是，dNTP水平急剧下降到低于检测水平(表S3C). 在原代成纤维细胞中也发现了类似的减少(表S3E和数据未显示）。
外源核苷供应对表达BJ细胞复制动力学和DNA损伤的影响周期素（A） rNTP池遵循细胞周期蛋白E在BJ细胞中表达。水平表示为平均折叠变化±SEM（n=4）。
（B） 叉速分布（Kb/min）。白色条，BJ细胞（n=163）；黑色条，BJ表达细胞周期蛋白E（n=165）；灰色条，BJ表达细胞周期蛋白E用外源核苷（n=173）培养48小时。
（C） 原点密度分布（Kb）。白色条，BJ细胞（n=45）；黑色条，BJ表达细胞周期蛋白E（n=34）；灰色条，BJ表达细胞周期蛋白E用外源性核苷供应生长48小时（n=46）。
（D） 具有指示数量的γH2AX焦点的细胞核百分比。BJ细胞（n=57）；BJ表达细胞周期蛋白E（n=110）；BJ表达细胞周期蛋白E用外源核苷（n=64）培养48小时。
另请参见图S5和表S3.
接下来，我们分析了外源性核苷对表达细胞周期蛋白E分析揭示了以下复制动力学中的显著扰动细胞周期蛋白E表达式。表达空载体的BJ细胞的平均fork速率为1.5±0.03 Kb/min（n=163），而细胞周期蛋白E表达速度明显减慢（1.0±0.03 Kb/min，n=165）（p<3×10–28). 极慢分叉的分数（<0.75 Kb/min）高出10倍(). 外源性供应四个核苷48小时后，叉形率增加到1.3±0.03 Kb/min（n=173），回收率为87%（p=6×10–6). 在成年供体的原代成纤维细胞中也发现了类似的结果细胞周期蛋白E致癌基因。原代细胞的分叉进展率从1.2±0.06 Kb/min（n=125）下降到0.8±0.06 Kb/min（n=62）（p<2×10–7). 外源性核苷供应使分叉率增加到1.1±0.05 Kb/min（n=80），回收率为92%（p=0.0002）(图S5B).
随后，我们分析了原点间距。对BJ细胞的分析显示，cyclin E表达后，BJ细胞从289±25 Kb（n=45）显著降低到168±14 Kb（n=34）（p<2.5×10–5). 重要的是，外源核苷供应使距离增加到237±14Kb（n=46）（p＜4×10–4) (). 在原代成纤维细胞中也发现了类似的结果。原点间距离从172±12 Kb（n=47）降至127±15 Kb（n=27）（p=0.01）细胞周期蛋白E表达和外源性核苷供应将起源间距离增加到159±11（n=42）(图S5C). 这些结果表明细胞周期蛋白E过度表达导致复制应激，可通过外源核苷的供应来缓解。
接下来，我们研究了外源性核苷供应对由细胞周期蛋白E过度表达。分析显示，DSB的水平在以下方面显著增加细胞周期蛋白EγH2AX foci测定的表达：在表达细胞周期蛋白E（p=5×10–5) (图S5D)表达BJ细胞中1.2±1.5个病灶/细胞（n=57）至27±2.5个病灶/电池（n=110）细胞周期蛋白E（p=1×10–15) (). 正如在E6/E7表达细胞中发现的，外源性核苷供应降低了细胞周期蛋白EBJ细胞表达3.5±2.1个病灶/细胞（n=64，p=8×10–13)原代成纤维细胞中3.3±0.8个病灶/细胞（n=44）（p=5×10–9) (和图S5D). 总之，这些结果表明，细胞或病毒致癌基因激活Rb-E2F通路导致核苷酸库不足，导致复制应激和DNA损伤。重要的是，这种复制诱导的DNA损伤可以通过外源性核苷供应来挽救。
核苷酸生物合成途径的激活拯救复制应激和基因组不稳定性
我们旨在进一步了解癌基因表达导致细胞增殖的低核苷酸库的分子基础。细胞增殖依赖于不同核苷酸代谢基因的协同激活(刘等人，2008;Mannava等人，2008年)受转录因子和细胞增殖主调控因子的严格调控。因此，我们假设癌基因表达细胞中的低核苷酸池是由于核苷酸生物合成途径激活不足所致。为了验证这一假设，我们对BJ细胞进行了无偏全转录组分析，并与表达细胞周期蛋白E分析显示，最显著上调的途径与细胞周期有关（p=1.52×10–15)和DNA复制（p=3.2×10–12) (). 重要的是，细胞周期蛋白E表达未能上调核苷酸生物合成途径。嘌呤和嘧啶生物合成途径中8个重要基因的表达水平-PPAT、DHODH、ADSL、CTPS、NME1、IMPDH2、TS、和建议零售价2-如所示图S6A我们在BJ和角质形成细胞中使用RT-qPCR与表达细胞周期蛋白E或E6/E7。结果表明，癌基因表达后，大多数基因的水平没有改变（分别为6个和7个基因）(、黑色条和图S6B). 这些结果表明，Rb-E2F的异常激活加强了细胞增殖，但未能激活核苷酸生物合成途径，导致正常复制所需的核苷酸库不足。
影响c-myc公司核苷酸生物合成基因的表达、核苷酸库、复制动力学和DNA损伤（A） 核苷酸生物合成途径中c-Myc靶点表达水平的折叠变化。黑条，E6/E7的表达正常化到原代角质形成细胞的水平；灰色条，表示c-myc公司在表达E6/E7的角质形成细胞中，标准化为仅表达E6/E的细胞中的水平。水平表示为平均折叠变化±SEM（n=3）。
（B） 原代角质形成细胞、表达E6/E7的角质形成上皮细胞和共表达E6/E7的角朊细胞中的核苷酸水平c-myc公司.*p<0.05。水平表示为平均折叠变化±SEM（n>3）。
（C） 叉速分布（Kb/min）。黑条，角质形成细胞表达E6/E7（n=173）；灰条，角质形成细胞表达E6/E7，c-Myc增强核苷酸生物合成（n=175）。
（D） 在表达E6/E7的细胞（n=80）和表达E6/E7的角质形成细胞中，具有指示数量的γH2AX病灶的细胞核百分比，c-Myc的核苷酸生物合成增强（n=103）。
另请参见图S6.
表1
BJ细胞中Cyclin E、c-Myc或两者共表达后的显著上调途径
| 期限 | | P值 | 折叠富集 | 财务总监 |
|---|
| 周期素 |
细胞周期
| 1.42 × 10–18 | 8.693907512 | 1.52 × 10–15 |
|
DNA复制
| 2.98 × 10–15 | 16.8358209 | 3.20 × 10–12 |
| 卵母细胞减数分裂 | 1.32 × 10–8 | 5.962686567 | 1.4 × 10–5 |
| 系统性红斑狼疮 | 5.45 × 10–6 | 5.183660644 | 0.00580449 |
| 孕酮介导的卵母细胞成熟 | 1.08 × 10–5 | 5.34784899 | 0.011501479 |
| c-Myc公司 |
DNA复制
| 7.02 × 10–15 | 10.63095238 | 8.34 × 10–12 |
|
细胞周期
| 4.50 × 10–13 | 4.953161593 | 5.36 × 10–10 |
|
嘧啶代谢
| 6.07 × 10–10 | 4.876691729 | 7.24 × 10–7 |
|
嘌呤代谢
| 4.18 × 10–9 | 3.68627451 | 4.98 × 10–6 |
| 卵母细胞减数分裂 | 4.30 × 10–6 | 3.543650794 | 0.005126052 |
| 孕酮介导的卵母细胞成熟 | 1.36 × 10–5 | 3.791596639 | 0.016195283 |
| 细胞周期蛋白E c-Myc |
DNA复制
| 2.12 × 10–17 | 12.87671233 | 2.45 × 10–14 |
|
细胞周期
| 2.89 × 10–11 | 4.939591287 | 3.34 × 10–8 |
|
嘧啶代谢
| 3.78 × 10–11 | 5.611535689 | 4.37 × 10–8 |
|
嘌呤代谢
| 8.97 × 10–10 | 4.090249799 | 1.04 × 10–6 |
| 卵母细胞减数分裂 | 1.17 × 10–5 | 3.648401826 | 0.013464979 |
| 核苷酸切除修复 | 1.19 × 10–5 | 5.794520548 | 0.01377895 |
| 不匹配修复 | 3.33 × 10–5 | 8.061941632 | 0.038459564 |
最近发现核苷酸生物合成受c-Myc调控，c-Myc是参与DNA复制和细胞增殖的许多基因的主调控因子(Liu等人，2008年;Mannava等人，2008年). 然而c-myc公司在E6/E7或细胞周期蛋白E表达式(、黑色条和图S6B) (Gross-Mesilaty等人，1998年). 表达人逆转录病毒载体的BJ细胞的全转录组分析c-myc公司3周的cDNA显示，正如预期的那样，最显著上调的途径是DNA复制（p=8.34×10–12)，细胞周期（p=5.36×10–10)，嘧啶（p=7.24×10–7)和嘌呤（p=4.98×10–6)新陈代谢(和图S6A). 值得注意的是，原代角质形成细胞表达c-myc公司无法增殖；因此，不能在这些细胞中进行全转录组分析。
值得注意的是，Rb-E2F异常激活未能激活核苷酸生物合成途径中的许多重要基因，而c-myc公司显著上调嘌呤和嘧啶代谢途径。因此，研究增加核苷酸生物合成途径的上调作用是很有意思的c-myc公司异常激活的Rb-E2F细胞中的表达。为此，我们表示c-myc公司在表达细胞周期蛋白E或E6/E7治疗2-4周。BJ细胞共表达的全转录组分析细胞周期蛋白E和c-myc公司发现最显著的激活途径是DNA复制（p=2.45×10–14)，细胞周期（p=3.34×10–8)，嘧啶（p=4.37×10–8)和嘌呤代谢（p=1.04×10–6) (和图S6A). 这些结果表明c-myc公司通过异常激活Rb-E2F通路，表达上调了被迫增殖的细胞中核苷酸的生物合成。我们使用RT-qPCR分析对E6/E7和E6共存的角质形成细胞进行了验证c-myc公司分析显示重要核苷酸生物合成c-Myc靶点的转录水平增加了2-5倍(IMPDH2、NME1、ADSL、DHODH、CTPS、PPAT、RRM2、和TS公司)与同一供体细胞在同一时间段内只表达E6/E7的水平相比(，灰色条）。我们进一步测试了这种生物合成基因的激活是否可以调节E6/E7表达的角质形成细胞中的核苷酸水平。事实上，HPLC分析显示，在核苷酸生物合成途径激活后，表达E6/E7的细胞中dATP、dTTP和dCTP的水平增加了约3.5倍(和表S3).
然后我们分析了这些细胞的复制动力学。结果表明，E6/E7-表达细胞的复制速率显著增加，从0.86±0.06 Kb/min（n=173）增加到1.14±0.05 Kb/minc-myc公司-表达细胞（p<4×10–8) (). 过表达BJ细胞核苷酸生物合成的激活细胞周期蛋白E也导致了更高的分叉进展率（从0.84±0.04 Kb/min[n=72]到0.97±0.03 Kb/min[n=104][p=0.005]）(图S6C).
我们进一步假设，核苷酸水平的增加和复制应激的缓解将导致这些细胞中DSB的减少。为了验证这一点，我们测量了γH2AX病灶的形成。结果显示–24)与仅表达E6和E7基因的细胞相比，表达E6/E7的角质形成细胞中γH2AX焦点形成减少，其中核苷酸生物合成受c-Myc上调（4.4±0.6 foci/细胞，n=103）（p<5×10–24) (). BJ细胞表达细胞周期蛋白E显示了类似的结果。与表达γH2AX的对照细胞相比，核苷酸生物合成的上调导致γH2AX foci减少（每个细胞1.3±0.3 foci，n=48）细胞周期蛋白E（每个细胞3.0±0.5焦距，n=64）（p<0.009）(图S6D). 值得注意的是，c-Myc激活了大量基因；因此，不能排除c-Myc的额外影响。
在表达E6/E7癌蛋白的细胞中，另一种可能导致低核苷酸库的机制是E6介导的p53失活，它抑制核糖核苷酸还原酶M2 B的表达(RRM2B型)基因。在DNA修复过程中，脱氧核苷酸生物合成需要RRM2B(Kimura等人，2003年;Tanaka等人，2000年). 为了测试这种可能性，我们用含有人类E6/E7的逆转录病毒载体感染表达E6/E73周的角质形成细胞RRM2B型cDNA。首先，我们验证了RRM2B型RT-qPCR表达(图S6E). 然后我们分析了RRM2B型复制动力学的表达。我们的结果表明RRM2B型表达E6/E7表达引起的复制应激。在原代角质形成细胞中，平均复制率为1.2±0.04 Kb/min（n=169），平均起源间距为132±8 Kb（n=67）。在同一供体细胞中表达E6/E7约3周后，复制率为0.54±0.2 Kb/min（n=161），起源间距离为69±4 Kb（n=94）。在表达E6/E7和RRM2B型平均速率为0.59±0.04Kb/min（n=60），平均原点间距为79±7Kb（n=32）。这些结果表明RRM2B型表达并不能缓解E6/E7癌基因表达带来的复制应激(图S6F和S6G). 细胞周期蛋白E对Rb-E2F通路的异常激活不会导致p53降解；因此，RRM2B似乎不太可能在导致这些细胞中出现低核苷酸池的机制中发挥重要作用。
总之，我们的结果表明，Rb-E2F通路的激活不能激活许多核苷酸生物合成基因。核苷酸生物合成途径的上调增加了核苷酸库，缓解了复制应激，并减少了DNA损伤。
讨论
这里，我们表明，激活Rb-E2F通路的癌基因诱导的基因组不稳定的基础是不协调的S期进入，导致正常DNA复制所需的因素不足。我们发现，细胞被迫增殖，而核苷酸库不足以支持正常的DNA复制。在这些条件下，复制机器无法实现正常的速率和过程性，导致DNA损伤和基因组不稳定。
在过去的十年中，人们做出了巨大的努力来理解导致癌症发展中基因组不稳定的机制。不同的模型表明这种不稳定性是由端粒缩短引起的(Plug-DeMaggio等人，2004年)，缺氧(Coquelle等人，1998年)，缺陷DNA损伤修复(Duensing和Münger，2002年)，染色体分离错误(Duensing等人，2000年)，废除核分裂检查点(汤普森等人，1997年)和活性氧物种(Klaunig和Kamendulis，2004年). 最近，肿瘤诱导的DNA复制应激被认为是一种模型(Halazonetis等人，2008年). 根据这个模型，癌基因在癌症发展早期诱导基因组不稳定的机制是通过引起复制应激导致DNA双链断裂。然而，这种致癌增强复制应激的分子基础在很大程度上仍不清楚。
在我们的研究中，我们研究了导致表达HPV-16病毒致癌基因E6/E7或细胞致癌基因的细胞DNA损伤的机制细胞周期蛋白E都激活了Rb-E2F通路，这是细胞增殖和DNA复制的主要调节器。我们的结果表明，病毒或细胞癌基因对Rb-E2F通路的异常激活导致复制叉的进展受到干扰，来自同一来源的叉之间的对称性较差(,,图S2A和图S5B). 这表明复制机器的处理能力较差，从而导致复制分叉崩溃和DSB(,、和图S5D). LOH分析通过显示对复制应激条件敏感的常见易碎位点的优先不稳定性，为扰动复制提供了进一步证据(Tsantoulis等人，2008年).
以前的研究表明核苷酸库对正常DNA复制的重要性(Anglana等人，2003年;Courbet等人，2008年). 羟基脲是核糖核苷酸还原酶的抑制剂，它降低了dNTP池并导致DNA复制速度减慢(Anglana等人，2003年)，原点间距离短(Ge等人，2007年)，DSB的形成(Saintigny等人，2001年)和脆性位点的表达(Yan等人，1987年). 我们的结果表明，Rb-E2F激活癌基因表达后，核苷酸库显著减少(,、和表S3). 此外，核苷酸库的增加挽救了癌基因表达细胞中受干扰的复制和复制诱导的DNA损伤(,,图S3B和S3C、图S4A–S4C和图S5B–S5D). 重要的是，外源性核苷供应降低了软琼脂中细胞的非锚定生长()表明致癌性降低。总之，我们的研究表明，肿瘤诱导的Rb-E2F表达诱导核苷酸合成不足以支持细胞的广泛增殖，导致复制诱导的DNA损伤和致瘤性增加。
如前所述，核苷酸库的大小可能以两种不同的方式调节复制。它可以在S期激活休眠起源(Ge等人，2007年)另一种方法是，当起源在S期被激活时，一个不良的核苷酸池可以决定G1的起源选择。最近，Courbet等人（2008年）研究了暴露于蚜虫精（一种DNA聚合酶α和δ的抑制剂，影响S期复制速率）的细胞的复制动力学。通过DNA梳理，他们揭示了相邻起源的异步发射，正如第一个模型所预期的那样(Ge等人，2007年). 在这里，我们展示了在前S阶段对起源发射的调制。我们建议，在长期暴露于低核苷酸池的情况下，细胞通过在G1期确定增加的起源密度来补偿DNA复制压力，而不是通过在S期激活休眠的起源().
Rb-E2F途径的致癌激活细胞周期蛋白E或HPV-16 E6/E7导致参与细胞增殖和DNA复制的许多基因上调，其中包括许多E2F靶点(Garner-Hamrick等人，2004年;Hwang和Clurman，2005年). 我们的结果(,图S6A和S6B、和)提示细胞中的低核苷酸池是由于核苷酸生物合成途径和细胞周期的不协调激活所致。最近，研究表明c-Myc是核苷酸生物合成的重要调节因子，其表达可增加核苷酸水平和细胞增殖(刘等人，2008;Mannava等人，2008年). 事实上细胞周期蛋白E和c-myc公司发现最显著上调的途径是细胞周期和DNA复制，以及嘌呤和嘧啶代谢(,、和图S6A和S6B). 这导致核苷酸库增加，从而缓解这些细胞中的复制应激和DNA损伤(和表S3).
总之，我们认为，在癌症发展的早期阶段，细胞或病毒致癌基因激活Rb-E2F通路会导致许多参与细胞周期控制的基因的转录发生变化，从而迫使细胞增殖和DNA复制。这导致不协调进入S期，核苷酸生物合成途径异常激活。因此，DNA复制从低核苷酸库开始，导致复制应激和DNA损伤。我们的结果表明，提高细胞核苷酸库可以缓解这种癌基因诱导的复制应激，减少DNA损伤，并降低过度表达这些癌基因的细胞的致瘤性。在癌症发展的更高级阶段，其他机制可能导致染色体不稳定，如端粒缩短、DNA损伤修复缺陷、染色体分离错误和氧化应激().
导致癌症早期基因组不稳定的事件模型癌基因表达通过细胞周期调节因子（Rb-E2F）的异常激活来迫使细胞增殖。核苷酸生物合成途径的激活不足会导致低核苷酸库无法支持正常的DNA复制。这会导致复制应激，并在癌症发展的早期阶段促进基因组不稳定。其他因素会导致肿瘤发生不同阶段的基因组不稳定，如活性氧物种（ROS）、端粒丢失、缺氧、有丝分裂检查点取消和DNA损伤反应（DDR）丢失。
癌症的疾病进展是复杂和多因素的，取决于获得适应性突变。在许多癌症中，c-myc公司在开发后期高度表达(Grandori等人，2000年). 这会增强增殖并减少DNA损伤(Gordan等人，2008年). 显然c-myc公司在癌症发展的晚期，细胞能够更有效地增殖，并增加细胞的致瘤性(Narisawa-Saito等人，2008年). 然而，在许多类型的癌症中，基因组不稳定性可能随着不协调的细胞路径而启动，导致核苷酸不足，而在其他癌症中，如高表达c-myc公司在早期，染色体不稳定可能由其他机制引起。
核苷酸库也受到环境因素的影响，如叶酸，叶酸是一种重要的维生素，参与许多细胞成分的代谢，包括dTTP的合成。因此，正常DNA复制需要饮食中适当水平的叶酸(Rampersaud等人，2002年). 近年来，许多研究表明叶酸缺乏与多种癌症的发生有关，包括HPV诱导的宫颈癌(García-Closas等人，2005年;Rampersaud等人，2002年). 我们的复制动力学分析表明，HPV癌基因和细胞周期蛋白E导致核苷酸库不足。加上叶酸摄入量低，复制预计会受到严重干扰。由于DSB形成率高和基因组不稳定，这可能导致致癌风险增加。
总之，复制应激和由此产生的基因组不稳定性是癌症早期发展的主要驱动力。我们的结果为肿瘤诱导的复制应激的分子基础提供了新的线索，表明肿瘤诱导的细胞增殖可能无法实现足够的核苷酸库来支持正常的DNA复制。我们的结果提出了一种新的模型，即对产生平衡水平的细胞增殖因子所需的基本途径进行不协调调节。这就为开发新的预防癌前病变的方法提供了可能性。
