有效的突触传递需要从突触小泡中快速释放神经递质，突触小囊在钙离子进入时与突触前质膜融合(1). 膜融合必然意味着一个融合孔，在融合的瞬间在囊泡和其伙伴膜之间打开。根据电导特性，这种初生融合孔的直径通常在~2 nm范围内，但存在相当大的差异(2–5). 神经递质从突触小泡（直径约40 nm）释放(6,7))在最初的一到二百微秒内通过新生孔隙扩散，甚至在孔隙发生明显膨胀之前(4). 融合孔的瞬态和可变性质严重限制了生物化学和物理化学研究。
这里我们建议纳米光盘(8–11)应为此类研究提供一个理想的模型，因为少量的椎间盘脂质应足以使毛孔开放但不扩张(和)超越神经递质释放的新生的生理相关状态。纳米盘是一种合成的脂蛋白颗粒，含有一小块圆形脂质双层（直径约17纳米），由两份源自载脂蛋白A1的膜支架蛋白（MSP）包裹。在我们将在这里描述的系统中，纳米盘包含突触v-SNARE VAMP2和小的单板层小泡（30-60nm范围(12))包含syntaxin1和SNAP25的突触t-SNARE复合体。SNARE是这种和其他细胞膜融合过程的核心机器(12–14). 它们在双层之间组装成四螺旋束(15)施加足够的力以引起双层融合(16).
（A） 展示v纳米圆盘模型的卡通。纳米盘是由两个MSP（蓝色）包裹的一小块脂质双层。VAMP2（绿色）可以插入纳米盘形成v盘(11). 脂质头部组显示为灰色球体。
（B） 纳米盘或v盘在Superdex 200 10/300 GL柱上的洗脱曲线。与不含VAMP2的纳米盘（黑色峰）相比，嵌入VAMP2导致v盘（红色主峰）的洗脱体积更早。通过凝胶过滤，6His-SUMO标签（通过SUMO蛋白酶从VAMP2上切割，红色小峰）也可以被去除。
（C） SDS-PAGE凝胶经考马斯亮蓝染色，显示凝胶过滤后的输入和最终纳米片产品。
（D） V盘样品在FEI Tecnai-12电子显微镜中进行分析。V型椎间盘呈规则的“椎间盘”形状（左图），由于VAMP2蛋白体积小，结构灵活，几乎看不到。当可溶性Syntaxin1A H3结构域和SNAP-25N/C结构域与v-disc共同孵育时，它们形成SNARE复合物，可被视为从v-disc两侧伸出的杆状结构（红色，右侧）（绿色，右侧）。
（A） 显示如何设想融合孔的示意图。纳米盘的直径为16纳米。自然形成平坦表面的脂质将有利于具有零净曲率的结构（当忽略高斯曲率时）。因此，在鞍状（颈状）结构中，正曲率（孔隙）和负曲率（垂直于孔隙，如图所示）的顺序相同。4 nm的孔对应于双层外部6 nm的曲率。这大致就是这里所表示的。在没有应力的情况下，可以形成1nm的孔。在合理的应力（θ=20度）下，可以得到4nm的孔径。
（B） 脂质混合是SNARE特有的。v盘与t脂质体（蓝色）交换脂质。不含VAMP2的圆盘不能与t-脂质体（红色）融合，滴定游离t-SNARE的CDV也会阻断融合（绿色）。
（C） 钙释放是SNARE特有的。50 mM钙被封装在t-脂质体中。在脂质体-阳极盘融合过程中，孔隙打开，钙从脂质体释放到外部缓冲液中，mag-fluo-4信号增强。增加的mag-fluo-4信号表明钙在融合过程中持续释放（蓝色），在非融合条件下（红色和黑色）未观察到明显的钙释放。
（D） 连二亚硫酸钠试验显示，融合40分钟后，NBD具有一定的保护作用（蓝色）。为了完全淬灭所有NBD信号，首先添加洗涤剂（De）破坏脂质体，然后添加连二亚硫酸钠（Di）获得100%淬灭（棕色）。用CDV阻断融合，连二亚硫酸钠处理（绿色）后未观察到NBD保护。
重组后(补充文本)，通过凝胶过滤分离含有VAMP2（v盘）的纳米盘(). 每个圆盘包含约400个由两个MSP包裹的脂质分子。当MSP:VAMP2的起始比率为2:6时，我们在去除VAMP2游离片后平均每个椎间盘恢复约7 VAMP2。v盘的电子显微镜（EM）证实平均直径为16±2 nm(). 毫不奇怪，这些椎间盘上的单个VAMP2蛋白由于其小尺寸和灵活的结构而不易区分。然而，添加可溶性t-SNARE（Syntaxin H3胞质结构域和SNAP25N/C螺旋结构域的复合物）形成杆状SNARE复合物，现在可以看到其从纳米盘突出(). 这证实了纳米盘上的VAMP2可以形成SNARE复合物。我们使用了一种成熟的脂质混合分析(23)测试v盘是否能与t小泡融合。NBD-磷脂酰乙醇胺（PE）和罗丹明-PE包含在v纳米盘中（各1.5摩尔%）。这种表面浓度有效地熄灭了NBD荧光。然而，当纳米圆盘与脂质体融合时，NBD荧光将大大增加，因为当圆盘脂质与大量过量的囊泡脂质混合时，脂质会被大量稀释（＞50倍），正如我们所观察到的那样(). 在控制实验中观察到NBD信号几乎没有增加。纳米盘和囊泡之间的缓慢脂质混合受到对接速度（初始SNARE组装）的限制，而不是融合速度(补充图S1)囊泡-囊泡融合系统也是如此(17). 当SNARE放置在相反的拓扑结构中时，观察到类似的融合过程，其中v-SNARE位于囊泡中，t-SNARE则位于纳米盘中(补充图S2).
为了监测通过在融合过程中必须至少瞬时形成的融合孔的内容物流出，将钙（50 mM）封装在脂质体中，然后在含有2μM钙激活荧光团Mag-Fluo-4（Invitrogen，Kd日对于22μM的钙）。当毛孔打开时，钙会通过毛孔扩散到外部缓冲区，从而产生荧光信号。结果()清楚地表明钙是以SNARE特有的方式释放的。为了确定这种流出是由于通过孔隙扩散而非融合过程中囊泡的瞬时溶解/泄漏造成的，我们测试了不同尺寸囊泡货物的释放速率，特别是钙螯合剂EDTA（斯托克斯半径：~0.4 nm）和EGTA（斯托克半径：~0.5 nm）。EDTA的释放速度是EGTA脂质体的2.3倍(补充图S3). 根据这些数据，可以计算出~2nm的孔径(补充文本)，与根据电生理测量计算的新生融合孔大小相似(三).
当囊泡与靶膜融合时，融合孔最终膨胀，囊泡并入靶膜。然而，使用纳米盘时，孔不能明显地扩展到其初始直径~2nm以外，因此减少膜应力（由小孔固有的极端曲率引起）的唯一方法是使孔最终重新密封。为了证实纳米盘孔重新密封的预测，我们在开始融合分析40分钟后将连二亚硫酸钠（5 mM）引入样品中。连二亚硫酸钠将淬火所有可从外部进入的NBD(18)包括未反应纳米盘两面的NBD和通过半融合或完全融合扩散到脂质体外叶的NBD脂质。连二亚硫酸钠也足够小（斯托克斯半径：0.2–0.3 nm），可以很容易地扩散通过任何2 nm的融合孔，这些融合孔可能保持打开状态，并在孔保持打开的情况下熄灭内叶上的NBD信号，但如果孔如预测的那样关闭，则无法进入内部。我们观察到，只有在熔融反应后，大量的NBD染料才能抵抗连二亚硫酸钠(和补充图S4). 阴性对照组未发现NBD保护作用。因此，存在一些与纳米盘和脂质体之间的完全融合相对应的融合事件，其中一定有一个孔已经打开，然后重新密封。NBD脂质最初仅作用于t-脂质体的反向实验证实，在完全融合后基本上没有毛孔保持开放(补充图S5). 根据连二硫酸盐数据，约50%的融合事件需要完全融合，随后重新密封孔隙（参见补充文本). SNARE复合依赖性事件的约50%平衡可由类似于半融合的事件来解释，在半融合事件中，脂质体和纳米盘之间没有孔隙开放，只有外叶共享。在所有情况下，纳米盘在孔隙重新密封后仍然附着在脂质体上(补充图S6A–D)与完全融合的再密封是一种半融合状态的想法一致，在这种状态下，脂质双层柄将囊泡的外叶永久连接到包含纳米盘小叶的SNARE复合体（如图所示补充图S6F). 重新密封后，VAMP2对毒素裂解具有完全抵抗力，表明它处于顺式–SNARE综合体(补充图S6E、F).
通过调整输入VAMP2:MSP比率，可以控制每个制动盘的VAMP2数量。随着纳米盘组装过程中VAMP2:MSP比率的增加，v盘产品在凝胶过滤柱（Superdex-200）上的洗脱时间更早，这与尺寸增加和每个圆盘中插入更多VAMP2一致(). 为了测试SNAREpins的数量如何影响融合，我们纯化了7组纳米盘，在通过亲和纯化去除不含VAMP2的纳米盘后，分别含有平均1.2（ND1）、2.2（ND2）、3.15（ND3）、4.3（ND4）、5.5（ND5）、7.4（ND7）和9.3（ND9）个VAMP2拷贝(和补充图S7). VAMP2和MSP以不同比例混合在这些制剂中，融合实验中使用的最终分离纳米盘中的VAMP2/MSP比率通过三种独立的方法确定：考马斯蓝基蛋白质测定()，定量Western Blotting(图S7)或者倒计时含有荧光标记VAMP2的单个纳米盘颗粒的离散光浸出步骤(图S13). 这三种方法非常一致（尤其是ND1和ND2在+/-3%（SD/meanX100）范围内）；看见表S2).
（A） v型圆盘的洗脱轮廓，每个圆盘具有不同的VAMP2副本。随着VAMP2的加入，v型圆盘在Superdex200色谱柱上以较小的洗脱体积洗脱。
（B） 测定每个纳米盘的VAMP2数量。采用SDS-PAGE凝胶染色法对凝胶过滤得到的v盘样品进行考马斯亮蓝染色分析。根据相应蛋白带的定量，通过VAMP2:MSP的比率确定每个椎间盘的VAMP2拷贝数。每个v型椎间盘人群平均每个椎间盘有1.2（ND1）、2.2（ND2）、3.15（ND3）、4.3（ND4）、5.5（ND5）、7.4（ND7）和9.3（ND9）个VAMP2拷贝。
（C） 脂质混合分析表明，具有不同VAMP2拷贝数的圆盘在与钙包裹的t-脂质体融合方面同样有效。
（D） 不同拷贝数的VAMP2 v盘与t钙脂质体融合后，钙释放试验显示出不同的动力学。随着VAMP2拷贝数的增加，钙的释放逐渐增加。
误差线为SEM。
（E） 给出了40′融合反应后脂质混合（蓝色）和钙释放（绿色）的终点值。由平均终点值归一化的脂质混合，与VAMP2的数量没有显著差异。钙释放按ND9的值进行标准化，呈S形变化，拐点为每个纳米片约5 VAMP2。
值得注意的是，所有七个样本都以相同的速度驱动脂质代谢()这意味着每个纳米盘的单个v-SNARE产生最大的膜融合速率。此外，连二亚硫酸钠保护试验表明，对于任何VAMP2拷贝数，与完全融合相对应的脂质缺失事件百分比保持在45%±7%（SD，补充图S8). 总之，这两个结果清楚地证明，单个SNARE钉足以驱动完全的膜融合。
我们的纳米盘-脂质体系统中形成的孔隙是暂时的，最终会自动重新密封(图S5). 因为我们的调脂实验能够实现全膜融合（即脂质的完全交换），所以我们可以为这些孔隙保持开放的时间设定一个下限。为了使所有荧光磷脂在纳米盘和脂质体之间平衡，孔必须保持开放约10μs。（5μm磷脂需要约10μs2/s扩散系数覆盖50nm2，半个纳米盘嵌入双层，并到达融合孔）。相反，简单的考虑和体内对突触小泡释放神经递质的观察表明，约40nm脂质体或突触小囊中的神经递质大小的物质需要更长的时间（约100μs）才能完全流出(4,19–21).
纳米盘和囊泡之间的融合孔是否保持足够长的开放时间，使这些货物流出？答案()是当可以形成多个或多个SNARE复合体时，而不是只有一个SNAREpin可用时。与脂质混合率相反，随着每个椎间盘的VAMP2数量从约9减少到约1，最大货物流出量从12%（ND9和ND7）急剧减少到小于2%（ND1和ND2）。因此，尽管全膜融合事件的速率和频率并不取决于每个椎间盘的VAMP2分子数量，但货物释放效率对SNAREpin数量高度敏感，随着每个椎间盘中SNAREpins数量增加到2个以上，其释放效率急剧增加。
在非常低的SNARE数（即ND1或ND2）下，毛孔打开的时间仅足以交换脂质，因此只释放出一小部分内容物。从ND3光盘开始，释放量增加，ND7光盘达到最大释放量——光盘重新组装，总共约有7个VAMP2蛋白质，或每个纳米光盘表面约3.5个(表S2)–表明最大流出量需要3或4个VAMP2蛋白。最简单的模型是，当使用一个SNARE引脚时，发布是有限的，当使用足够的SNARE pin时，内容发布会突然增加到阈值以上(图S12C). 在纳米盘系统中，当纳米盘的任何一侧至少具有所需的最少数量的SNARE时，就达到了临界数量。事实上，假设VAMP2在每个制动盘的两侧随机分布(图S12B)，整个滴定过程中的钙释放很好地符合这种“合作”模型，并将有效释放含量的SNAREpins阈值描述为~3(图S12C)这与体内观察结果一致。
SNARE跨膜结构域（TMD）在融合中的作用尚不清楚。VAMP和Syntaxin的组装胞质结构域需要膜锚定，当这由跨膜脂质融合提供时，仍会发生(22). 相反，Syntaxin1 TMD的点突变会降低电生理学中足部信号的振幅(23)VAMP2 TMD的缺失显著降低了神经递质的释放(24). 这意味着TMD在新生生理融合孔的开放或在传输器流出所需的~100μs内保持其开放或两者兼有中发挥作用。因为当脂质锚介导融合时，融合孔必须打开，至少是暂时打开，最简单的可能性是，当传输器退出且孔尚未开始明显膨胀时，TMD以某种方式阻止融合孔重新密封。在这方面，需要注意的是，VAMP和Syntaxin TMD作为双螺旋束延伸穿过整个膜(25). 这就增加了一种可能性，即SNARE TMD在双层内的末端拉链所产生的力可能会提供一种能量来源，以平衡新生融合孔的重新密封。
为了验证这个假设，我们使用了三种嵌合VAMP2蛋白()其中VAMP2 TMD被以下物质取代：（i）仅跨越一个单层的二油酰磷脂（C18），（ii）可跨越脂质双层的长C45类异戊二烯（C45），或（iii）来自血小板衍生生长因子受体（PDGFR）的非SNARE TMD(). 与野生型VAMP2一样，7个PDGFR椎间盘样品（特征在于补充图S9)制备：PND9、PND7、PND5、PND4、PND3、PND2和PND1，其PDGFR的平均拷贝数分别为9.0、7.2、5.7、4.4、3.75、2.7和1.2。脂锚（C18和C45，平均每个ND约5个拷贝）的融合效率比VAMP2 TMD低5-10倍()而PDGFR TMD的融合速度与原生VAMP2 TMD相同，每个纳米盘上的VAMP数量都相同(). 使用C18 VAMP时，注入连二亚硫酸钠后，荧光信号崩塌回到背景水平(补充图S10)，表明只有外层小叶是共享的(即半融合）。相比之下，C45和PDGFR TMD实现了完全融合，效率与原生VAMP2 TMD基本相同，约为50%。这证实了实现完全融合需要一个跨膜结构域（无论是脂类还是蛋白质），并且还表明只有SNARE复合物的胞质结构域拉链时，融合孔开放。因此，双层融合和新生孔的伴随开口不需要将Syntaxin和VAMP TMD组装到双层跨度螺旋束中。
（A） 显示野生型和各种嵌合VAMP2的示意图。VAMP2或PDGFR TMD的C18、C45（茄尼酯）结构和蛋白质序列。C18仅跨越脂质双层的一个小叶，而C45和蛋白质TMD跨越脂质双层。
（B） t脂质体与用wt VAMP2或CD VAMP2与C18或C45制备的v盘的脂质混合分析。与野生型VAMP2与天然TMD相比，脂质锚定C18或C45的融合效率降低。
（C） 脂质混合实验表明，VAMP2和PDGFR的TMD具有相似的融合动力学，这表明这两种TMD在脂质混合中是等效的。
（D） 钙释放试验表明，当蛋白质TMD被脂质锚定C18或C45取代时，钙释放显著减少。
（E） 钙释放试验表明，VAMP2 TMD比PDGFR TMD更有效地释放内容物。
误差线为SEM。
为了确定这些人工融合事件中开放孔的寿命，我们采用了钙释放试验。与脂质混合相比，非天然VAMP2 TMD均未有效释放货物(). 这些实验表明，天然VAMP2 TMD是在孔隙打开后有效释放囊泡内容物所特别需要的，这是由于降低了新生融合孔隙的重新密封速率而实现的。
在纳米光盘系统中，内容发布的程度可以只有由总时间在永久重新密封之前，孔是打开的。如果孔隙在~100μs内重新密封（根据扩散常数、囊泡和孔径计算），即使圆盘和囊泡双层中的脂质已经完全混合，也只会存在相当部分的货物。这些考虑对于理解纳米盘实验揭示的SNARE及其TMD对囊泡融合和内容物释放的数量的不同要求至关重要。具体地说，我们的结果表明，虽然单个SNARE复合物足以在纳米盘和囊泡之间打开一个融合孔，但该孔的寿命太短，无法在孔闭合之前让许多传输器退出。只有当同一孔中装配有多个或多个SNARE销时，它才能保持足够长的打开时间，以便有效释放发射器。即使有足够多的SNARE，除非VAMP和Syntaxin的TMD能够以某种方式在双层中拉链，以保持孔的开放，可能是通过在TMD在双层内拉链时径向向外推，否则孔似乎是短命的。一个拉链SNARE别针无法做到这一点，这解释了为什么它必然是无效的。但很容易看出，三个或更多的SNARE销径向相互推开，可以传导跨双层拉链的能量，以保持新生孔隙的开放。在这个推测模型中，对重新密封的限制力只能持续到TMD拉链的时间，根据双螺旋线圈的最大折叠速度，可能会超过100μs(26–28)考虑到碳氢化合物的粘度高于水(29)足够让神经递质完全释放。
之前的一项研究表明，单个SNARE复合物可以介导囊泡-囊泡融合，也测量了含量混合(30). 有趣的是，修正了无SNARE小泡的公开数据（参见补充文本)这也表明，相对于每个囊泡一个SNARE复合物的双层融合，内容物混合大大减少。囊泡-囊泡融合本质上是一种通过新生融合孔释放神经递质的不良模型，因为内容物混合不仅通过新生孔发生（如纳米盘和突触），而且随后囊泡更缓慢地完成融合。然而，尽管存在这些限制，我们仍然可以找到我们所发现的机制的迹象。
这些发现为理解看似矛盾的关键公布数据提供了简单的机械基础。渗透性或完整神经分泌细胞中优势相互干扰SNARE突变体的滴定表明，至少需要三个SNARE钉才能打开足以容纳神经递质流出的融合孔(31,32). 肉毒杆菌毒素A滴定与SNAP25裂解的定量分析被解释为至少需要10-15个SNAP25分子(33)，但该分析假设所有SNAP25都存在于SNARE复合体中，必须仅视为上限。相比之下，一个优雅的单粒子、单分子分析结合囊泡融合反应清楚地确定，在许多融合囊泡中存在单个SNARE钉(30). 我们现在可以看到，所有这些结果都来自一个单一的潜在机制，在这个机制中，新生融合孔的动力学由所涉及的SNAREpin的数量决定。突触小泡具有约70个v-SNARE VAMP2拷贝(6)活动带富含t-SNARE(34)，确保始终有多个SNARE插针可用，以保持孔打开，并尽可能快地将发射器放出。
