膜融合：与SNARE和SM蛋白质结合

摘要

真核生物的生命依赖于膜细胞器的融合。每一个重要的过程都依赖于膜融合的有序执行，从所有细胞的精细区室组织到大脑中突触传递的精确时间。长期以来，SNARE和SM蛋白被认为是融合所必需的，但直到最近，它们的确切合作方式还不清楚。此外，由于这种普遍的融合机制是组成性的“开”，融合控制的必要性——从细胞分裂和迁移到激素信号传递和突触传递——需要一个叠加的动态控制机制来处理SNARE和SM蛋白，不需要时将其夹紧，需要时将它们激活。

在这里，我们回顾了最近的进展，并对SNARE和SM蛋白作为通用融合机制共同发挥作用的机制提出了一个简单而统一的观点，该机制负责除线粒体外的所有细胞内膜融合。我们提供了一个关于膜融合是如何执行和控制的简单而连贯的图片，为理解导致糖尿病、免疫缺陷和帕金森氏病等多种疾病的生理学及其慢性失衡奠定基础。

SNARE蛋白质–力的产生者

NSF（用于N-乙基马来酰亚胺敏感因子）和SNAP（用于可溶性NSF附着蛋白-注意，该蛋白与下文所述的“SNAP”型SNARE蛋白无关）根据其在无细胞系统中运输囊泡融合的要求进行纯化(1——三). SNARE蛋白被鉴定为SNAP和NSF的受体（因此被命名为SNARE，缩写为SNAP受体），是一种由三种膜蛋白组成的复合物，用于连接胞外囊泡和质膜(4). 这些来自突触前质膜的蛋白syntaxin-1和SNAP-25，以及位于突触囊泡中的囊泡相关膜蛋白（VAMP）/突触蛋白syntabobrevin，之前已经分别进行了测序和定位(5——9). 它们与许多突触囊泡蛋白和酵母分泌基因一起被认为是直接或间接参与囊泡转运的保守基因家族的成员(10——15). 与他们提出的融合中心重要性一致(4)突触SNARE蛋白被确定为肉毒杆菌和破伤风毒素的靶点，这些毒素是阻止突触囊泡融合的特异性蛋白酶(16——18). 在突触上发现膜桥联SNARE复合体将注意力集中在这三种蛋白质（及其在其他细胞器和组织中的同源物）上作为膜融合的核心，并认为突触SNARE蛋白及其普遍表达的同源物是通用融合蛋白，这一概念被广泛称为SNARE假说(4). SNARE假说还假设SNARE可分为两大类，即运输囊泡中的v-SNARE和靶膜中的t-SNARE，这两种SNARE的配对可为膜融合增加细胞室特异性。对来自酵母基因组的数百种SNARE组合进行的综合测试表明，酵母细胞的房室特异性几乎在所有情况下都与分离的SNARE的物理化学相关。只有十几种左右的SNARE组合是融合形成的，与细胞中已知的运输过程相对应(19——21)，证明SNARE可以赋予膜融合相当大的特异性。

SNARE蛋白的结构和SNARE复合物的结构说明了它们的机制(图1). 单个SNARE蛋白是展开的，但它们会自发组装成一个非常稳定的(22)四螺旋束(23)它在膜之间形成一种“跨S NARE复合物”（也称为“SNAREpin”），通过在膜上拉链时迫使膜紧密结合来催化融合，对任何试图分离螺旋的行为施加力(图2A)(24，25). 据估计，断裂跨SNARE复合物所需的力在100–300 pN范围内，每个SNAREpin释放约35 k_B类能量T（相当于约20千卡/摩尔）(26). 脂质双层融合的活化能在50–100 k范围内_B类T型(27)因此，根据目前的估计，三个或更多适当布置的单个SNARE管脚将提供足够的能量来驱动聚变(28). 融合后状态(图2B)，全拉链SNARE复合体（从融合膜发出）被称为“顺-SNARE复合体”。

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图1

SNARE和SM蛋白质的结构，以及与之斗争的一些蛋白质。(一个)VAMP/synaptobrevin-2（蓝色螺旋）、Syntaxin-1A（红色螺旋）和SNAP-25（N端和C端域分别为绿色和黄色螺旋）的SNARE复合物（也称为顺-SNARE复合物）；改编自(23)). Syntaxin-1A的Habc结构域（棕色螺旋，改编自68)任意定位。(B类)一种SM蛋白，突出其拱形结构（Munc18-1，改编自(38)). (C类)复合物，结合到SNARE复合物（复合物-1，以洋红显示，改编自(66))，具有以反平行方向结合在v-和t-SNARE界面的螺旋区。(天)突触结合蛋白，用于同步突触传递的钙传感器（Synaptotagmin-1，改编自(69，70))，其膜近端（C₂A） 和膜远端（C₂B） C类₂标记的结构域和临界结合钙离子（橙色）的位置。所有蛋白质在同一尺度上，双层厚度大致在相同尺度上。

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图2

(一个)SNARE催化膜融合的拉链模型。锚定在一个膜（t-SNARE）上的三个螺旋与锚定在另一个膜上的第四个螺旋（v-SNAR）结合，形成反-SNARE复合物或SNAREpins。装配从SNARE的膜远侧N端逐渐向膜近侧C端进行。这会产生一个向内的力矢量（F），将双层拉在一起，迫使它们融合。在发生熔合之前，从空间上防止完全拉链，因此熔合和拉链的完成是热力学耦合的。(B类)因此，当发生聚变时，作用力消失，SNARE处于低能顺-SNARE复合体中。

目前的证据表明，SNARE复合物的形成通过简单的机械力促进膜融合，因为它们通常的多肽膜锚可以被跨越两个小叶的被动脂质结构所取代(29). 此外，SNARE基序和跨膜区之间的连接区至关重要(30，31)作为一个力传感器，将跨纳米复合物拉链释放的能量转换为催化力，使对合双层融合。

总的来说，融合是由依赖ATP的SNARE关联和分离循环驱动的。在这个循环中，双层合并在热力学上与SNARE蛋白质的外显折叠相耦合，然后由一种特殊的ATP酶（NSF）进行内显去折叠，使其返回到另一轮的初始状态。这种简单的热力学机制已在含有纯化v-和t-SNARE蛋白的人工脂质囊泡的自发融合中得到证实(25). 一旦组装好，SNARE复合物就被ATP酶NSF及其衔接蛋白SNAP回收，后者直接与SNARE复合物结合(32，33). NSF是一种六聚体，大概在每个催化循环中使用3-6个ATP（总计约20-40 kcal/mole）来破坏SNARE复合体。

SNARE蛋白是多种多样的（作为一个超家族，通常有20–30%的蛋白质序列相同），但每个都包含一个具有七肽重复序列的特征~70个残基“SNARE基序”(34). 正是这个图案形成了四螺旋束。大多数但并非所有的SNARE蛋白都是膜锚定的（在其羧基末端），包含单个SNARE基序，但SNAP-类SNARE除外，它们包含两个基序，专门用于胞吐。在四螺旋束中，四类SNARE基序在结构上被区分（称为R-、Qa-、Qb和Qc-SNARE模序；34）。所有SNARE复合体都包含每个类别的一个成员，这被称为R/Q规则，R-SNARE通常对应于v-SNARE，Q-SNARE通常对应于t-SNARE。通常，v-SNARE位于与三个t-SNARE分离的膜中，以便发生融合(19). 这种拓扑限制揭示了v-和t-SNARE组件在力生成机制中不同但未被充分理解的作用。

因此，虽然SNARE在热力学上推动聚变，但在可以研究孤立SNARE动力学的各种定义系统中，对催化效能的估计差异很大。单次事件的熔化动力学范围约为10毫秒(35，36)在最早的研究中，人群为10分钟(25)，并强烈依赖于SNARE浓度和局部膜结构，这表明在生理条件下可能需要额外的蛋白质。事实上，虽然SM蛋白可以在高SNARE浓度下在体外被排除，但正如我们现在所看到的，体内系统普遍需要SM蛋白作为t-SNARE复合物的亚单位来捕捉组装的SNARE复合体。

SM蛋白–锁扣SNAREpins

自从分离出与突触t-SNARE syntaxin-1结合的突触SM蛋白（Munc18-1）以来，SM蛋白一直与膜融合联系在一起(37)但直到最近才对SM蛋白如何在融合中工作有了明确的认识。SM蛋白以多种方式与SNARE蛋白结合，包括作为结合拉链SNARE复合物的v-SNARE和t-SNARE组分的扣。现在看来，SM蛋白可能在空间和时间上组织反式-SNARE复合物（即SNAREpins）。

SM蛋白(图1B)由一个保守的~600个氨基酸序列组成，折叠成一个拱形的“卡环”结构(38). SM蛋白以不同的方式与SNARE相互作用。首先，它们与单个突触t-SNARE亚单位syntaxin-1结合，形成包含部分SNARE基序的复合物，从而阻止SNARE复合物的形成(图3A). 在这里，SM蛋白包含一个四螺旋束，该四螺旋束仅形成于合成蛋白内。除了其SNARE基序外，Syntaxin-1还包含一个三螺旋束，其中包含其球状N末端“Habc”结构域，该结构域向后折叠并结合螺旋SNARE模序以形成“闭合”的Syntaxin构象(38，39). 在这种排列中，SM-蛋白抓住了这四个螺旋——三个来自Habc域，第四个来自SNARE主题。只有SNARE超家族中的结合蛋白具有这样稳定的分子内闭合构象，但这种结构揭示了SM蛋白的一个一般特征：它们基本上被设计成四螺旋束。我们很快就会看到，这也可以是拉链SNARE销的四螺旋束。

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图3

SM蛋白被设计成结合四个螺旋束。(一个)Syntaxin-1A的“闭合”构象，其中SM蛋白Munc18-1结合由Syntaxin自身的Habc结构域（三个螺旋，棕色）和其自身的SNARE基序螺旋（第四个螺旋，红色；改编自(38)). 到目前为止，这种封闭状态仅在与胞吐有关的联会蛋白中被发现。插图：SM蛋白通过Habc N末端的一个特殊序列普遍连接到Habc结构域（标记为N肽；改编自38，43，44). (B类)t-SNARE复合物的“开放”构象，由t-SNARE及其同源SM蛋白结合到其合成蛋白Habc结构域的N肽组成。这被认为是t-SNARE与同源v-SNARE开放（即反应）形成反-SNARE复合物的普遍状态(C类)导致融合。蛋白质结构域在B和C中的位置是任意的。图C展示了SNARE和SM蛋白，这是一种通用的融合机制。

早期发现这种与合成蛋白-1的闭合构象结合的模式，导致了SM蛋白作为负调控因子的建议。然而，在所有融合反应中都需要SM蛋白，所有涉及融合反应的基因筛查都确定了编码SM蛋白的基因（例如，参见10，40). 此外，主要突触SM蛋白（Munc18-1）的反向基因缺失可以阻止胞吐，而不会改变突触的形成(41)甚至比删除VAMP/synaptobrevin的强大作用更彻底(42). 因此，SM蛋白不仅可能是负调控因子。

最近，当发现SM和SNARE蛋白质之间的第二种不同的相互作用机制时，这一机制缺口得到了解决(图3B)解释了SM蛋白如何促进融合。在这里，SM蛋白通过其N端叶锚定到合成蛋白的特定N端肽序列(43，44). 这种结合使SM蛋白的拱形体可以自由折叠在SNARE别针上，并在膜附近的拉链四螺旋束上扣上(图3C).

当然，只有当v-SNARE（一个螺旋）与t-SNARE结合形成四个螺旋时，这种情况才会发生，这可能使SM蛋白能够在时空上合作进行反-SNARE复合物的组装和组织，从而刺激SNARE介导的融合，将其连接到syntaxin的N末端(45，46). 靶向突变和生物物理研究表明，SM蛋白与SNARE复合体中v-和t-SNARE表面的残基接触(45，46)，正如预期的那样(图3C).

因此，SM蛋白和SNARE蛋白是融合机制的通用组成部分，对细胞膜融合同样重要（图4），并且能够促进细胞室特异性(47). 然而，在定义的融合试验中，这种对SM蛋白的明确体内需求并不明显，回顾过去，该试验使用了非生理学上高浓度的SNARE。通过在没有SM蛋白的情况下最大限度地利用SNARE融合，定义的系统确实建立了SNARE蛋白融合的内在热力学充分性，但同时又以某种方式绕过了复杂细胞环境中对SM蛋白的重要需求。我们将这种差异归因于细胞中相对较低的SNARE浓度，可能保持较低水平以有效调节其活性(47).

SM蛋白是如何与SNARE复合物进行融合的，目前尚不清楚。我们认为SM蛋白通过帮助SNARE在两个膜的界面处组装成生产性拓扑结构（例如有助于打开融合孔的环状结构），可能通过限制SNARE向融合膜之间的空间扩散，从而与SNARE合作，发挥动力学作用(48). 因此，SM蛋白可能作为SNARE的催化剂，而SNARE又是膜融合的催化剂。含有SM蛋白Vps33的HOPS复合物似乎以这种方式起作用(49). 我们还注意到，与SNARE蛋白结合的SM-蛋白可能在融合中发挥额外的功能，与它们在融合中的普遍作用无缝融合，例如在囊泡栓系和调节融合速度中(50).

总之，通用聚变机械(图3C)由v-SNARE蛋白和t-SNARE复合物组成，后者由一个结合蛋白“重链”和一个或两个相关的非结合蛋白SNARE“轻链”组成，以及一个与结合蛋白N末端结合的同源SM蛋白。t-SNARE复合物将同源的v-SNARE接合在相反的膜中，当这两个SNARE向膜方向拉链时，SM蛋白至少部分地通过环向夹住组装的跨SNARE复合体而进行融合。

复合物-与SNARE结合以实现突触传递

不同的细胞内融合反应受制于不同的调节过程，使通用融合机制适应生物体生理学。由于膜融合是由蛋白质折叠的热力学自发过程驱动的，因此这些调节因子可以防止过度融合事件的发生。同样重要的是，这些调节器使融合机制处于活动状态，以便能够快速同步融合以响应触发。通过抓取（即“近距离抓取”）SNARE，调节蛋白可以完成有序的夹持和激活，将机械保持在“翘起”状态，只需要一个小的触发刺激就可以向前爆发。抓钩可用于防止或诱导动作；换句话说，从本质上讲，抓斗能够在不同的条件下抑制过程、激活过程或两者兼而有之。

复合蛋白和突触结合蛋白可能是膜融合中最容易理解的抓取蛋白(51). 这两种蛋白质共同解释了胰腺分泌胰岛素和突触释放神经递质等激素的精确时间和调节，突触是大脑所有信息处理的基础。正如我们现在将要描述的那样，突触和其他胞外SNARE首先被激活，然后被复合蛋白钳制(52——54)最终由Ca触发^2个+与synaptotagmin结合，逆转复合蛋白的作用，使融合得以完成(55，56).

在突触处，任何时候只有少数突触小泡停靠在突触前质膜上，这些小泡是融合过程中最先进的，被称为“为融合做好准备”或“易于释放”。当Ca^2个+作为到达动作电位的结果进入神经末梢，该离子选择性地触发这些小泡的融合，通常在不到一毫秒的时间内，比任何其他膜融合事件都快(57)，引物囊泡与其他囊泡和动力学上最先进的囊泡不同，因为它们的v-SNARE已经与质膜t-SNARE形成部分拉链式反-SNARE复合物，这一事实可以证明，络合剂作用于钙的上游^2个+-触发的融合，但仍需要SNARE-complex绑定函数(52，58). 复合物作为一种典型的抓钩蛋白，将拉链式SNARE复合物提升到这种激活但冻结的状态，并在Ca^2个+进入并结合到synaptotagmin。

突触结合蛋白(图1D)是一种突触（或分泌）囊泡蛋白，含有两种蛋白激酶C样C₂域，导致作为Ca的建议^2个+-胞吐传感器(59). synaptotagmin结合Ca的事实^2个+(60)和SNARE蛋白(5，61，62)，它是C₂域作为自治Ca起作用^2个+-绑定域–实际上，是第一个C₂为其显示此信息的域(63)–证实了这一假设。小鼠需要突触结合蛋白来实现神经传递的紧密调节、同步（即快速和协调）突触胞吐，但不需要突触囊泡融合就其本身而言(63). 减少钙^2个+-小鼠突触结合蛋白的结合亲和力导致相应的钙降低^2个+-熔合灵敏度由Ca决定^2个+-与synaptotagmin结合(55，56)，正式证明synaptotagmin是传感器。在触发突触融合时，突触结合蛋白与磷脂和钙内的SNARE复合物结合^2个+-规范的方式(56).

引人注目的是，复合蛋白的缺失导致了突触球蛋白缺失的精确现象：钙的丢失^2个+-触发同步释放，但不是融合，因为异步释放未受影响(52)这表明复合蛋白在某种程度上可以激活SNARE复合物，以进行随后的突触结合蛋白作用。此外，复合蛋白钳夹融合，证明两者在体外抑制SNARE介导的融合(54，64)以及通过在缺乏复合蛋白的突触中增加自发的突触融合(58，65). 那么，Ca^2个+-与synaptotagmin结合可释放复合蛋白钳夹，并通过与SNARE复合物和磷脂结合触发融合。

最近的研究揭示了络合剂与突触素协同控制融合的精确性。复合蛋白包含一个中心α螺旋，它在膜近端的v-和t-陷阱的界面结合(图1C;66). 它还包含一个辅助螺旋和一个非结构化的N末端序列，位于膜的近端——拉链的最后阶段发生在这里。在本期科学类据报道，复合蛋白中心螺旋及其副螺旋的SNARE结合是激活和钳制融合所必需的，而N端非结构序列只需要激活而不需要钳制(58，67). 辅助螺旋可以通过与t-SNARE的膜近端部分形成交替的四螺旋束来夹紧融合，从而防止v-SNARE完成其拉链并触发融合(67). 这创造了一个“拨动开关”，可以在晚期可逆地夹紧熔合。反过来，N末端复合蛋白序列可能会与插入融合膜的跨S NARE复合物相互作用，因为膜上突触素的点突变阻止了复合蛋白的激活(65).

复合蛋白和突触球蛋白在钙离子通道中如何相互作用^2个+-触发熔合来控制这个拨动开关？突触结合蛋白与复合蛋白竞争，与组装的SNARE复合物结合，在钙中释放复合蛋白^2个+-依赖方式(54)，Ca最简单的可能分子机制^2个+-联轴器。然而，复合蛋白和突触结合蛋白如何作用于由Ca设计的二元复合体中的SNARE复合体的细节^2个+并使突触传输的最高速度和精确度在未来保持不变。

观点

真核生物的细胞内膜融合是由SNARE和SM蛋白组成的保守和通用的融合机制执行的。融合是蛋白质折叠（v-SNARE与t-SNARE的组装，由SM蛋白质在空间和时间上组织）与双层扰动的热力学耦合的结果。折叠产生的能量被有效地引导到双层中，因此平衡融合是受欢迎的自发反应。然而，融合在空间和时间上都受到严格的调控，最引人注目的是在突触，在突触中，融合的调控使大脑能够进行信息处理。我们才刚刚开始了解这种调节是如何起作用的，但就突触而言，最近通过阐明络合物、SNARE和突触结合蛋白之间的相互作用，分子细节已经被解开了谜团。有大量的蛋白质和化合物，更零碎的证据表明，这些蛋白质和化合物可能调节突触和其他融合过程，包括Rab GTPases、栓系蛋白和磷脂酰肌醇的大家族，但基本原理可能是相同的，这是由本综述中描述的简单机制驱动的。

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