的静音CXCR4系列阻止乳腺癌转移

摘要

介绍

RNA干扰是双链RNA触发相应细胞基因沉默的细胞机制(1–三). 细胞中的双链RNA被加工成21到22个核苷酸的短双链RNA，称为小干扰RNA（siRNA；参考文献。4,5). RNA干扰技术在哺乳动物细胞中应用的一个重大突破来自于一种21到22核苷酸合成小干扰RNA的开发，它可以沉默哺乳动物细胞中的靶基因(6,7). Sorensen等人表明，以阳离子脂质体为基础的小鼠静脉注射带有编码绿色荧光蛋白及其同源siRNA的质粒的小鼠，能够抑制各种器官中绿色荧光蛋白的表达(8). 最近，也有研究表明，无载体的尾静脉注射可以有效地在出生后小鼠的肝、肺、肾、脾和胰腺中传递并在注射后24小时检测到双重siRNA(9). Song等人还报告称，单剂量静脉注射siRNA双链沉默Fas表达可保护小鼠10天内免受自身免疫性肝炎的影响(10).

乳腺癌细胞通常在器官选择过程中转移到局部淋巴结、骨髓、肺部和肝脏。趋化因子受体CXCR4通过与其配体基质细胞衍生因子-1（SDF-1；参考文献。11). 在这里，我们成功地阻止了在体外入侵和体内在我们的动物模型中通过沉默乳腺癌细胞的转移CXCR4系列siRNAs基因表达。针对CXCR4的siRNAs将有助于CXCR4系列乳腺癌转移的基因功能和治疗应用。

材料和方法

结果

选择性拮抗剂或抗CXCR4抗体抑制CXCR4/SDF-1相互作用阻止乳腺癌转移体内(11,12,15,16). 因此，我们试图确定通过使用siRNA降低CXCR4 mRNA水平是否可以抑制乳腺癌转移。通过RNA干扰来阻止CXCR4的表达可能会更有效地防止由CXCR4/SDF-1相互作用介导的癌症转移。针对CXCR4 mRNA开发了两种siRNAs。siRNA1在减少CXCR4表达方面比siRNA2更有效(图1). siRNA1和siRNA2的结合（siRNA1+2）在mRNA和蛋白质水平上对CXCR4的表达实现了更好的抑制(图1).

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图1

用生物素化CXCR4拮抗肽和链亲和素-血红蛋白对CXCR4 siRNA-转染MDA-MB-231细胞后48小时MDA-MB-231细胞CXCR4表达水平进行免疫荧光染色。红色，CXCR4藻红蛋白染色；蓝色，细胞核的反染色。B、，对siRNA-转染MDA-MB-231细胞的CXCR4进行RT-PCR分析表明，siRNA1+2有效地阻断了CXCR4 mRNA的表达。用抗CXCR4抗体Ab-2（1:1000）对siRNA转染的MDA-MB231细胞进行的Western blot结果表明，siRNA 1+2几乎完全阻断了CXCR 4蛋白的表达。β-肌动蛋白（Sigma，1:2500）作为负载对照。续，控件。

通过siRNA降低CXCR4mRNA水平抑制了CXCR4/SDF-1介导的侵袭，如通过Matrigel侵袭测定所测量的。转染siRNA1的MDA-MB-231细胞的侵袭性下降到对照细胞的39%，siRNA2的侵袭性降低到51%，siRNA 1+2的侵袭性仅为16%(图2).

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图2

转染CXCR4 siRNAs的MDA-MB-231细胞的侵袭。A、，H&E染色显示转染对照siRNA的MDA-MB-231细胞的侵袭性(控制siRNA)Matrigel侵袭试验中的siRNA1、siRNA2或siRNA1+2。B、，与对照组相比，转染siRNA1+2、siRNA1和siRNA2的MDA-MB-231细胞的侵袭性为16%(P（P）< 0.0003), 39% (P（P）<0.0014）和51%(P（P）<0.0026）。三个实验的平均值。

将转染CXCR4 siRNA1+2的MDA-MB-231细胞经雌性SCID小鼠尾静脉静脉注射。人类细胞中合成的siRNA-介导的RNA干扰是暂时的，细胞在4-6天内从单一治疗中恢复(7). 因此，在注射肿瘤细胞后，每周静脉注射两次CXCR4沉默siRNA（不含脂质体）。使用的六组动物描述如下表1.肿瘤细胞注射45天后，对照组（第1组）的所有动物均发生肺转移。相反，第2组中只有一只动物发生了转移，几乎看不到转移。组1中6只动物肺表面微转移平均面积的粗略估计为54.2±6.9%，而组2中6只小鼠的平均面积为4.2±1.7%。中肺部的代表性图片图3A类对照组可见明显的囊性肺微转移。另一方面，五个治疗组的三张有代表性的肺部图片显示，可见的肺转移明显减少，其中第2组和第5组的肺转移最为明显。第2组肺组织的H&E染色显示正常肺组织的形态，而对照组的H＆E染色显示肿瘤细胞浸润(图3A类). 使用人类家政基因引物的半定量实时RT-PCR进一步证实了这些结果高性能放射治疗不会与其对应的鼠标发生交叉反应(图3B类). 使用RT-PCR检测肺部MDA-MB-231细胞高性能放射治疗而不是CXCR4系列因为CXCR4系列siRNA预计这些细胞中的水平较低，可能并不表明肺部存在转移。实时RT-PCR分析显示高性能放射治疗对照组SCID小鼠转移滤过肺中的mRNA。相反，根据肺组织中癌基因的表达水平，第2、3和5组的肺转移明显较少hHPRT公司在肺部(图3B类). 如预期，针对特定人的实时RT-PCRCXCR4系列这些肺组织的基因在对照组小鼠肺中显示出高CXCR4表达，而在治疗组的肺中则显示出低得多的CXCR4表达(图3C类).

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图3

CXCR4 siRNA抑制乳腺癌转移的作用体内。A、，来自两个独立实验的每组肺的代表性照片及其H&E染色（原始放大倍率×100）。B、，实时RT-PCR的平均值高性能放射治疗来自siRNA-处理组相对于对照组。1,第1组；2,第2组；三，第3组；4,第4组；5,第5组；6,组6 in表1。的平均表达水平高性能放射治疗在第2、3、4、5和6组中为12.5%(P（P）< 0.0040), 21.5% (P（P）< 0.0064), 47% (P（P）< 0.0447), 25.3% (P（P）<0.0063）和42.1%(P（P）<0.031）。C、，每个治疗组的人类CXCR4平均表达水平的百分比与对照组的百分比相对。第2、3、4、5和6组中人类CXCR4的平均表达水平为8.1%(P（P）< 0.0006), 22.9% (P（P）< 0.0022), 40.1% (P（P）< 0.0157), 23.8% (P（P）<0.0074）和59.1%(P（P）<0.152）。

在转染48小时后，使用细胞滴定AQ96检测试剂盒（Promega）对转染非特异性对照siRNA或CXCR4 siRNA1+2的种子细胞测定CXCR4 siRNA的潜在细胞毒性/克隆原性。siRNA1+2转染细胞的生长率为85.9±15.7%(P（P）=0.139），表明siRNA处理对粘附细胞生长/克隆形成性的影响相对较小。因此，在siRNA处理的动物中，肺转移的缺失不太可能是由于CXCR4 siRNA对MDA-MB-231细胞的细胞毒作用，而是由于转移过程受到抑制。这种细胞毒性的缺乏也意味着对正常细胞的系统影响有限。

我们利用微PET显像和FDG检测第1组和第2组小鼠的肺转移。图4显示了具有代表性的FDG-PET图像，证实对照组有肺转移，而第2组肺转移明显减少。图4A类是从第1组（对照）中的三只代表性小鼠产生的最大强度投影。对照组每只小鼠的胸部明显明亮(左边)与siRNA1+2治疗组的任何小鼠相比(正确的). 由于FDG的分泌，在膀胱中也可以看到高FDG摄取。图4B类和C类分别选取冠状面和横轴面断层图像。肺区的SUVmax图4C类为8.6、7.1、9.3、2.2、2.5和2.1。这六只动物肺表面微转移平均面积的粗略估计为54%、48%、57%、0%、6%和1%。的相对表达水平高性能放射治疗与小鼠1相比，小鼠2、3、4、5和6分别为0.82、1.07、0.02、0.07和0.02。总的来说，这些图像清楚地表明，对照组的肺内FDG摄取量要高得多(左边)与siRNA1+2治疗组相比(正确的)这表明对照组的肺转移明显多于siRNA1+2治疗组。

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图4

CXCR4 siRNAs抑制乳腺癌转移的作用体内经FDG-PET确认。第1组（对照siRNA）和第2组（siRNA1+2）的FDG-PET代表性图像。A、，第1组6只代表性小鼠的最大强度投影(左，三只老鼠)和第2组(对，三只老鼠).B、，同一动物肺部冠状断层图像A类。C、，同一动物肺区的横轴断层图像A类。

讨论

针对CXCR4 mRNA开发了两种siRNAs。siRNA1和siRNA2的组合（siRNA1+2）比单独使用两种siRNA都能更好地抑制MDA-MB-231细胞中CXCR4的表达。通过siRNAs降低CXCR4 mRNA水平可抑制CXCR4/SDF-1介导的侵袭，如Matrigel侵袭试验所测。结合两种不同的siRNAs增强的基因沉默不仅导致蛋白质和mRNA表达水平的降低，而且还导致功能水平的降低。

针对CXCR4的siRNA被证明可以抑制在体外T细胞嗜性HIV-1细胞感染在体外(17–19). 针对不同序列的诱导性RNAi系统CXCR4系列也抑制了乳腺癌细胞的迁移在体外(20). 以前的工作包括我们自己的工作表明，通过使用抗CXCR4抗体或拮抗剂阻断CXCR4/SDF-1相互作用可以减少肺部转移负担(11,12). 我们目前的工作与之前的工作不同，因为我们通过使用反义技术降低了CXCR4水平，而不是阻断受体/配体相互作用。使用CXCR4拮抗剂（抑制蛋白相互作用）预防转移并不能保证使用CXCR4-siRNA（抑制mRNA表达）预防转移。两者都需要证实CXCR4确实是癌症预防的目标。

在实验性MDA-MB-231细胞转移动物模型中比较CXCR4 siRNA的各种治疗组合。对第1组至第4组进行比较，以确定(一)降低CXCR4水平是否可以阻止乳腺癌转移到肺和(b条)siRNAs的前处理或后处理效率如何。我们的结果表明，最有效的治疗方法是注射CXCR4 siRNA1+2转染的细胞，再加上每周两次静脉注射siRNA1+2。直接注射裸siRNA可使未转染细胞的转移减少53%，并使经HPRT水平测定的siRNA预处理细胞的转移降低78%。siRNA的传递可以通过脂质体传递或与待内吞的表面受体配体结合来改善。然而，只要保持有效的siRNA浓度，我们发现癌症转移可以被抑制。虽然siRNA在人类细胞中的作用只是暂时的，但与对照组相比，注射siRNA转染的肿瘤细胞而不注射siRNA的小鼠形成了21.5%的肺转移。一种可能的解释是，用CXCR4 siRNA1+2转染的肿瘤细胞不能附着在肺组织上，因为这些细胞的CXCR4水平显著降低。因此，肺部的SDF-1不能吸引这些在细胞表面表达不充分CXCR4蛋白的肿瘤细胞。对第1、2、5和6组进行比较，以确定不同的siRNAs组合是否会在预防转移方面产生不同程度的效率。在这两种情况下，siRNA1在降低CXCR4表达方面比siRNA2更有效在体外和体内条件（第5组与第6组）。siRNA1和siRNA2的结合（siRNA1+2）可以进一步抑制CXCR4的表达在体外而不是单独一个人。同样，siRNA1+2的组合体内与单独使用siRNA1相比，预防肺转移的作用略强（第2组与第5组）。CXCR4 siRNA治疗仅抑制MDA-MB-231细胞中的CXCR4水平，而不影响hHPRT水平在体外然而，CXCR4 siRNA治疗显著降低了动物肺部hHPRT水平所反映的肺转移。在CXCR4 siRNA处理的动物中，肺转移减少是由于转移能力受到抑制，而不是由于siRNA的细胞毒性(图3B类和C类)为0.9674，表明CXCR4表达水平降低可阻止乳腺癌细胞形成肺转移。使用无创性FDG-PET检测肺转移进一步支持了这些发现，该方法可以敏感地检测肿瘤细胞，无论深度如何，而大多数光学成像方法仅限于检测皮下肿瘤。因此，CXCR4对乳腺癌细胞的肺转移是必需的和关键的。

我们使用siRNAs来抑制CXCR4基因的表达，并确定这些siRNA对乳腺癌转移的影响。在Matrigel侵袭试验中，通过两种siRNAs的组合在mRNA水平上抑制CXCR4的表达，可显著削弱乳腺癌细胞系MDA-MB-231的侵袭性，并在动物模型中阻断MDA-MB231细胞的肺转移。这些数据与使用抗CXCR4抗体显示的CXCR4在转移中的需求一致(11,12)并建议CXCR4作为预防转移的新靶点。与细胞毒治疗相比，转移计划是通过靶向CXCR4（转移的关键因素之一）来实现的。Takei等人(21)据报道，在动物模型中瘤内注射血管内皮生长因子siRNA抑制肿瘤。然而，瘤内注射缺乏临床应用价值。在我们的研究中，我们使用静脉注射大量siRNAs来防止乳腺癌的肺转移。这是首次证明，通过静脉注射动物获得的裸siRNA双链体池可以抑制乳腺癌转移，开辟了预防癌症转移的新途径。

致谢

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