中的突变发票编码inversin导致2型肾病，将肾囊性疾病与初级纤毛功能和左右轴测定联系起来

转化酶与肾胱氨酸共沉淀

我们测试了反转蛋白是否参与与肾胱氨酸（NPHP1型，突变导致NPHP1。肾胱氨酸与转化酶特异性共沉淀(图2a)反之亦然(图2b、c)但不含控制蛋白。为了证实来自小鼠肾脏和睾丸的内源性蛋白之间的相互作用，我们制备了一种逆转蛋白特异性抗血清。我们使用一种麦芽糖结合蛋白（MBP）-反转蛋白融合蛋白免疫兔子，该融合蛋白含有小鼠反转蛋白的561-716氨基酸。然后，我们使用谷胱甘肽S-转移酶（GST）-转化酶琼脂糖柱亲和纯化转化酶特异性抗血清。亲和纯化兔抗血清特异性识别HEK293T细胞中表达的转化酶和重组GST–转化酶，但不识别其他两种对照GST融合蛋白(图2d). 小鼠肾脏免疫沉淀物的Western blot分析证实了反转蛋白和肾胱氨酸的相互作用(图2e)，表示发生了此交互体内.

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图2

肾胱氨酸与HEK293T细胞和小鼠组织中的反转蛋白相关。(一)Myc标记的肾胱氨酸（Myc–NPHP1）与N末端FLAG标记的全长反转蛋白（FLAG–INV）或FLAG标记TRAF2（FLAG-TRAF2）蛋白共表达，作为阴性对照。用抗FLAG抗体免疫沉淀后，用肾胱氨酸特异性抗血清检测共沉淀的肾胱氨酸（左图）。我们使用肾胱氨酸抗体（中间面板）或FLAG特异性和肾胱胺酸特异性抗体（右侧面板）通过免疫印迹控制细胞裂解物中的蛋白质表达水平。分子量标记以kDa表示。(b)将全长肾胱氨酸融合到人IgG1的CH2和CH3结构域，并用蛋白G琼脂糖珠沉淀。如FLAG特异性抗体所示，FLAG标记的逆转蛋白与肾胱氨酸特异性共沉淀，但与对照蛋白（未经肾胱蛋白融合的人类IgG1的CH2和CH3结构域）无特异性共沉淀。(c（c）)作为阴性对照的FLAG标记的肾胱氨酸或FLAG标记TRAF2蛋白与N-末端Myc-tagged全长反转蛋白（Myc–INV）共表达。用抗FLAG抗体免疫沉淀后，用反转蛋白特异性抗血清（左、中面板）检测共沉淀反转蛋白。右图显示用FLAG特异性抗体开发的裂解物对照。(d日)MBP-inversin融合蛋白（小鼠inversin的氨基酸561-716）的兔抗血清可特异识别HEK293T细胞中表达的inversin（氨基酸1–716）（左侧面板），但不包括FLAG标记的控制蛋白podocin（FLAG–podocin）、肾胱氨酸（FLAG-NPHP1）或PACS-1（FLAG-PACS–1，氨基酸85–280；左侧面板）。它还特异性地识别重组GST-inversin（氨基酸561-716），但不识别其他两个对照GST融合蛋白（下表）。(e（电子）)显示内源性肾胱氨酸转化酶相互作用体内在小鼠肾脏中，一半的小鼠肾脏组织裂解物用血凝素对照抗体免疫沉淀，另一半用抗肾胱氨酸抗血清沉淀。用inversin特异性抗血清（右上面板）检测固定化inversin。通过重制肾胱氨酸印迹（右下面板）确认内源性肾胱胺酸沉淀。左侧面板显示裂解物控制。

β-微管蛋白是肾胱氨酸相互作用的伴侣

为了在转染FLAG标记的肾胱氨酸或FLAG标记控制蛋白（RGS3或GFP）的HEK293T细胞的细胞裂解液中识别与肾胱胺酸相互作用的其他蛋白质，我们使用FLAG抗体进行免疫沉淀。我们通过考马斯蓝和银染色鉴定了差异共沉淀蛋白。HEK293T细胞中表达的FLAG标记肾胱氨酸共免疫沉淀的二维（2D）电泳鉴定出至少五种不同的肾胱胺酸结合蛋白（数据未显示）。我们使用质谱和western blot分析确定（3-微管蛋白为最突出的部位(图3a). 对HEK293T细胞中表达的FLAG标记蛋白（GFP、TNF受体相关因子2（TRAF2）和肾胱氨酸）的免疫沉淀物的分析表明，β-微管蛋白与肾胱胺酸特异性相关(图3b，c). 我们将相互作用定位于肾胱氨酸237和670氨基酸残基之间的C末端区域(图3c). 我们重现了纤毛肾小管细胞内源性蛋白的这一发现，表明这种相互作用发生了体内(图3d). 我们确认了体内小鼠肾组织中的相互作用（数据未显示）。这些数据表明肾胱氨酸存在于含有β-微管蛋白的蛋白质复合体中体内(图3).

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图3

肾胱氨酸与β-微管蛋白的分子相互作用。(一)为了鉴定肾胱氨酸相互作用蛋白，用FLAG标记的控制蛋白GFP或FLAG标记肾胱胺酸转染HEK 293T细胞。使用抗微管蛋白抗体的2D凝胶免疫印迹证实了β-微管蛋白与肾胱氨酸的特异性关联。免疫球蛋白轻链。(b)生成了几个FLAG标记的肾胱氨酸截短片段，以分析肾胱胺酸与β-微管蛋白的相互作用。内源性β-微管蛋白与转染的全长肾胱氨酸沉淀，但与对照蛋白GFP或TRAF2无沉淀（上面板）。中间面板，裂解物中天然β-微管蛋白的表达。下面板显示了中间面板中所示的膜与抗FLAG抗体的复制（在62kDa标记下仍检测到β-微管蛋白），证实了FLAG标记蛋白的可比表达水平。(c（c）)这种相互作用被映射到涉及氨基酸237–670的肾胱氨酸区域(c（c），上面板）。显示了β-微管蛋白的表达水平(c（c），底部面板）。用抗FLAG抗体重复印迹，以确认裂解物中FLAG标记蛋白的表达(c（c），下部面板）。(d日)纤毛mCcd-K1细胞中内源性β-微管蛋白与天然肾胱氨酸的共沉淀。mCcd-K1细胞生长7天，直到识别出纤毛（数据未显示）。对细胞裂解物进行广泛的预筛选，并用对照抗体（Ab）或肾胱氨酸特异性抗血清进行免疫沉淀，并通过10%SDS–PAGE进行分离。我们使用β-微管蛋白特异性抗体在含有肾胱氨酸的沉淀物中检测到内源性β-微管蛋白，这表明肾胱胺酸-β-微管制蛋白相互作用发生体内.

肾胱氨酸和转化酶与β-微管蛋白共定位于纤毛

在肾细胞中，β-微管蛋白是初级纤毛的主要成分。最近的证据表明，肾上皮原发性顶端纤毛的结构或功能缺陷与PKD之间存在关联^20,21因此，我们研究了肾胱氨酸是否如蛋白质组学数据所示是初级纤毛的组成部分²⁴我们评估了Madin–Darby犬肾（MDCK）细胞中内源性肾胱氨酸的亚细胞定位，这些细胞在汇合后在细胞培养插入物上生长至少5–7天，以允许上皮极化和纤毛形成。使用抗人肾胱氨酸的高特异性抗血清(^{参考文献13};补充图1在线），我们检测了MDCK细胞初级纤毛中特异性内源性肾胱氨酸的表达。我们发现肾胱氨酸定位于初级纤毛，并与纤毛轴丝的已知成分β-微管蛋白-4共定位(图4a、b). 随着MDCK细胞更广泛的通透性，在靠近发育纤毛基底的核周隔室和囊泡状结构中也检测到肾胱氨酸，可能代表中心体（数据未显示）。

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图4

肾胱氨酸和反转蛋白定位于肾小管上皮细胞的初级纤毛。(一)MDCK细胞初级纤毛中肾胱氨酸和β-微管蛋白-4的结肠化。上下面板显示了纤毛的两个示例。野生型MDCK细胞（克隆II）在盖玻片上100%融合生长，并在实验前培养7天，以实现完全极化和纤毛形成。使用肾胱氨酸特异性抗体和在顶膜水平捕获的共焦图像通过免疫荧光测定肾胱胺酸的定位。细胞与兔抗肾胱氨酸抗体（左面板）和小鼠抗β-微管蛋白-4抗体（中面板）共染色，然后是相应的二级抗体。(b)通过阻断重组肾胱氨酸蛋白，证实了肾胱蛋白在原发纤毛中的特异性定位。(c（c）)转化酶定位于MDCK细胞中的初级纤毛。内源性反转蛋白的定位通过使用反转蛋白特异性抗体的免疫荧光测定，共聚焦图像在顶膜水平捕获。细胞与小鼠抗β-微管蛋白-4抗体和兔抗转化酶抗体共染色，然后与相应的二级抗体共染色（下表）。在其他染色中，省略了β-微管蛋白-4抗体，以减少反转蛋白和β-微管蛋白-4信号之间的潜在光谱重叠（上面板）。(d日)初级纤毛中肾胱氨酸和反转蛋白的部分共定位。使用肾胱氨酸特异性抗体和在顶膜水平捕获的共焦图像通过免疫荧光测定肾胱胺酸的定位。细胞与山羊抗逆转蛋白抗体（左图）和兔抗肾胱氨酸抗体（中图）共染色，然后分别与二级抗体共染色。右侧面板显示了部分同位化。

值得注意的是，我们从未在整个纤毛中发现肾胱氨酸染色，而是以一种更间断的模式，而用β-微管蛋白-4抗体染色几乎总是延伸到整个纤毛上。点状染色法检测肾胱氨酸可能是纤毛静脉曲张的主要表现。平均而言，11根纤毛中有10根染色呈肾胱氨酸阳性(补充图2在线），而所有纤毛的β-微管蛋白-4均为阳性，表明肾胱氨酸对纤毛的靶向性可能受到明显调节。在不含β-微管蛋白-4抗血清的情况下，使用抗肾胱氨酸抗体和与Alexa488偶联的兔抗血清时，我们观察到相同的肾胱胺酸定位。单独使用次级抗体时，我们未检测到免疫荧光（数据未显示）。由于肾胱氨酸在MDCK细胞的原代纤毛中表达，并且由于具有肾胱氨酸缺陷（NPHP1）的个体和具有倒位蛋白缺陷（NPHP2）的个体具有相似的肾囊性表型，我们预测并通过β-微管蛋白-4和乙酰化微管蛋白的联合免疫荧光显示，逆转蛋白在MDCK细胞的初级顶端纤毛中表达(图4c和补充图3在线）。内源性肾胱氨酸和内源性反转蛋白的部分共定位主要发生在MDCK细胞的纤毛静脉曲张中(图4d)，最近显示仅inversin一项²³这些数据表明，反转蛋白和肾胱氨酸参与一个共同的途径，并为理解与基因突变相关的表型之间的相似性奠定了基础NPHP1型和NPHP2核电站.

斑马鱼

马萨诸塞州总医院动物护理研究小组委员会批准了斑马鱼研究。

突变分析

我们开发了16个外显子侧翼的引物发票来自基因组序列（引物序列可按要求提供）。我们在ABI毛细管测序仪上使用双脱氧链终止法进行直接测序，并使用sequencer软件评估序列。

质粒

肾胱氨酸的FLAG标记版本已被描述¹³J.Goodship（英国纽卡斯尔大学）提供老鼠卫生监督所cDNA。我们生成了FLAG-tagged卫生监督所PCR质粒和标准克隆技术。我们使用定点突变将突变插入卫生监督所和NPHP1型通过自动测序验证突变。

INV特异性抗血清的制备和纯化

我们使用融合到MBP（MBP–inversin）的重组、凝胶纯化的小鼠inversin片段（氨基酸561–716），按照标准免疫方案免疫兔子（Cocalico Biologicals）。为了纯化蛋白A，我们将兔抗血清加载到商用蛋白A柱上（Pierce，Perbio Science），并用0.1 M甘氨酸-HCl（pH 3.0）从柱上洗脱。为了亲和纯化兔抗血清，我们将重组GST–inversin偶联到AminoLink Plus（Pierce，Perbio Science）。我们用0.1M甘氨酸-HCl（pH 3.0）从柱中洗脱固定化反转录酶特异性抗血清，并用磷酸盐缓冲盐水进行透析。所有重组蛋白均表达于大肠杆菌BL21遵循标准协议。

协同免疫沉淀

我们进行了如上所述的联合免疫沉淀⁴⁷简单地说，我们通过磷酸钙法瞬时转染HEK293T细胞。培养24小时后，我们将细胞清洗两次，并在1%Triton X-100裂解缓冲液中进行裂解。15000离心后克（15分钟，4°C）和100000超速离心克（30分钟，4°C），我们用蛋白G–sepharose预处理含有等量总蛋白的细胞裂解液，用适当的抗体在4°C下培养1小时，然后用40µl蛋白G–sepharose珠培养约2小时。我们用裂解缓冲液广泛清洗珠子，并用10%SDS-PAGE溶解结合蛋白。为了免疫沉淀内源性蛋白，我们灌注小鼠肾脏就地在含有20 mM Tris/HCl、pH 7.5、1%Triton X-100、25 mM NaF、12.5 mM Na的裂解缓冲液中均质之前，使用冰镇磷酸盐缓冲液₄P（P）₂O（运行）₇，0.1 mM EDTA，50 mM NaCl，2 mM Na_三VO（旁白）₄和蛋白酶抑制剂。离心去除细胞碎片后，我们对上清液进行超速离心（100000克)30分钟，然后用蛋白G–sepharose进行广泛预处理。然后，我们用对照抗体或肾胱氨酸抗血清进行免疫沉淀，如最近所述¹³.

二维凝胶分析

我们用抗FLAG M2微球（Sigma）从转染肾胱氨酸或对照质粒的细胞中免疫沉淀等量的蛋白质。我们在2D凝胶（BioRad）上分离沉淀物，第一维度pH值为3–10，第二维度为8–16%SDS–PAGE。2D电泳后，我们要么用胶体考马斯兰染色法对蛋白质进行染色，要么将其印在PVDF膜上，用5%牛血清白蛋白将其封闭，然后按指示用抗体染色。对于蛋白质鉴定，我们在凝胶中还原、烷基化、消化，然后通过质谱鉴定凝胶分离的蛋白质。简单地说，我们通过MALDI质谱（Bruker Daltonik）分析了生成的肽混合物的等分（10%），以生成肽质量图。我们使用获得的单同位素肽质量列表来查询非冗余蛋白质序列数据库。通过将测得的肽质量与数据库中所有蛋白质的理论消化相关联来鉴定蛋白质。

免疫印迹试验

我们进行了所述的西部地块分析⁴⁸抗体来自Santa Cruz（β-微管蛋白-4抗体和血凝素pAb抗体）、Sigma（FLAG M2抗体）或Roche（血凝素单抗抗体）。膜的酰胺包被染色证实了蛋白质负载量相等。

MDCK细胞和mCcd-K1细胞的免疫荧光染色

我们将MDCK细胞（菌株II）或mCcd-K1细胞接种在100%合流的盖玻片上，培养7天。用冰镇磷酸盐缓冲盐水洗涤后，在室温下用4%多聚甲醛、pH 7.5和0.05%Triton X-100固定细胞15分钟。我们用磷酸盐缓冲盐水洗涤细胞三次，并按指示依次用抗体进行双重免疫荧光染色。清洗后，我们将过滤器与二级抗体Alexa 488标记的抗兔抗体和Cy3标记的抗鼠IgG孵育，再次清洗过滤器，并将其安装在市售的防褪色试剂盒（分子探针）中。使用配备100倍油浸物镜的蔡司激光扫描显微镜拍摄共聚焦图像。在没有第一或第二个一级抗体的情况下进行适当的对照。

我们感谢患者及其家人的参与，感谢J.Robillard的讨论，感谢R.H.Lyons和A.Imm的大规模测序，感谢P.Cochat对A8和A10患者临床数据的贡献。F.H.、G.W.和T.B.得到德国研究基金会Sonderforschungsbereich 592的支持，以及DFG对T.B.和G.W.的资助。；I.A.D.和T.O.得到美国国立卫生研究院对I.A.D.的资助。