血红素加氧酶-1与长时间超循环肺动脉高压实验性右心室衰竭的炎症反应

摘要

引言

肺动脉高压（PAH）是一种罕见且致命的疾病，其特征是肺血管异常收缩和肺小动脉重塑，这两种疾病都会导致肺血管阻力（PVR）逐渐增加，最终导致右心室（RV）衰竭[1]尽管最近在PAH的治疗方面取得了进展，但PAH患者的预后仍然很差，大多数患者的生活质量低，死亡率高[2]这可能与靶向治疗在降低PVR和肺小动脉重塑方面的有限疗效有关，肺小动脉重构给RV带来越来越大的负荷。患者的结局主要取决于RV对增加的后负荷的反应[3]–[4]对于PAH导致RV功能障碍的机制知之甚少。

生长期仔猪的慢性系统-肺分流已被证明在3个月的时间内繁殖典型的多环芳烃[5]–[7]以及在6个月的典型RV故障中[6]可能需要数十年才能在患者身上形成的特征。在这个实验性终末期PAH模型中，我们先前报道RV衰竭与心肌细胞凋亡和炎症过程的激活有关[8]如在狗的一过性肺动脉结扎中观察到的右心室衰竭[9]–[10]，提示急性和慢性RV衰竭的病理生物学的共同特征。

血红素加氧酶的诱导亚型HO-1在调节炎症和细胞保护过程中起着关键作用[11]HO-1催化血红素降解为一氧化碳、胆绿素和铁[12]其激活可能参与细胞防御、氧化应激降低、炎症激活抑制和凋亡，所有这些都是由于血红素的清除和HO-1产品的生物活性。

一氧化碳是一种有效的肺血管扩张剂[13]其作用类似于一氧化氮（NO），激活可溶性鸟苷酸环化酶并提高cGMP的生成。它抑制血小板聚集，减少白细胞粘附，减少细胞凋亡，降低促炎细胞因子的产生[14]–[15]因此，通过这些特性，HO-1可能与PAH和RV衰竭的发病机制有关，从而控制炎症表型。

在本研究中，我们利用先前实验中保存的肺和心肌组织，对6个月慢性系统-肺分流后晚期PAH诱导RV衰竭的猪进行研究，以确定抗炎和细胞保护性HO-1的表达，并进一步探讨肺动脉高压炎症过程的激活疾病和RV失效。

材料和方法

本研究由英国医学院动物福利机构伦理委员会批准布鲁塞尔自由大学（比利时布鲁塞尔）（许可证编号：181N），并根据美国《实验动物护理和使用指南》进行。

结果

血流动力学和形态计量学评估

6个月的慢性全身肺分流增加了平均肺动脉压（mPpa）（假手术（17±1 mmHg）vs分流（22±2 mmHg，p=0.04），肺血管阻力（PVR）（假术（2.6±0.2 mmHg.L）⁻¹最小值⁻²)vs分流（6.4±1 mmHg·L⁻¹最小值⁻²)Ppao（假手术（7±1 mmHg）vs分流（11±1 mm汞柱），p=0.0004），平均体动脉压（mPsa）无变化。其他地方已部分报道[8]，随着斜率的增加，mPpa/Q关系转移到更高的压力^你好假手术（3.4±0.4 mmHg.L⁻¹最小值⁻²)vs分流（7.2±0.6 mmHg·L⁻¹最小值⁻²)，p=0.0003]（8）。Ees/Ea比值显著下降（假手术组（1.51±0.06）vs分流组（0.68±0.07），p=0.000001）[8]，表明与6个月的半手术猪相比，6个月分流术猪的RV动脉脱钩。心脏指数（Q）（假手术（3.5±0.3 L.min⁻¹.米⁻²)vs分流器（1.9±0.1 L.min⁻¹.米⁻²)，p=0.0002）[8]中风量减少（假手术组（42±5 mL）⁻¹)vs分流（27±5 mL Beat⁻¹)p=0.003），右心房压（Pra）趋于升高（假手术（6.1±0.3 mmHg）vs分流（7.1±0.5 mmHg，p=0.09）。

6个月的主肺分流与Z增加相关₀和Z_C类阻抗(图1).

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图1

肺血流动力学。Zo和Zc。

黑色正方形或柱形：分流、空圆圈和空柱形：假小猪。数值表示为平均值±SEM。P值表示Z0和Zc平均值比较的显著性。

6个月的系统-肺分流后，肺动脉厚度增加，主要是最小的肺动脉（<75µm）(图2).

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图2

Sham和Shunt仔猪最小肺小动脉（<75微米）的形态测量，并用von Gieson orcein方法标记。

每只动物至少测量了50个阻力小动脉。根据公式%MT=[（2×MT）/ED]×100，以血管直径表示中间厚度（MT），其中ED是测量的小动脉外径。75微米以下肺动脉的MT与肺组织相对IL-19 mRNA含量相关。数值表示为平均值±SEM。

肺动脉高压症-血红素氧化酶和细胞粘附分子在肺部的表达

系统性肺分流与肺组织中诱导型HO-1同工酶的基因（p=0.06）和蛋白（p=0.07）表达降低的趋势不明显但很强(图3A和3B)而肺组织HO-2同工酶的基因表达没有改变(图3A). 如所示图3A，介导炎症细胞粘附的细胞表面糖蛋白如ICAM-1和ICAM-2的肺部基因表达增加，而VCAM-1的肺部表达没有改变。

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图3

A组：血红素氧合酶（HO）-1和-2肿瘤坏死因子（TNF）-α、细胞间粘附分子（ICAM）-1和-2、血管细胞粘附分子（VCAM）-1、白细胞介素（IL）-33、白细胞介素1受体样1（ST2）、白细胞因子（IL）-19、信号转导子和转录激活子（STAT）的相对肺组织mRNA含量-6个月龄假仔猪（白色条）和6个月期分流仔猪（黑色条）各3只。

B组：6月龄假仔猪（白条）和6月龄分流仔猪（黑条）血红素氧合酶（HO）-1的相对肺组织蛋白质含量。C组：mPpa/Q关系斜率与血红素氧合酶（HO）-1肺蛋白含量、细胞间黏附分子（ICAM）-1肺mRNA含量、白细胞介素（IL）-33和白细胞介素（IL）-19的相关性。数值表示为平均值±SEM。

右心室衰竭——血红素加氧酶和炎症介质的RV表达

如所示图4系统性肺分流降低了诱导型HO-1同工酶RV相关基因的表达(图4A)，而RV蛋白表达倾向于降低，但不显著（p=0.07）(图4B). 组成型HO-2表达的RV基因表达保持不变(图4A).

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图4

A组：血红素氧合酶（HO）-1和-2、肿瘤坏死因子（TNF）-α、细胞间粘附分子（ICAM）-1和-2、血管细胞粘附分子（VCAM）-1、白细胞介素（IL）-33、白细胞介素1受体样1（ST2）、白细胞因子（IL）的相对右心室组织mRNA含量-19和信号转导子和转录激活子（STAT）-3在6月龄假猪（白条）和6月龄分流猪（黑条）中的表达。

血红素氧合酶（HO）-1在6月龄假猪（白条）和6月龄分流猪（黑条）的相对右心室（RV）组织蛋白含量。血红素氧合酶（HO）-1的Ees/Ea比值与右心室（RV）蛋白含量和细胞间黏附分子（ICAM）-2的右心室（SV）mRNA含量之间的相关性。数值表示为平均值±SEM。

RV衰竭与TNF-α和ICAM-2的RV基因表达增加有关，而ICAM-1、VCAM-1、IL-33、ST2、IL-19和STAT3的RV表达保持不变(图4A).

讨论

本研究结果表明，生长期仔猪在6个月的慢性系统-肺分流过程中，HO-1表达减少和炎症过程的局部激活与肺动脉高压的肺血管和右心室重塑有关。

我们之前报道过生长期仔猪6个月的主动脉-肺脏分流导致的RV衰竭[8]本研究进一步探讨了这些动物的肺血流动力学和相关生物变化。在0Hz（Z）下测量的肺动脉阻抗₀)和特性阻抗（Z_c（c）)增加了，这与之前关于3月龄仔猪的报告一致[21]右心室后负荷和水负荷最好用肺动脉阻抗（PVZ）谱来描述，该谱综合了肺血管阻力（PVR）、弹性和波反射[16]，[21].Z轴增加₀或总PVR，计算为Ppa/Q，可能与远端和阻力小动脉的中层厚度变化有关，而特征阻抗（Z_c（c）)，近端肺动脉树的惯性与顺应性之比[21]可以解释为肺动脉顺应性降低，与近端肺动脉的结构和/或功能改变有关。PVR由多点mPAP流图定义。这种方法优于单点PVR计算，因为mPAP流量的斜率可能小于PVR方程预测的斜率，这是因为补充、扩张或两者兼而有之[22]。

炎症已被证明在人类和实验性肺动脉高压（PH）中发挥作用，并越来越被认为是肺动脉高压（PAH）中肺血管重塑的主要致病成分[23]此外，调节神经体液激活、氧化应激、炎症和凋亡的稳态过程的紊乱也被认为与PH中RV衰竭有关[24]我们最近报道了生长期仔猪长时间系统-肺分流导致RV衰竭[8]犬一过性肺动脉结扎[9]，[10]与细胞凋亡和炎症的激活增加有关，包括促炎细胞因子的过度表达。这进一步证明了炎症似乎在PAH和RV衰竭的发病机制中起着关键作用。

在本研究中，6个月的全身转肺分流后，ICAM-1和ICAM-2的肺部表达增加，而VCAM-1的表达没有改变。内皮细胞通常弱表达的ICAM糖蛋白在损伤后上调，并负责协调炎症细胞的募集和粘附到内皮细胞。这是内皮细胞激活的标志[25]作为炎症细胞迁移到其他血管层的前奏，可能有助于血管重塑。在注射野百合碱的大鼠中观察到肺ICAM-1过度表达[26]-和慢性缺氧暴露[27]–[28]-此外，增加的血流脉动已被证明可诱导炎症基因的内皮表达，包括ICAM-1[29]这表明，长期分流诱导的过度循环可能有助于本实验模型肺部炎症表型的发展。根据目前的结果显示肺ICAM-1表达与PVR密切相关，先天性心脏病和肺动脉高压患者肺动脉高压的严重程度与血清可溶性ICAM-1水平密切相关[2]。

在目前的PAH实验模型中，IL-33在肺部过度表达，而其ST2受体的表达保持不变。最近被描述为IL-1细胞因子家族成员的IL-33是T辅助因子2（Th2）免疫反应的强诱导剂[30]有助于内皮活化的早期事件，促进粘附分子（如ICAM-1和VCAM-1）和促炎性趋化因子（如单核细胞趋化蛋白-1）的内皮表达[31]因此，IL-33可能有助于PAH的内皮激活和随后的肺动脉重塑。正常情况下，坏死细胞会释放一种“警报因子”，提醒免疫系统注意组织损伤或应激，而在没有细胞坏死的情况下，机械应变也能诱导成纤维细胞分泌IL-33[32]IL-33通过与ST2受体结合，也能强烈诱导这些细胞产生Th2细胞因子（如IL-4、-13和-19），并能促进Th2相关疾病的发病机制，如肺动脉重塑[33]。

六个月的系统-肺分流增加了IL-19在肺部的表达，而STAT3的表达没有改变。这可能被视为Th2相关细胞因子的产生。在血管平滑肌细胞中，IL-19快速激活STAT3转录因子并使其移位[34]最近已被指控为患有特发性PAH[35]和实验性野百合碱注射诱导的PH[36]IL-19还诱导强有力的炎症调节剂HO-1的表达，并减少人体血管平滑肌细胞中活性氧的产生[17]IL-19可剂量依赖性地减少血管平滑肌细胞的增殖[15]，[34]，[37]–[38]然而，在内皮细胞中，HO-1诱导增加了细胞周期进展[39]因此，与分流3个月的猪相比，肺IL-19表达增加可能是6个月内肺血管重塑未加重的部分原因[5]，[8]。

在本研究中，我们发现在6个月的系统-肺分流后，肺部HO-1的表达有下降的趋势。HO-1的过度表达已被证明可以防止缺氧诱导的PH的发展，这与减少肺部炎症有关（其特征是巨噬细胞活性和IL-10表达增加[40])和血管重塑[41]–[42].HO-1介导体内野百合碱诱导的PH和在体外雷帕霉素对平滑肌细胞增殖的抑制作用[43]相反，肺HO-1表达在野百合碱和野百合素/肺气切除术诱导的PH中增加[44]。

在这里，我们还发现失败RV中HO-1的基因表达降低。这些结果表明，在目前的晚期PAH实验模型中，肺部HO-1和RV的变化趋势相似，可能是通过不同的HO-1酶产物[45]事实上，胆绿素已被证明可以预防RV功能障碍，但不能减少肺动脉重塑，而吸入CO可以减少肺血管重塑，但对RV没有任何影响（45）。在暴露于慢性缺氧的小鼠中，给予过度表达HO-1的间充质细胞可以减少右心室肥大，稳定梗死区，并将右心室收缩压降至正常值[46]在RV压力过载的实验模型中，RV HO-1表达分别增加和减少[47]和RV故障[48]在终末期先天性心脏病患者中，HO-1的RV水平以不同的幅度增加[49]这表明HO-1的表达似乎取决于应激诱导的心肌细胞损伤和RV衰竭的演变。

在本研究中，HO-1表达的减少与RV中激活的炎症表型有关，通过RV ICAM-2表达的增加进行评估，之前显示RV IL-1α、IL-1β和TNF-α表达增加[8]此外，RV IL-33的表达没有改变。IL-33主要由心脏成纤维细胞产生，以应对机械应变。在左心室，IL-33已被证明通过其可溶性ST2受体阻止心肌细胞肥大[50]在长期暴露于横主动脉收缩引起的压力过载后，转基因ST2缺陷小鼠出现更多心室肥大、腔扩张和纤维化，生存率有限。此外，IL-33的使用减少了对照小鼠的心室肥厚和纤维化，并提高了存活率，但在ST2缺乏小鼠中没有[50]因此，机械激活的IL-33/ST2信号可能与心脏成纤维细胞调节的心脏保护性旁分泌系统有关。在目前的RV衰竭实验模型中，6月龄分流猪和假猪的IL-33和ST2的心肌基因表达保持不变。该观察结果表明，依赖IL-33/ST2信号通路激活的心脏保护机制在衰竭RV中未能激活，可能与RV衰竭的发病机制有关。

总之，本研究表明PAH和RV衰竭与HO-1信号的下调和炎症过程的局部激活有关。

致谢

资金筹措表

这项工作得到了“Recherche科学医学基金会FNRS”（赠款编号3.4637.09）和比利时心脏外科基金会的资助。C.D.得到了伊拉斯谟基金会（比利时）的支持，是FNRS的博士生研究员（比利时）。L.D.获得辉瑞公司的研究资助，是FNRS的博士后研究员（比利时“Chargéde Recherches”）。资助者在研究设计、数据收集和分析、决定出版或编写手稿方面没有任何作用。

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