心血管系统中的一氧化氮：一种具有复杂作用的简单分子

摘要

一氧化氮的发现：一种具有广泛生物效应的简单分子

1987年，一项突破性的发现，一种以前未经确认的分子，相当松散地称为“内皮源性舒张因子”（EDRF），实际上是一氧化氮（NO），导致科学家和临床医生对心血管生理学和病理生理学的理解发生了范式转变。¹在此之前被视为有毒空气污染物的分子可能是内源性产生的，并可能在哺乳动物中作为主要心血管信号分子发挥作用，这一观点即使当时不是耸人听闻的，但确实令人惊讶，并导致1998年诺贝尔医学奖授予相关研究人员。

这一发现也使人们对硝化甘油（现在已知是一种一氧化氮释放化合物）以前未知的作用机制有了更深入的了解，硝化甘油是20世纪初以来临床医生开的一种流行的抗心绞痛药物！如今，NO被认为是心脏和血管生物过程中最重要的介质之一。然而，NO的生物效应是可变的，随着我们对这一神奇分子认识的扩大，这一事实变得越来越明显。

NO是一种简单的双原子气体和自由基，由一种称为NO合成酶（NOS）的酶家族内源性合成。^2,三NOS在全身各种组织中表达，在神经和心血管系统中尤为突出。⁴由于它是一种自由基，NO可以与体内大量分子反应，^5,6,7由于它是一种气体，所以细胞和组织之间可以很容易地通过。⁸这些生化特性不仅使NO成为一种理想的信号分子，而且还导致广泛的（通常是相互矛盾的）生物效应（参见表1以总结NO在心血管系统中的生物效应）。

NO在维持血管内环境稳定中的作用已明确；这一作用与最初的发现有关，即内皮源性NO扩散到下面的血管平滑肌细胞中，经典的NO-cGMP-蛋白激酶G（PKG）信号通路导致血管舒张（图1）一般来说，NO促进血管系统中的血管扩张、抗血栓形成和抗炎状态；然而，当NO的生物利用度受到损害时，这些有益的作用就会丧失，内皮功能障碍也随之发生。⁹

图1。

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经典的NO信号通路。血管内腔中的内皮细胞表达内皮一氧化氮合酶（eNOS），产生生理浓度的一氧化氮。NO扩散到下面的血管平滑肌细胞（VSMC）中，sGCcGM P-PKG通路被激活，L型钙通道受到最终抑制，导致VSMC松弛和血管扩张。sGC：可溶性鸟苷酸环化酶，GT P：三磷酸鸟苷，cGM P：一磷酸环鸟苷，PKG：蛋白激酶G。

心中没有

在内心深处，NO的作用似乎没有那么明确¹⁰令许多研究人员失望的是，在生理和病理生理环境（例如低氧供应：缺氧/缺血）中，经常出现相互矛盾的实验观察结果。^三,11尽管这些矛盾的发现中有许多可以用技术因素来解释，例如实验模型和方案的差异，但在理解NO的行为时应该考虑几个生理因素。这些因素将在下文中进行讨论。

NO的酶源

NO、NOS的主要细胞来源是一个由三种已知亚型组成的家族，即神经元NOS（nNOS，NOS-1）、诱导型NOS（iNOS，NOS-2）和内皮型NOS。⁴这三种亚型都在心脏中表达。⁴eNOS和nNOS都是组成性表达的低输出酶，尤其是eNOS与维持基础生理性心脏功能有关。¹²第三种亚型iNOS的表达依赖于TNF-α等细胞因子或其他病理生理刺激物的诱导。⁴iNOS是一种高输出的酶，产生的NO比eNOS多1000倍。²iNOS衍生NO可导致有害影响，而不是由于NO的直接作用就其本身而言而是在这样的环境中可以与超氧自由基（O）反应的大量NO₂-)导致形成高活性（和有害）自由基过氧亚硝酸盐（ONOO-），以及下游的衍生物，如硝基和羟基。¹³

收缩功能也受NO含量的影响；在低（亚摩尔）剂量下，似乎有较小的正性肌力效应，而高（微摩尔或以上）剂量则有负性肌力作用。^14,15因此，NO在心脏中的生物效应可能会因NOS亚型被激活和NO释放量的不同而有很大差异。这进一步被不同心脏细胞类型中NOS亚型的差异表达所混淆：eNOS在心内膜和心脏微血管内皮细胞中表达最高，¹⁶而iNOS在心肌细胞中的表达相对较高。^三

一氧化氮合酶的亚细胞定位

β-肾上腺素能刺激eNOS-/-基因敲除小鼠的心脏具有正性肌力作用，而在nNOS-//基因敲除鼠的心脏中观察到负性肌力效应。¹⁷NO的这些明显矛盾作用的潜在机制被认为与NOS这两种亚型的亚细胞定位有关。⁸因此，特定NOS亚型在心肌细胞不同位置的空间限制对NO对收缩功能的影响具有重要意义（图2）.

图2。

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一氧化氮合酶的亚细胞定位决定了一氧化氮的作用。在心肌细胞中，eNOS与小窝和L型钙通道相关，导致eNOS衍生的NO抑制通道和肌肉松弛。另一方面，nNOS与肌浆网（SR）和ryanodine受体（RyR）相关，导致SR和肌肉收缩的钙释放增加。

在心肌细胞中，eNOS与小窝密切相关（细胞膜的烧瓶状内陷区域）。Caveolae是高信号活性的专门中心，与β肾上腺素能受体和L型钙相关²⁺频道。eNOS、β受体和Ca的共同定位²⁺通道允许eNOS生成的NO位于其分子靶的扩散距离内。¹⁷这种相互作用的最终结果是负性肌力作用，因为NO阻止Ca的开放²⁺从而抑制β-肾上腺素诱导的肌力作用。相反，nNOS定位于肌浆网（SR）和赖氨酸受体（RyR）；因此nNOS产生的NO可以很容易地激活RyR释放Ca²⁺并引起正性肌力效应，从而介导对心肌收缩功能的影响，这与eNOS观察到的结果正好相反。¹⁷

随着我们知识的增长，eNOS和nNOS的空间限制假说不断地被修改。在最近的一篇评论文章中，¹⁰据推测，nNOS与黄嘌呤氧化酶（XO）、₂-生成酶，导致nNOS衍生NO与O结合的可能性₂-形成过氧亚硝酸盐（ONOO-），后者对RyR、磷蛋白甚至L型钙通道有直接调节作用。相反，eNOS与超氧化物歧化酶（SOD）、O₂-清除剂，可能导致ONOO生成反应的负调控。

NOS底物和辅因子可用性

NOS是严格控制的酶，尤其是在NO合成水平上，因为NO是一种容易扩散的气体，因此不能储存在囊泡中。⁸因此，NOS是具有许多调节辅因子和相关蛋白的复合酶。当底物（l-精氨酸）或辅助因子（如四氢生物蝶呤）的供应有限或不存在时，NO的产生与NADPH的氧化脱钩，^9,18酶产生O₂-当观察到eNOS表达增加而没有伴随NO生成增加的证据时，这可以解释受到氧化应激（eNOS解偶联的一个重要原因）的细胞中的矛盾现象。⁹在血管系统中，eNOS解偶联被认为是内皮功能障碍发生的重要机制。⁹

氧化还原状态/抗氧化能力

活性氧（ROS）的生成，如O₂-被认为是一个正常的生理过程，只要有足够的抗氧化机制。当细胞清除活性氧的特性受到损害时，如超氧化物歧化酶（SOD）活性降低或表达降低，未受影响的O₂-将与NO（对其具有高亲和力）反应，形成ONOO-，一种高度反应性的细胞毒性自由基，与通常与NO相关的作用相反。¹³如前所述，当iNOS产生大量NO时，也会出现类似的情况。

NO的非酶源

在评估NO对心脏的影响时，应记住，NOS诱导的依赖性细胞反应能够生成NO。当细胞酸中毒发生时，例如在缺血期间，XO可以很容易地减少亚硝酸盐（NO代谢的分解产物），以再次形成NO，从而成为生物活性NO的重要来源。^19,20,21因此，尽管NOS下调或失活，但仍有可能产生NO并观察到其作用。

从上面可以清楚地看出，有许多潜在的机制和生理因素（参见图3总之）影响NO的生物作用。由此产生的效应的复杂性和可变性以及它们在解释研究结果时经常造成的困难，使得进一步研究这一重要心血管信号分子的细胞机制势在必行。

图3。

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NO的可变生物效应：可能的机制。

NO与心脏缺氧/缺血

NO在低氧条件下心肌中的作用已成为心血管基础研究中一个迅速发展的领域。²²从文献来看，大多数证据表明NO对心肌缺血的损伤作用具有保护/有益作用，这应该是临床医生不断寻求新的心脏保护疗法的兴趣所在。事实上，Jones和Bolli是研究NO在缺血预适应诱导的心脏保护中作用的先驱，他们在2006年的一篇综述中大胆地发表了以下声明：“。。。NO对缺血心肌是有益还是有害已不再是一个问题，（这一迷你视图的）基本前提是不需要的：NO保护心脏免受缺血再灌注损伤。”²³

然而，事实上，许多作者确实观察到了缺血/低氧诱导NO生成相关的有害影响。尽管琼斯和博利表达了这样的观点，但人们不能忽视相反的证据，即使表明有害影响的结果是少数。NO生物作用的明显矛盾性质的可能原因（前面讨论过，总结于图3)在病理生理环境（即心肌缺氧/缺血）中与生理情况一样相关。因此，在解释矛盾或意外的发现时，应始终牢记这些机制。

缺氧和缺血导致NO生成增加

评估任何分子在病理生理环境中的作用的第一步是确定该特定分子的浓度是增加还是减少。在这方面，NO由于其自由基和气态性质以及相对较短的半衰期，是一种特别难以研究的分子。很少有敏感、特异、可靠和经济的检测技术能够直接定量测量NO水平。²⁴因此，许多关于心脏缺氧/缺血中NO的研究必须依赖间接技术，如NOS活性测定（与NO共同产生的瓜氨酸水平测定）、硝酸盐+亚硝酸盐水平（NO代谢的分解产物）和cGMP水平（NO-sGC-通路中的第二信使）。

尽管存在技术挑战，但绝大多数证据表明NO水平增加，至少在缺氧和缺血早期（无再灌注）。^三,25-27我们自己的研究还表明，缺氧条件下心脏细胞模型（即分离的成年大鼠心室肌细胞）中NO生成增加^24,28和心脏微血管内皮细胞，^28,29使用检测细胞内NO（二氨基荧光素，DAF-2/DA）的特定荧光探针，以及通过测量组织亚硝酸盐浓度的成年大鼠心脏模型（图4A）.

图4。

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在灌注的整个心脏中测量NO和eNOS。（A） 对照组、15分钟整体缺血和20分钟整体缺血心脏的组织亚硝酸盐浓度（对照组的%）。n个= 3; *第页与对照组相比<0.05。（B） 对照组、15分钟整体缺血和20分钟整体缺血心脏的活化eNOS（丝氨酸1177磷酸化eNOS）水平（对照组的%）。n个= 3; *第页与对照组相比<0.05；^#第页<0.05 vs缺血15分钟（C）对照组、全缺血15分钟和全缺血20分钟心脏的总eNOS蛋白表达（占对照组的%）。n个= 3;第页> 0.05.

有人认为NO生成的增加取决于缺血损伤的持续时间或严重程度，并且随着缺血持续时间的增加，NO水平再次下降。^三这些观察结果可能归因于缺血诱导的细胞酸中毒加重导致NOS功能障碍/降解。³⁰然而，在我们的心肌细胞模型中，我们观察到在1²⁹缺氧2小时（尽管后者eNOS表达缺失；参见图5A、C)使用相对有效的低氧方案（缺血造粒：将细胞离心成颗粒，并用矿物油封住剩余的薄层上清液）。这种现象可能是由于eNOS依赖于NO的生成（例如iNOS或亚硝酸盐减少）。

图5。

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暴露于120分钟缺氧条件下的分离心肌细胞中NO和eNOS的测量。（A） 对照组和缺氧心肌细胞中DA F-2/DA荧光的平均值（对照组的%）。n个= 8; *第页与对照组相比<0.05。（B） 对照组和缺氧心肌细胞中激活的eNOS（丝氨酸1177磷酸化eNOS）水平（对照组的%）。n个= 4;第页> 0.05. （C） 对照组和缺氧心肌细胞中eNOS蛋白的总表达（对照组的%）。n个= 5; *第页与对照组相比<0.05。

NOS亚型参与缺氧和缺血：iNOS和nNOS

有足够的数据表明，缺氧和缺血期间观察到的NO生成增加至少部分是由于NOS活性增加，^三由于三种主要亚型都在心脏组织中表达，iNOS、nNOS或eNOS可能单独或联合导致NO水平升高。然而，很少有研究描述和/或直接测量与心脏缺氧和缺血有关的NOS亚型。^三

许多研究表明iNOS参与其中。“延迟缺血预适应（IP）的NO假说”³¹提出缺血诱导iNOS表达的关键（心脏保护）作用。³²延迟性缺血再灌注是一种由短暂缺血再灌注发作组成的初始刺激可以防止随后持续缺血（三到四天后诱导）的现象。根据所提出的机制，初始缺血再灌注方案触发了几个因子和信号通路的释放和激活，这些因子和信号途径最终在持续缺血期间诱导iNOS表达，导致NO生成。其他人也通过观察iNOS mRNA和蛋白表达的增加，显示iNOS参与缺氧和缺血（在非修复环境中）。^33-35在大鼠心肌细胞中，缺氧通过HIF-1（缺氧诱导因子-1）介导的iNOS基因激活机制诱导iNOS表达。³⁶

我们实验室的数据也表明iNOS可能是缺氧心肌细胞NO水平升高的来源之一，但在心脏微血管内皮细胞中没有。^28,29在另一项关于eNOS-/-敲除小鼠心脏的研究中，缺血再灌注期间iNOS的诱导显著增加（可能是一种补偿机制），随后NO水平的升高与心脏保护有关。³⁷近年来，nNOS在缺氧和缺血中的作用也引起了人们的关注，因为人们发现nNOS也在心肌细胞中表达，而不仅仅在供应心脏的神经末梢中表达。³⁸一些研究表明，缺血期间nNOS mRNA和蛋白表达增加，^34,39而其他人则观察到表达减少。⁴⁰

从文献中可以清楚地看出，需要进行更多的研究来阐明nNOS的独特作用，尤其是在心脏缺氧和缺血中的作用。第三种亚型eNOS的作用将在下一节中单独讨论。

一氧化氮合酶亚型参与缺氧和缺血：eNOS

尽管eNOS是心脏中最丰富、分布最广的NOS亚型¹⁶生理环境中NO的主要来源，²eNOS在心脏中的调节和激活，特别是在缺氧和缺血时，仍相对缺乏研究。^15,36大多数研究在低氧条件下调查eNOS的这些方面，通常报告eNOS蛋白的保留或表达增加，或激活增加。缺血心肌细胞保持eNOS蛋白表达的正常毒性控制⁴¹和孤立的心，³⁴而冠状动脉内皮细胞表达增加^42,43和孤立的心。^44,45一些研究还调查了缺血对激活的eNOS水平的影响。在心脏内皮细胞中观察到缺血诱导的激活eNOS水平升高，^43,46心肌细胞⁴⁶和孤立的心。⁴⁶

因此，总的来说，eNOS似乎是心脏缺氧/缺血诱导NO生成的重要来源，尽管它与基础生理环境中的NO供应有传统联系。我们最近提供了进一步的证据，证明缺氧/缺血与隔离的全心模型中NO生成增加和激活eNOS水平升高密切相关（15分钟整体缺血；图4A、B)以及在分离的心肌细胞和心脏微血管内皮细胞（CMEC）中。²⁹在这些研究中，丝氨酸1177残基磷酸化eNOS的测量被用作eNOS活化的指示物，因为该位点的磷酸化已被证明是酶的主要激活机制。^11,47

为了建立缺氧与eNOS激活之间的联系，我们研究了磷脂酰肌醇-3激酶（PI-3K）-蛋白激酶B（PKB/Akt）途径作为假定介质的作用。²⁹众所周知，活化的PKB/Akt是负责eNOS ser1177磷酸化的最显著的激酶⁴⁷先前对猪冠状动脉内皮细胞的研究表明，缺氧通过PKB/Akt激活eNOS。⁴³

我们的数据表明，PKB/Akt被缺氧激活（丝氨酸473残基磷酸化），PI-3 K–PKB/Akt活性的抑制导致心肌细胞和CMEC在缺氧期间NO生成减少。²⁹随后，在PI-3 K–PKB/Akt通路被抑制后，心肌细胞中显示激活eNOS恢复到控制水平。总之，上述数据是首批研究之一的结果，其中有证据表明激活的心脏eNOS（磷酸化eNOS ser1177）水平在整个心脏、心肌细胞和CMEC的心脏缺氧和缺血中增加，活化的PKB/Akt是缺氧激活eNOS生成NO的重要机制环节（图6）.

图6。

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提出了缺血和缺氧时NO生成增加的机制。低氧供应条件激活磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B（PI3-K/PKB）途径，该途径磷酸化（并激活）eNOS，导致NO生成增加。缺氧诱导因子-1（HIF-1）也可以在随后诱导iNOS时被激活。缺氧和缺血对nNOS的影响尚不清楚。或者与上述情况相结合，在细胞性酸中毒期间，NOS依赖性地减少亚硝酸盐生成NO。XO：黄嘌呤氧化酶，NO₂：亚硝酸盐，ONOO^-：过氧亚硝酸盐。

在一项对离体灌注大鼠心脏的研究中进行了一项有趣的观察，结果表明，缺血30分钟后，eNOS蛋白表达略高于对照水平（尽管不显著），但当缺血时间延长到60和90分钟时，eNOS蛋白表达显著降低。³⁰从这些结果可以得出结论，长期缺血降低了这些心脏中eNOS的表达，可能是由于降解后的酶损失或膜完整性的损失。

在我们的实验室中，在遭受全缺血（GI）的离体灌注大鼠心脏中测量了总eNOS蛋白和激活的eNOS水平。结果表明，活化的eNOS水平（丝氨酸1177处的磷酸化eNOS）在15分钟时显著升高，然后在20分钟GI时降至低于对照水平（图4B）尽管胃肠道15分钟和20分钟后蛋白表达不变（图4C）我们实验室对分离的心肌细胞的研究显示出类似的趋势：当缺氧60分钟时，eNOS表达保持不变，激活的eNOS水平显著增加。²⁹然而，当缺氧持续时间增加到120分钟时，我们观察到eNOS蛋白的显著损失（图5C）与未改变的激活eNOS相关（图5B）.

因此，从上述研究来看，心脏eNOS似乎易受缺血持续时间或严重程度的影响，表现为蛋白质水平降低或活性酶水平降低。有趣的是，我们的结果表明，整个心脏中的NO水平都持续升高（图4A）和心肌细胞模型（图5A）尽管缺血/缺氧持续时间延长，eNOS产生NO的能力也随之受到负面影响。这些观察结果强调了eNOS依赖性NO生成源（如iNOS和/或nNOS）的作用的重要性，以及研究亚硝酸盐还原生成NO的研究数据的相关性日益增强（图6）.²¹

随着转基因动物模型的出现（即基因敲除、基因过度表达或基因沉默），可以更具体地研究NOS亚型的不同作用。一些研究通过基因修饰研究了eNOS在缺血和缺氧中的作用。^三关于eNOS的研究^-/-敲除小鼠心脏后，与缺血再灌注损伤相关的收缩功能障碍更加明显，^48,49而在eNOS过度表达的小鼠心脏中，观察到收缩功能改善，⁵⁰指出eNOS的保护作用。

eNOS-/-基因敲除小鼠心脏暴露于缺血后，可观察到更大的心肌损伤（通过测定梗死面积测量），^51-53而其他数据表明梗死面积缩小。⁵³有趣的是，在一项对eNOS-/-小鼠离体灌流心脏的研究中，发现缺血与一氧化氮生成增加有关，这似乎是iNOS亚型的代偿性超诱导。与野生型心脏相比，这些心脏的心肌损伤明显减轻，³⁷指出iNOS衍生NO在这种情况下的心脏保护作用。

缺氧/缺血诱导的NO生成：主要是保护性的，但有一些有害影响的证据

如前所述，大多数作者似乎同意，缺氧和缺血时观察到的NO生成增加具有保护作用。缺氧/缺血期间产生的NO的心脏保护特性在缺血预适应（IP）的背景下得到了很好的证明。³²在预处理心脏中，研究表明内源性NO可以引发保护，特别是在延迟形式的IP保护中。IP观察到的保护具有双峰模式：在实验干预的几分钟或几小时内观察到早期保护波（早期IP），在三到四天后观察到第二波延迟且临床上更相关的保护波（延迟IP）。⁵⁴

此外，大量的研究也引起了临床极大的兴趣，这些研究清楚地证明了内源性或外源性NO在单纯缺血再灌注损伤的心脏中的心脏保护作用，而这两种损伤都没有任何预先的预处理干预体内和在体外模型。²²2001年发表的一份综合性综述对92项先前的研究进行了分析，其中73%的研究发现NO对缺血再灌注损伤具有保护作用。²²

据信，NO通过几种拟议的细胞机制引发保护作用。其中包括增加cGMP合成（“经典”NO信号通路），¹³假定的抗氧化性能，⁵⁵线粒体K_{列车自动防护系统}通道激活，⁵⁶抑制线粒体通透性转换孔（MPTP）的开放，^三抑制线粒体氧化，¹³在这方面，cGMP/PKG通路的作用越来越被认为是缺血再灌注损伤模型中IP、缺血后处理、外源性NO供体、他汀类药物等的梗死缓解作用的机制。⁵⁷PKG被描述为一种“生存激酶”，可以通过调节Ca来诱导保护作用²⁺体内平衡（SR-Ca的修饰²⁺摄取）和激活K_{列车自动防护系统}通道打开。⁵⁷观察到的保护性生物效应如下：

• ● 心脏循环：血管扩张增加（从而改善冠状动脉灌注），血小板聚集减少，抗炎状态增加，内皮功能障碍减少
• ● 心肌细胞：凋亡减少，耗氧量减少
• ● 心肌：缺血耐受性增加，收缩功能和舒张功能改善，梗死面积缩小，顿抑减少，心律失常减少。

然而，也有研究使用了各种不同的模型和协议，这些模型和协议既不能证明保护58，也不能观察到有害影响。^35,59,60我们实验室对分离的心肌细胞模型的研究结果表明，在两小时缺氧过程中释放的NO具有有害作用。⁶¹人们普遍认为，有害影响往往不是由NO本身造成的，而是更多反应性代谢副产物（ONOO-、NO₂^•和OH^•)当产生大量NO时形成（例如由于iNOS的病理生理诱导）。¹³

长时间产生ONOO-会引起亚硝化应激，这是一个用来统称ONOO细胞毒性作用的术语^-通过细胞成分的氧化（通常是破坏），导致信号通路功能失调、细胞凋亡和坏死。⁶²NO或ONOO的能力^-因此，直接与靶蛋白结合（亚硝化、硝化），从而改变蛋白质功能（如硝基酪氨酸的形成），是一种可能导致有害影响的机制。^63,64NO在病理生理环境中（直接或间接）产生的有害生物效应包括：多聚腺苷二磷酸核糖合成酶（PARP）激活、基质金属蛋白酶（MMP）激活、DNA链断裂、硫醇氧化、细胞凋亡增加、坏死增加、，β肾上腺素能反应性降低（表现为收缩功能障碍）。^三,13

如前所述，NO的有益与有害作用在很大程度上取决于特定的NOS亚型参与。一般经验法则是eNOS衍生NO在缺血和缺氧时发挥保护作用。似乎有令人信服的证据表明iNOS与保护作用有关，尤其是在延迟IP的情况下；然而，众所周知，iNOS也通过形成ONOO参与有害作用^-.¹³关于nNOS的作用，迄今为止还没有多少研究得出任何结论。

结论

NO作为心脏和血管中的主要信号分子，其作用非常重要，不仅与基础医学领域相关，而且与临床心脏病学相关。大多数专家同意，NO大体上是一种有效的心脏保护剂。因此，NO各种生物作用的代谢和细胞机制应继续受到应有的研究关注，因为这种分子在缺血性心脏病的预防和治疗中具有巨大的潜力。

致谢

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