癌症研究。作者手稿；PMC 2013年7月23日发布。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：项目经理3719863
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院160562
β1整合素抑制显著提高人乳腺癌异种移植的放射治疗效果
,1 ,2 ,1 ,三和2
Chong J.公园
三加州圣地亚哥圣地亚哥州立大学
1加利福尼亚大学旧金山分校
2加州旧金山劳伦斯伯克利国家实验室
三加州圣地亚哥圣地亚哥州立大学
要求重印：加利福尼亚大学旧金山综合癌症中心放射肿瘤学系Catherine Park，加利福尼亚州旧金山Divisadero街H1031 1600号，邮编94143-1708。电话：415-353-7175；传真：415-353-9883；ude.fscu@kraP.enirehtaC - 补充资料
补充图1。
GUID:851FED25-D941-4390-B95B-C9C4D8E3E0B2
补充图2。
GUID:FEA0E0D3-A173-4464-8A78-D72471F2A05B
补充图3。
GUID:B2DB01F6-EC9F-4627-A11D-F212D12233E8
摘要
β1整合素信号已被证明在电离辐射（IR）照射后介导细胞对凋亡的抵抗。其他增加抵抗力的信号分子包括Akt，它促进β下游的细胞存活1整合素信号转导。我们之前展示了β1整合素抑制抗体（例如AIIB2）在富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）三维培养基中增强人乳腺癌细胞的凋亡并降低其生长体内在这里，我们询问了AIIB2是否可以与IR协同作用来修饰Akt介导的IR抗性。我们使用三维lrECM培养物来测试AIIB2与IR治疗两种乳腺癌细胞系MCF-7和HMT3522-T4-2以及T4-2 myr-Akt乳腺癌集落或HMT3522-S-1的最佳组合，这两种细胞在三维lrEC中形成正常的器官型结构。检测菌落的凋亡和β1用Western blot评价整合素/Akt信号通路。此外，使用携带MCF-7异种移植物的小鼠验证三维lrECM中的发现。我们报道AIIB2通过下调三维lrECM中乳腺癌集落的Akt，在IR后最佳地增加了细胞凋亡。体内与单独治疗相比，IR后添加AIIB2显著增强了肿瘤生长抑制和凋亡。值得注意的是，AIIB2加2Gy辐射对肿瘤生长的抑制程度与单独8Gy辐射相似。我们之前表明，AIIB2对小鼠没有明显毒性；在这里，它的加入使IR剂量显著降低，这是在乳腺癌异种移植物中实现类似生长抑制和凋亡所必需的体内.
介绍
放射治疗是治疗乳腺癌的有效方法；然而，肿瘤耐药和复发仍然是重要的临床问题(1). 越来越多的证据表明，除了DNA损伤外，细胞与邻近细胞的相互作用和微环境等多种细胞机制从根本上影响了细胞对电离辐射的响应命运（IR；参考2）。事实上，对单个细胞单剂量的IR可以改变细胞间和细胞外基质（ECM）的相互作用，并赋予可遗传的表观遗传学特征(三).
人们早就知道，粘附ECM可以改变包括癌症在内的几种细胞的辐射敏感性。整合素是一类主要的跨膜分子，介导粘附和细胞与ECM的相互作用，在许多类型的癌细胞中异常表达，并且在IR后上调(4,5). 尤其是β1已发现癌症细胞系中的整合素被临床相关剂量的IR上调(4)以及在富含层粘连蛋白的细胞外基质（lrECM）三维培养物中的人类乳腺上皮细胞中(三,5). β1整合素参与了对IR的耐药性介导(6–10). 然而，β的作用1整合素作为与IR结合的战略分子靶点尚未得到充分研究。
β1整合素属于异二聚体受体家族，其配体为精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸-包含ECM分子(11). 主要作为机械感受器，β1整合素传递促进下游多种细胞命运的生化信号，包括凋亡和存活(12). β增加1整合素似乎通过提高生存率和增强几种肿瘤细胞对化疗的耐药性来增强癌细胞的生存能力(10,13,14). 此外，我们之前已经表明，在早期乳腺癌患者中，高β1整合素表达与整体生存率低相关，表明该亚组患者可能受益于更积极的靶向治疗(15).
先前研究表明，癌细胞对IR的耐药性是通过Akt介导的，Akt是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，位于磷酰-肌醇-3激酶（PI3K）和整合素信号通路的下游(16,17). β1整合素已被证明通过PI3K途径在肺癌中提高癌细胞存活率(10)正常成纤维细胞(18)在文化方面。我们之前已经证明了β1整合素抑制抗体选择性诱导乳腺癌细胞凋亡，但在三维lrECM培养中不诱导非恶性腺泡凋亡；这些发现得到了验证体内对动物无毒(19)，表示β1整合素是一种很有前途的治疗靶点。在本报告中，我们使用了三维lrECM分析和体内乳腺癌模型检验β1整合素可能通过促进Akt介导的生存来促进IR诱导的耐药性。
材料和方法
细胞培养
非恶性人类乳腺上皮细胞HMT-3522（S-1）最初来自一名患有纤维囊性乳腺疾病的女性(20)、和在H14培养基中培养(21). S-1细胞在含有10 ng/mL表皮生长因子（EGF）的培养基中在塑料上增殖。同样来源于同一亲本系的恶性HMT-3522（T4-2）细胞在没有EGF的情况下在I型胶原涂层烧瓶上繁殖(21). T4-2野生型细胞稳定转染了组成活性肉豆蔻酰化Akt（T4-2 myr-Akt）或空载体对照（T4-2vc），这是Hong Liu（加州大学旧金山分校（UCSF））赠送的礼物。人类乳腺癌细胞系MCF-7是从美国类型培养收集中获得的。三维lrECM培养物由单层培养物中的胰酶化细胞组成，并将其涂敷在由Englebreth-Holm-Swarm肿瘤（Matrigel；BD Sciences）生产的商用凝胶上。如前所述，细胞系保存在H 14培养基中(19)并转入改良的三维lrECM分析(19). 这被称为第0天。非恶性S1细胞在腺泡形成后第6天培养物暴露于IR和/或AIIB2，恶性细胞系在培养后第4天和第5天培养。每隔一天将AIIB2添加到培养基中。第一次治疗72小时后对所有培养物进行分析。
AIIB2公司
β1整合素功能块抗体克隆AIIB2最初是从卡罗琳·达姆斯基（UCSF）那里购买的礼物。AIIB2是一种大鼠单克隆IgG1，从人绒毛膜癌杂交瘤中分离出来，特异性结合β1整合素胞外区(22–24). 使用F（ab′）的先前实验2酶消化的AIIB2片段表明抗体的表位结合部分是活性的，导致β1整合素介导的信号传导(21,25).
三维lrECM细胞凋亡和增殖检测
用Ki-67核抗原间接免疫荧光法检测三维lrECM培养物中的增殖细胞。使用甲醇/丙酮将从培养物中提取的样品固定在玻璃载玻片上，并在室温下在加湿室中用10%的山羊血清封闭1小时。然后将载玻片在抗Ki-67的原代兔抗体克隆MIB-1（Novocastra Laboratories）中孵育1小时。在PBS中洗涤后，在黑暗的加湿室中应用FITC-结合的抗兔二级抗体（The Jackson Laboratory）1小时。然后用4′，6-二氨基-2-苯基吲哚（DAPI）对载玻片进行清洗和复染，然后用Vectashield安装介质（Vector Laboratories）进行安装。使用商用试剂盒（荧光素原位细胞死亡检测试剂盒；罗氏试剂盒），通过检测三维lrECM细胞培养样本中的末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）来检测细胞凋亡。将来自培养物的样品固定在4%多聚甲醛中的玻璃载玻片上，并在0.1%柠檬酸钠中的0.1%Triton X-100中渗透。清洗后，将细胞在37°C的TUNEL反应混合物中培养60分钟并安装。
荧光激活细胞分选分析
使用0.25%胰蛋白酶采集生长在组织培养塑料上的S-1和T4-2细胞。在含有胰蛋白酶抑制剂的DMEM/F-12培养基中重新培养细胞后，将细胞离心下来，并在5%胎牛血清和0.1%冰上PBS中的叠氮化钠中清洗。首先将细胞在稀释的初级Annexin V抗体（Trevigen）中孵育30至60分钟，在4°C下孵育，然后清洗并用荧光素结合的IgG二级抗体（1:100）孵育30-60分钟。清洗后，立即将颗粒悬浮在1%多聚甲醛中。使用Beckman-Coulter EPICS XLMCL分析仪分析细胞。系统II数据采集和显示软件2.0版用于数据分析。
菌落形成测定
如前所述，在二维培养基上培养T4-2和S-1细胞(21). 在达到50%至70%的汇合后，将培养瓶暴露于IR（Sham，2，4或8Gy）。六个小时后，将它们进行胰蛋白酶消化，并重新种植到每孔35毫米的培养皿上，让它们生长10至12天。用结晶紫处理盘子，并计数>50个细胞的菌落。针对每种情况电镀六个孔n个=3个实验。基于二项式概率分布估计电镀效率和存活率。
西方免疫印迹
为了从三维lrECM中释放细胞，首先用冰镇PBS/EDTA[0.01 mol/L磷酸钠（pH7.2）处理培养物，其中含有138 mmol/L氯化钠和5mmol/L EDTA]，然后在放射免疫沉淀分析缓冲液中溶解，如前所述(21). 以等量将蛋白质添加到还原SDS凝胶上，并使用低压电流分离蛋白质。将蛋白质带转移到硝化纤维素膜（Invitrogen）上，并用5%脱脂奶封闭斑点。用下面列出的抗体检测斑点，然后清洗，用二级抗体孵育，并暴露于X射线胶片。使用的抗体包括β1整合素，克隆18（癌基因）；FAK，克隆77（BD转导实验室）；phospho-FAK，克隆14（BD转导实验室）；AKT，克隆7（BD转导实验室）；细胞信号转导；磷酸-β1整合素（生物源）；TSC-2克隆c-20（加州圣克鲁斯圣克鲁斯生物技术公司）；磷酸化-Thr 1462-TSC-2（细胞信号）；β肌动蛋白：克隆AC-15（Sigma）；二次增强化学发光（ECL）抗兔IgG/ECL，抗鼠IgG（Amersham）。
肿瘤生长和毒性评估体内
母BALB/c nu−/−从Simonsen实验室获得同源小鼠，并将其保存在受控动物屏障中，每个笼子5只，根据需要加水和食物。1周后，给动物皮下注射107MCF-7细胞进入后侧翼。对于携带MCF-7异种移植物的动物，在尾巴上方皮下注射雌二醇丸。从细胞植入后第7天到第8天，在IR暴露前后，每两周向腹腔注射一次AIIB2抗体或非特异性大鼠IgG。照射前，将动物限制在有机玻璃容器中，并使用1.0cm厚的金属陶瓷对上部半兽人进行防护。使用250 kVP的放射源将IR传送到暴露的肿瘤和后半侧。每两周记录一次肿瘤尺寸（宽度、高度和深度）。在献祭时，对动物实施安乐死，采集肿瘤并立即冷冻或用福尔马林固定。通过测量体重、评估整体活动和进行尸检来监测动物的毒性。所有实验程序都是在劳伦斯伯克利国家实验动物福利和安全委员会批准之前收到的。
Ki67和TUNEL的检测和定量体内肿瘤切片
我们开发了检测Ki-67和TUNEL双重免疫荧光的方法（改编自Schafer及其同事；参考文献。26)石蜡包埋组织中，可同时评估增殖和凋亡模式就地每个肿瘤的五个微米切片在60°C的烘箱中烘烤30分钟，在二甲苯中脱蜡，并通过分级醇进行再水化。抗原回收是通过将载玻片在10 mmol/L柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中在95至97°C下加热45分钟来完成的。在室温下冷却30分钟后，清洗切片，然后在10%的山羊血清/PBS中封闭1小时。将Ki67（载体）的一级抗体稀释在10%的羊血清/PBS内，涂在玻片上，并在4°C下培养过夜。将载玻片清洗并与Alexa Fluor 594–共轭山羊抗兔IgG（分子探针）孵育，并在室温下在10%山羊血清/PBS中稀释40分钟。随后冲洗幻灯片并用DAPI标记。阴性对照组保留一级抗体。
验证染色后，取下盖玻片，并用PBS彻底清洗切片。所有样品都渗透在新制备的0.1%Triton X-100中，0.1%柠檬酸钠溶液中2在室温下保持10分钟。然后将载玻片在3%牛血清白蛋白、20%胎牛血清、0.1 mol/L Tris-HCl（pH 7.5）中封闭1 h，并用PBS清洗。为了检测细胞凋亡，我们使用荧光素（Roche）原位细胞死亡检测试剂盒。将标记物和酶溶液的TUNEL反应混合物在每个载玻片上在37°C的黑暗培养箱中培养1小时。阴性对照只与标签溶液孵育。在PBS中清洗后，载玻片再次贴上DAPI标签，并用Vectashield固定。淋巴结组织被用作Ki67和TUNEL染色的阳性对照。
染色后，在蔡司Axioplan 2成像显微镜和AxioCam相机上获得荧光图像。使用×40油物镜和×10目镜（总放大倍数为×400），每个肿瘤将获得五张代表性图像。所有最终图像由三种不同曝光组成：DAPI（细胞核）、FITC（TUNEL）和Cy3（Ki67）。
MetaMorph软件用于量化每个图像合成中阳性细胞核的数量与总细胞核的数量。对于每一张图像，DAPI“掩模”是通过计算DAPI曝光中的所有细胞核来创建的，这些细胞核符合既定的尺寸排除变量。以掩模为模板，根据眼睛预先确定的信号强度阈值，将罗丹明中Ki67阳性细胞核信号重叠的细胞分为阳性或阴性。这种自动计数系统的优点是提高了准确性，减少了观察者的主观性。潜在的局限性是设置了信号强度阈值，没有包括那些染色阳性但较暗的细胞核。该误差是系统性的，与人工计数引入的其他偏差相比，误差仍然很小。为了最大限度地减少这种潜在误差，对使用相同试剂同时染色的多批载玻片，使用阴性和阳性对照设置信号强度。因此，每个批次都是独立处理的。人工验证TUNEL阳性细胞核可以解释凋亡细胞形态的变化，包括染色体凝聚、起泡和细胞收缩。
共焦显微镜
使用配备外部氩/氪激光的蔡司LSM 410倒置激光扫描共聚焦显微镜，从三维lrECM培养物和乳腺癌异种移植物的薄片上获取免疫荧光图像。使用蔡司荧光X 40（1.3数值孔径）物镜，在集落中段拍摄图像，用于三维lrECM培养和乳腺癌异种移植。通过仅比较在相同条件下同时处理的载玻片，对图像的相对免疫荧光强度进行标准化。
统计分析
对于三维lrECM中的Ki-67和TUNEL计数，每种培养条件（例如，每种剂量的AIIB2或IgG以及两种序列中的每种剂量IR）以成对方式进行比较，χ2统计各组间的显著差异。A类P（P）值<0.05被认为是一种关联，95%的概率不是由于偶然性。
我们根据之前使用MCF-7异种移植模型的经验估算了每次实验所需的动物数量(19). 使用MCF-7异种移植瘤的肿瘤体积变异系数约为0.4。假设样本大小相等，两个样本学生的t吨在测试中，我们估计每组8只小鼠需要80%的功率（1型误差为5%）才能检测到各组之间平均体积60%的差异。在我们的第一个实验中，我们从每组14只动物开始，在不同的时间点进行有计划的动物牺牲以进行生化分析，因此在4周时，每组将剩下8只动物。使用n个=每组8只动物（数据未显示）。对于肿瘤体积数据，在每个时间点使用多元方差分析（MANOVA）进行分析。每剂量AIIB2或对照IgG体内，一个双面成对的学生t吨检验或χ2通过比较分析TUNEL和Ki-67表达之间的差异。所有计算均使用MINITAB（MINITAB，Inc.）统计软件。
结果
β1整合素抑制和IR在二维的恶性乳腺细胞集落和非恶性细胞中促凋亡，但在三维的腺泡样结构中不促凋亡
Petersen和Bissell实验室开发的原始三维分析(26)由悬浮在lrECM中的乳腺细胞组成。在这些条件下，非恶性细胞和恶性细胞可以迅速而有力地区分开来(26). 我们修改了该试验，将其用作新疗法的筛选，并表明它可以用作区分正常组织和恶性组织对β-1整合素抑制抗体体内(19).
在本研究中，我们使用改良的三维lrECM分析比较了恶性集落和非恶性腺泡对IR的凋亡反应，包括β1整合素抑制抗体。我们用8 Gy IR或0.08 mg/mLβ1单独或联合使用整合素抑制抗体（AIIB2），将AIIB2加入培养基中24小时，并在IR暴露前改变培养基。与S-1培养物相比，T4-2培养物显示出明显更多的细胞凋亡（4.8%对0.75%，P（P）<0.05），并且随着AIIB2的添加，反应增强(补充图S1B类). 相反，在标准的二维组织培养塑料上，TUNEL或Annexin V的荧光激活细胞分选分析显示，非恶性S-1细胞和恶性T4-2细胞对8Gy的IR有相似的凋亡反应（20%对14.2%，P（P）>0.05），二者均随AIIB2的加入而增强(补充图S1A类). 此外，通过集落形成试验评估的红外线照射（0–8 Gy）后的细胞繁殖能力表明，与T4-2细胞相比，S1细胞对辐射的敏感性更高(补充图S2).
β1IR后给予整合素抑制以最佳方式增强与三维lrECM中Akt活性下调相关的凋亡
IR已被证明上调β1二维肺癌细胞（本研究未检测非恶性细胞）和三维lrECM乳腺细胞系中整合素的表达(三,5). 因为我们之前发现，与24小时暴露相比，连续72小时AIIB2治疗对杀死癌细胞更有效，对S-1菌落几乎没有影响(19)，每次更换培养基时，我们都会将AIIB2添加到培养基中，直到获得培养物(). 该方案显著增加了IR后三维lrECM中T4-2乳腺癌细胞的凋亡（增加>80%，P（P）< 0.05;)对S-1非恶性腺泡无明显影响().
β1整合素抑制以Akt依赖的方式增强T4-2乳腺癌细胞IR后的凋亡，而不是三维lrECM中的S-1结构。A类在三维lrECM中，用IR（0、2或8Gy）处理S-1非恶性结构，并加入或不加入AIIB2。尽管单独使用IR、AIIB2或IR与AIIB2联合使用，但凋亡细胞的百分比没有显著变化。柱，平均值(n个= 3);酒吧，SE。B类全细胞裂解物的Western blot结果显示，IR后p-AKT无上调，而添加AIIB2后其下调。定量与β-肌动蛋白有关。C类在三维lrECM中，用IR（0、2或8Gy）处理T4-2对照菌落，并添加或不添加AIIB2。IR后添加AIIB2后，凋亡细胞的百分比显著增加>80%。柱，平均值(n个= 3);酒吧，SE；*，P（P）< 0.05, χ2.D类治疗6 h后磷酸化S473 Akt的Western blot显示，Akt活性的IR-dose依赖性增加（8Gy IR后的两倍），这是IR后随着AIIB2的添加而下调的。定量与β-肌动蛋白有关。
使用小细胞肺癌和MDA-MB-231乳腺癌细胞株（不包括正常对照）的二维培养，其他人显示β1整合素介导细胞毒性损伤后的细胞凋亡抵抗，这一效应由多种机制介导，包括Akt信号上调(10,13). Akt是一种丝氨酸-苏氨酸激酶，直接作用于PI3K下游，作为IR后细胞存活的介质(27–29). 通过Western blots检测Akt（p-S473 Akt）丝氨酸473磷酸化增加，在三维lrECM中T4-2乳腺癌细胞IR后Akt活性上调。IR后上调（8 Gy IR后2倍）具有剂量依赖性()表明IR诱导Akt活性增加，可能被β1整合素抑制抗体。为了进一步说明这种可能性，我们检测了暴露于IR和对照IgG抗体或IR和AIIB2的组合以及IR前后AIIB2对p-S473 Akt水平的三维lrECM培养(). 有趣的是，一旦癌细胞已经形成集落，仅AIIB2治疗6小时后Akt活性并没有下降().
为了确定这些发现是否适用于其他乳腺癌细胞系，我们使用了广泛使用的乳腺癌模型MCF-7细胞。除了确定最佳治疗顺序外，我们还在IR暴露前后用AIIB2处理三维lrECM培养物(). 与经IR和非特异性抗体对照处理的菌落相比，经IR和AIIB2两种序列联合处理的菌体的总细胞数明显减少（数据未显示），且显著增加（>70%，P（P）<0.05）（通过TUNEL测定）与单独IR相比(). 在AIIB2之前给予IR时，与未经治疗的对照组相比，观察到的差异较大；然而，在四个实验中的两个实验中，数据的统计显著性没有达到95%的确定度。我们进一步证实了与β1IR后整合素抑制().
β1整合素抑制在三维lrECM中优化增强MCF-7乳腺癌细胞IR后的凋亡。A类，实验方案：MCF-7细胞在三维lrECM中形成恶性集落3d，然后用IR±AIIB2处理，如图所示。B类通过TUNEL阳性细胞核计数检测细胞凋亡。柱，平均值(n个= 3);酒吧、SE*、，P（P）< 0.05, χ2.C类用总细胞裂解物的Western blotting检测AKT和pS473 AKT的总水平。定量与β-肌动蛋白有关。
IR诱导的Akt效应可以通过应用β1整合素抑制抗体
评估β1整合素抑制或IR通过Akt信号直接操作，我们使用转染了组成激活的肉豆蔻酰化形式的Akt的T4-2细胞（myr-Akt；参考文献。30,31; 这座建筑是R.罗斯的一份礼物；参考32）。我们使用TUNEL在T4-2 myr-Akt集落中测量凋亡，无论是单独IR还是与0.08 mg/mL AIIB2（之前在三维lrECM中用于诱导几个乳腺癌细胞株凋亡的剂量）联合使用(19). 与T4-2载体对照组相比，IR加0.08 mg/mL AIIB2后细胞凋亡增加，T4-2 myr-Akt菌落对该治疗无效().
AIIB2以剂量依赖的方式消除了Akt介导的IR后凋亡抵抗。A类Western blot显示，与载体对照组相比，转染的T4-2细胞中存在组成活性Akt。B类IR和0.08mg/mL AIIB2后，T4-myr-AKT细胞对凋亡有抵抗作用。柱，平均值；酒吧，SE。C类当AIIB2剂量为0.24 mg/mL或更大时（诱导载体控制细胞凋亡所需剂量的三倍），细胞凋亡显著增加。柱，平均值；酒吧，东南*，P（P）< 0.05, χ2.D类IR或AIIB2单独使用时，磷酸化Akt和磷酸化Thr1462 TSC2的Western blot（和定量）增加，但当AIIB2和IR联合使用时，降低。
我们推断，如果Akt活性对β1整合素信号转导，然后增加β1整合素抑制甚至在myr-Akt细胞中也能阻断Akt信号。AIIB2（0.24 mg/mL）增加3倍，在三维lrECM中以IR剂量依赖性方式诱导T4-2 myr-Akt细胞凋亡增加2倍(). 为了确定这种凋亡反应是否与Akt信号的下调相关，我们测量了p-S473 Akt和磷酸化苏氨酸1462 TSC-2（p-Thr1462 TSC-2），后者是Akt活性的下游靶点(32). 与在MCF-7细胞中观察到的结果一致，在T4 myr Akt中单独IR后6小时Akt上调(). 此外，这些高剂量AIIB2治疗对应于p-S473 Akt和p-Thr1462 TSC-2的下调。综上所述，这些数据强烈表明IR抵抗部分由β1整合素和随后Akt信号的增加这两者都可以被β1整合素抑制。
组合β1IR处理对整合素的抑制作用体内允许减少IR的有效剂量
鉴于三维lrECM的良好结果，我们询问这些数据是否可以验证体内将MCF-7细胞植入女性无胸腺nu后侧面−/−老鼠(n个=每组14只），随后将动物随机接受IR和对照IgG，IR后接AIIB2或AIIB2后接IR，如材料和方法中所述(). 总的来说，与单独治疗相比，将AIIB2添加到IR-增强的肿瘤生长抑制中(补充图S3). 值得注意的是，我们发现接受2 Gy后再接受AIIB2的动物与接受8 Gy对照抗体的动物具有相似的肿瘤生长抑制作用(P（P）< 0.014;). 我们在各组最终治疗后24小时测量了细胞凋亡，发现与其他组相比，用2Gy加AIIB2治疗的肿瘤也具有更高的细胞凋亡率（数据未显示）。
IR（2 Gy）加AIIB2比AIIB2或2 Gy单独使用更有效。A类，实验模式：MCF-7异种移植小鼠(n个=14）随机接受IR+对照抗体、IR+AIIB2或AIIB2+IR。B类肿瘤生长曲线的比较显示，2 Gy IR→AIIB2导致肿瘤进展时间更长（400 mm）三)仅2 Gy（*，log-rankP（P）<0.014），疗效与单用8 Gy相似。C、 Western blot显示IR加AIIB2与p-S473Akt活性下调有关体内.
为了验证我们在三维lrECM中观察到的联合治疗是否下调了Akt活性，我们通过检测S473 Akt的磷酸化来分析整个肿瘤细胞裂解物，以获得Akt活动的证据。再一次体内结果重复了三维培养的结果：我们观察到与IR剂量相关的AKT活性增加，IR后添加AIIB2可下调AKT活性().
讨论
这里，我们报告了结合β1带有IR的整合素抑制抗体可减少总有效辐射剂量，并通过使肿瘤（而非正常器官）对IR敏感来最大限度地提高治疗效果。我们越来越认识到IR对组织的整体影响，以及微环境在修改细胞对IR反应方面的作用(2,33)，指出了通过提高我们的知识和提供新的治疗靶点来尽可能减少IR有效剂量的必要性。β1整合素在癌症进展和对包括IR在内的细胞毒性治疗的抵抗中起着多方面的作用1整合素抑制抗体AIIB2可逆转三维lrECM中细胞的恶性表型(21)增加异种移植中乳腺癌细胞的死亡，同时保留培养物和正常器官中的非恶性腺泡体内(19). 在这里，我们表明AIIB2 post-IR选择性地增强乳腺癌细胞的凋亡，但在三维lrECM器官型培养中不增强非恶性腺泡，并且抗体结合低剂量IR可以实现与单剂量但大剂量IR相似的抑瘤作用体内此外，我们发现联合治疗后细胞凋亡增强与Akt信号的下调有关，同样在三维培养和体内重要的是，当我们在标准二维组织培养中检测细胞凋亡和生殖死亡时，我们无法区分恶性细胞和非恶性细胞。这些数据证实了我们之前发布的关于单一化学制剂治疗的数据(19,34)并表明正常细胞和癌细胞的固有辐射敏感性也在三维结构的背景下发生了改变。重要的是，我们在这里验证了三维lrECM分析是预测正常和恶性组织反应差异的有用且可靠的替代物体内.
我们之前已经表明，IR诱导细胞ECM相互作用的可遗传和全局变化，特别是β1整合素在三维lrECM培养的人乳腺上皮细胞中的表达。我们还观察到β1IR后乳腺癌细胞中的整合素，4其他人关于辐射肿瘤中整合素激活的确证报告(4,5,35). 我们推断，如果β1整合素被IR上调，那么AIIB2在IR后比IR前更有效，因为它增加了抗体结合的表位可及性。为了测试是否存在最佳的治疗顺序，我们使用了三维lrECM分析，其中癌细胞培养形成肿瘤样集落，然后在IR前24小时或IR后24小时用AIIB2进行治疗。这两个序列都导致显著更大的细胞死亡(P（P）<0.05）与单纯IR相比，对非恶性细胞无明显毒性。尽管有一种倾向倾向于先对IR进行排序，然后对AIIB2进行排序，但在多次重复实验中，这两种治疗方案之间并没有达到统计学意义。这一发现的可能原因之一是，AIIB2单独的影响程度大于仅归因于治疗顺序的可测量差异。重要的是，AIIB2在三维lrECM培养基中持续保持不变体内在二维培养的乳腺癌细胞中检测PI3K抑制剂LY294002测序效果的研究(36)据报道，当LY在IR前和IR后同时给予时，IR和LY联合治疗后细胞凋亡增加最为理想。然而，抑制剂和IR对非恶性细胞的影响尚未见报道。另一组(37)显示在HeLa细胞中给予前IR的LY294002明显优于后IR。这些结果与我们的结果不能直接比较，因为二维和三维模型中的培养模型和Akt通路抑制的作用机制不同；然而，他们指出，根据抑制剂和IR的相互作用机制以及IR和药物的递送环境，测序可能在优化联合治疗中发挥重要作用。
长期以来，已知PI3K抑制剂可使IR增敏，或与IR联合作用，以增强培养细胞系中几种癌症细胞的凋亡。在显示PI3K抑制的放射增敏作用的研究中，Akt正在成为耐药性的中心介体(5,38)作为PI3K的主要效应器，其活性受到多种细胞表面受体的修饰，包括生长因子和整合素。在我们的三维lrECM模型中，AIIB2 post-IR导致Akt信号下调，这与细胞凋亡增强有关。
我们的数据补充了其他人的数据，他们发现膀胱癌细胞的存活率在ras（拉斯维加斯）LY294002和IR联合治疗后显著降低，尽管这些研究人员报告在二维培养或体内(16,39). 其他人也报道了LY294002和IR对多形性胶质母细胞瘤异种移植的协同作用(27). 虽然剂量限制毒性和药代动力学限制了LY294002作为一种在人体内有效的药物，但这些研究强调了靶向Akt和IR的重要性。此外，Akt已被证明是整合素下游癌细胞和IR后生长因子途径的一个有希望的靶点(17). 因此，细胞表面的多条通路通过PI3K汇聚于Akt，PI3K是癌细胞生存的中心介质，可同时靶向增强治疗效果。我们的数据表明存在由Akt介导的IR-依赖性生存途径，该途径被β下调1整合素抑制。IR很可能影响Rac 1的极性途径(32)这也被证明会影响辐射诱导的细胞凋亡(40,41).
值得注意的是，β1整合素广泛表达，因此AIIB2有许多潜在靶点体内在恶性组织和正常组织中(42). 我们之前证明AIIB2无毒体内剂量高达20 mg/mL/kg。因此，尽管抗体可能识别非肿瘤靶点，但我们的数据表明β1例如，整合素在组织结构中的表达决定了抗体的凋亡反应，正如我们在三维lrECM中所示(19). 在我们目前的研究中，我们重点关注IR和AIIB2的联合是否产生抗肿瘤生长效应，以及这种疗法是否对动物有毒。需要进一步的研究来探索AIIB2在恶性组织中的其他潜在治疗靶点，包括新生血管系统(42).
我们发现在IR中添加AIIB2处理体内通过允许较小剂量的IR（2 Gy），但仅达到较高剂量IR（8 Gy）的相同终点，显著改善了对肿瘤生长的抑制。据我们所知，这是关于β1整合素抑制剂与IR联合用于治疗体内与单独添加8 Gy相比，添加AIIB2至8 Gy对肿瘤生长抑制有适度改善。然而，2 Gy辐射的改善是相当可观的。这些数据表明，可能存在一个红外剂量阈值，高于该阈值时，AIIB2的添加对增强肿瘤细胞死亡具有降低价值。我们承认，这些实验中使用的剂量和单组分可能不是人类的最佳剂量和测序，并且这些数据没有在β1整合素抑制与IR；然而，这些数据证明了β1整合素抑制和IR是一种有前途的乳腺癌放射治疗新策略。
有几个问题仍然没有答案，目前正由其他人和我们进行积极的调查。临床上，分级IR用于将正常组织损伤降至最低。尚不清楚β1整合素抑制剂可以通过分次治疗进行优化，并且可以在多大程度上调整所需的总IR剂量以实现最大的肿瘤控制。β的作用1整合素和Akt介导的IR后耐药性是一个活跃的研究领域。我们的数据表明，在IR存在的情况下，存在可通过Akt促进生存的替代途径。总之，我们的研究结果表明β1整合素抑制剂和IR，并为结合针对IR后Akt/PI3K通路的多种药物提供了理论基础。
致谢
赠款支持：加州大学旧金山分校临床研究员研究计划（C.Park）NIH P50卓越研究专业计划授予CA CA58207-08（C.Park）；美国能源部生物与环境研究办公室（DE-AC03-76SF00098；M.J.Bissell）；NIH/国家癌症研究所（CA64786-09；M.J.Bissell）；以及美国国防部乳腺癌研究计划颁发的创新者奖（DAMD17-02-10438；M.J.Bissell）。
我们感谢Stephanie Kim和Richard Y.Lee提供的技术援助。
工具书类
1Park CC，Mitsumori M，Nixon A等。浸润性乳腺癌保乳手术和放射治疗8年后的结果：边缘状态和系统治疗对局部复发的影响。临床肿瘤学杂志。2000;18:1668–1675.[公共医学][谷歌学者] 2Barcellos-Hoff MH、Park C、Wright EG。辐射与微环境肿瘤发生和治疗。Nat Rev癌症。2005;5:867–875.[公共医学][谷歌学者] 三。Park CC、Henshall-Powell RL、Erickson AC等。电离辐射诱导上皮细胞相互作用的遗传性破坏。美国国家科学院院刊。2003;100:10728–10733. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 4Onoda JM，Piechocki MP，Honn KV。辐射诱导黑色素瘤细胞中αIIbβ3整合素表达增加：对转移潜能的影响。辐射Res。1992;130:281–288.[公共医学][谷歌学者] 5.Cordes N，Blaese MA，Meineke V，Van Beuningen D。电离辐射诱导人肺肿瘤细胞系中功能性β1-整合素的上调在体外.国际放射生物学杂志。2002;78:347–357.[公共医学][谷歌学者] 6Damiano JS、Hazlehurst LA、Dalton WS。细胞粘附介导的耐药（CAM-DR）保护K562慢性粒细胞白血病细胞株免受BCR/ABL抑制、细胞毒药物和γ射线照射诱导的凋亡。白血病。2001;15:1232–1239.[公共医学][谷歌学者] 7Damiano JS、Cress AE、Hazlehurst LA、Shtil AA、Dalton WS。细胞粘附介导的耐药（CAM-DR）：整合素的作用和对人类骨髓瘤细胞系凋亡的抵抗。鲜血。1999;93:1658–1667. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 8Cordes N、Seidler J、Durzok R、Geinitz H、Brakebusch C.β1-整合素介导的信号转导对辐射诱导的基因毒性损伤后的细胞存活起着重要作用。致癌物。2006;25:1378–1390.[公共医学][谷歌学者] 9.Cordes N，Meineke V.细胞粘附介导的放射抗性（CAM-RR）。细胞外基质依赖性提高人类肿瘤和正常细胞的细胞存活率在体外.斯特拉伦特·昂科尔（Strahlenther Onkol）。2003;179:337–344.[公共医学][谷歌学者] 10Hodkinson PS、Elliott T、Wong WS等。ECM通过β1PI3-激酶的整合素依赖性激活。细胞死亡不同。2006;13:1776–1788.[公共医学][谷歌学者] 11Hynes RO.整合素：双向变构信号机。单元格。2002;110:673–687.[公共医学][谷歌学者] 12Giancotti FG，Ruoslahti E.整合素信号转导。科学。1999;285:1028–1032.[公共医学][谷歌学者] 13Aoudjit F，Vuori K.整合素信号抑制紫杉醇诱导的乳腺癌细胞凋亡。致癌物。2001;20:4995–5004.[公共医学][谷歌学者] 14Morozevich GE、Kozlova NI、Preobrazhenskaya ME等。β的作用1不同多药耐药性乳腺癌细胞凤尾草依赖性凋亡中的整合素亚家族。生物化学（Mosc）2006;71:489–495.[公共医学][谷歌学者] 15Yao ES，Zhang H，Chen YY等。增加β1整合素与浸润性乳腺癌生存率降低相关。癌症研究。2007;67:659–664.[公共医学][谷歌学者] 16Gupta AK、Cerniglia GJ、Mick R等，人类癌细胞的辐射增敏体内通过使用LY294002抑制PI3K的活性。国际放射肿瘤生物学杂志。2003;56:846–853.[公共医学][谷歌学者] 17Hallahan D，Geng L，Qu S，等。整合素介导的靶向性药物输送到受照射的肿瘤血管。癌细胞。2003;三:63–74.[公共医学][谷歌学者] 18Seidler J、Durzok R、Brakebusch C、Cordes N。整合素亚基β1A与蛋白激酶B/Akt、p130Cas和paxillin的相互作用有助于调节辐射存活。放射疗法。2005;76:129–134.[公共医学][谷歌学者] 19Park CC、Zhang H、Pallavicini M等，β1整合素抑制性抗体诱导乳腺癌细胞凋亡，抑制生长，并在三维培养和体内.癌症研究。2006;66:1526–1535. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Briand P，Petersen OW，Van Deurs B.在化学定义的培养基中分离和增殖的新二倍体非肿瘤性人类乳腺上皮细胞系。体外细胞开发生物学。1987;23:181–188.[公共医学][谷歌学者] 21Weaver VM，Petersen OW，Wang F，等。三维培养中人类乳腺细胞恶性表型的逆转体内通过整合素阻断抗体。细胞生物学杂志。1997;137:231–245. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 22Hall DE、Reichardt LF、Crowley E等人。α1/β1和α6/β1整合素异二聚体介导细胞粘附到层粘连蛋白的不同位点。细胞生物学杂志。1990;110:2175–2184. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 23Tomaselli KJ，Damsky CH，Reichardt LF。大鼠神经元细胞系（PC12）表达的哺乳动物整合素的纯化和表征：它们作为层粘连蛋白和IV型胶原的α/β异二聚体受体发挥作用的证据。细胞生物学杂志。1988;107:1241–1252. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Werb Z、Tremble PM、Behrendtsen O、Crowley E、Damsky CH。通过纤维连接蛋白受体的信号转导诱导胶原酶和基质溶素基因表达。细胞生物学杂志。1989;109:877–889. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 25Wang F，Weaver VM，Petersen OW，等。三维基底膜乳腺培养中β1-整合素和表皮生长因子受体之间的相互作用：上皮生物学的不同观点。美国国家科学院院刊。1998;95:14821–14826. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 26Schafer JM，Bentrem DJ，Takei H，Gajdos C，Badve S，Jordan VC。乳腺癌对三苯氧胺耐药性的机制。类固醇生物化学分子生物学杂志。2002;83:75–83.[公共医学][谷歌学者] 27Edwards E，Geng L，Tan J，Onishko H，Donnelly E，Hallahan DE.血管内皮对电离辐射反应中的磷脂酰肌醇3-激酶/Akt信号传导。癌症研究。2002;62:4671–4677.[公共医学][谷歌学者] 28Nakamura JL、Karlsson A、Arvold ND等。PKB/Akt通过信号抑制剂LY294002介导人类恶性胶质瘤的放射增敏。神经瘤杂志。2005;71:215–222.[公共医学][谷歌学者] 29Zingg D、Riester O、Fabbro D、Glanzmann C、Bodis S、Pruschy M。肿瘤和原代内皮细胞中电离辐射对磷脂酰肌醇3′-激酶/Akt生存途径的差异激活。癌症研究。2004;64:5398–5406.[公共医学][谷歌学者] 30Kohn AD、Barthel A、Kovacina KS等。丝氨酸/苏氨酸激酶Akt条件活性版本的构建和表征。生物化学杂志。1998;273:11937–11943.[公共医学][谷歌学者] 31Liu H、Radisky DC、Wang F、Bissell MJ。乳腺上皮性肿瘤细胞的极性和增殖受PI3-激酶下游不同的信号通路控制。细胞生物学杂志。2004;164:603–612. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 32Hay N.Akt-mTOR探戈及其与癌症的相关性。癌细胞。2005;8:179–183.[公共医学][谷歌学者] 33Barcellos-Hoff MH。制造肿瘤需要一个组织：表观遗传学、癌症和微环境。乳腺生物肿瘤杂志。2001;6:213–221.[公共医学][谷歌学者] 34Weaver VM、Lelievre S、Lakins JN等，β4整合素依赖性极化三维结构的形成使正常和恶性乳腺上皮细胞对凋亡产生抵抗。癌细胞。2002;2:205–216. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 35Handschel J、Prott FJ、Sunderkotter C、Metze D、Meyer U、Joos U。辐射诱导粘附分子增加和β2-人类整合素表达细胞。国际放射肿瘤生物学杂志。1999;45:475–481.[公共医学][谷歌学者] 36Liang K，Jin W，Knuefermann C，等。以磷脂酰肌醇3-激酶/Akt通路为靶点增强乳腺癌细胞的放射治疗。摩尔癌症治疗。2003;2:353–360.[公共医学][谷歌学者] 37Lee CM，Fuhrman CB，Planelles V，等。LY294002放射增敏人宫颈癌细胞系对磷脂酰肌醇3-激酶的抑制。临床癌症研究。2006;12:250–256.[公共医学][谷歌学者] 38Brognard J、Clark AS、Ni Y、Dennis PA。Akt/蛋白激酶B在非小细胞肺癌细胞中具有组成性活性，并促进细胞存活和对化疗和放疗的抵抗。癌症研究。2001;61:3986–3997.[公共医学][谷歌学者] 39Kim IA、Bae SS、Fernandes A等。选择性抑制Ras、磷脂酰肌醇3激酶和Akt亚型可提高人类癌细胞系的放射敏感性。癌症研究。2005;65:7902–7910.[公共医学][谷歌学者] 40Choi JA、Park MT、Kang CM等。Ha-Ras和Ki-Ras通过PI3K/Akt和Rac/p38有丝分裂原活化蛋白激酶信号通路的差异激活对辐射诱导凋亡的相反作用。致癌物。2004;23:9–20.[公共医学][谷歌学者] 41Choi SY，Kim MJ，Kang CM，等。通过c-abl蛋白激酶cδ-p38 MAPK信号传导激活人非小细胞肺癌细胞中的Bak和Bax，以响应电离辐射。生物化学杂志。2006;281:7049–7059.[公共医学][谷歌学者] 42Li TS，Ito H，Hayashi M，Furutani A，Matsuzaki M，Hamano K。整合素β1的细胞表达对于通过细胞植入诱导治疗性血管生成至关重要。心血管研究。2005;65:64–72.[公共医学][谷歌学者] 
