Vismodegib抑制TRAIL介导的非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型肝损伤

原代细胞分离和细胞培养

对于肝细胞和肝巨噬细胞分离，在原代细胞分离之前，连续7天给小鼠喂食标准食物或FFC饮食三个月（每组3-5个月），并每天用vismodegib（25 mg/kg体重）或载体（等体积的0.5%羧甲基纤维素）灌胃一次。如前所述，肝细胞和巨噬细胞通过胶原酶灌注分离，并通过Percoll（Sigma，St.Louis，MO）梯度离心纯化[15]立即快速冷冻肝细胞以提取RNA和蛋白质。将巨噬细胞固定在培养皿上30分钟，然后收集附着的细胞进行RNA分离。Huh-7是一种人肝细胞癌细胞系，在含有葡萄糖（4.5 g/L）、青霉素（100单位/mL）、链霉素（100µg/mL）和10%胎牛血清（均为Gibco，Carlsbad，CA）的Dulbecco改良Eagle培养基中培养。Huh-7细胞用vismodegib（0.01–1µM）或载体（DMSO）预处理16 h，然后用棕榈酸（600µM。棕榈酸的制备如我们之前所述，所用浓度与NASH患者的空腹游离脂肪酸血浆总浓度相对应[16].

生化分析

采用梅奥诊所诊断实验室的标准化和自动化程序测定血清ALT活性。如前所述测量肝甘油三酯浓度[17]并归一化为肝蛋白浓度。

肝组织的组织病理学、免疫组织化学、天狼星红染色和末端脱氧核苷酸转移酶dUTP缺口标记分析

为了通过光学显微镜对苏木精和伊红（H&E）染色的肝脏切片进行组织学检查（Eclipse Meta Morph V 5.0.7，Nikon，West Lafayette，IN），将肝脏切成5 mm×5 mm的切片，在4%多聚甲醛中固定48小时，然后包埋在石蜡中。使用切片机（Reichert Scientific Instruments，Buffalo，NY）制备组织切片（4µm）并放置在玻璃载玻片上。根据标准技术进行H&E染色。为了进行免疫组织化学，将装有石蜡包埋的副甲醛的肝组织切片脱蜡、水合，并与Mac-2（1∶250，eBioscience，加利福尼亚州圣地亚哥）和sonic hedgehog（Shh，1∶500，Santa Cruz Biotechnology，加利福尼亚州圣克鲁斯）抗体孵育。使用Vectastain ABC试剂盒和二氨基联苯胺作为底物（加利福尼亚州伯林盖姆Vector Laboratories）检测结合抗体，并用甲基绿或苏木精对组织切片进行复染。为了量化Mac-2免疫组织化学染色，采用形态计量学（KS 400软件，卡尔蔡司）对每节20×场的10张随机图片进行评估。用天狼星红染色定量肝纤维化。直接红80和快速绿FCF（颜色指数42053）来自Sigma-Aldrich Diagnostics。肝脏切片被染色，红色胶原纤维被数字图像分析定量，如我们之前详细描述的那样[18]在冷冻肝脏切片上进行肝组织荧光末端脱氧核苷酸转移酶dUTP镍标记（TUNEL）分析（原位细胞死亡检测试剂盒，印第安纳波利斯罗氏）。简单地说，肝组织样本在取出后立即在tissue-Tek OTC复合物（Takeda，Deerfield，IL）中冷冻保存。组织切片在低温切片机（莱卡，布法罗格罗夫，伊利诺伊州）上以5µm的厚度切割，风干并在-80°C下保存，直至使用。然后，使用制造商的方案进行TUNEL分析，并使用带有DAPI（纽约州格兰德岛生命科技公司）的ProLong Gold防伪试剂安装组织切片。通过使用荧光显微镜（Eclipse 80i，Nikon，West Lafayette，in）在20个随机显微镜场（20×）中计数TUNEL阳性细胞核来量化凋亡细胞。

相干反斯托克斯拉曼散射和二次谐波显微镜

使用相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）和二次谐波产生（SHG）应用程序，在双光子共焦显微镜FluoView FV1000 MPE（美国奥林巴斯，宾夕法尼亚州中央山谷）上对无标签冷冻肝组织切片（5µm厚）进行成像。Mai Tai深海激光器（光谱物理）调谐至800 nm，使用XLPlanN 25×/1.05w MP物镜。对于胶原蛋白区域量化，使用ImageJ软件量化强度高于阈值的SHG图像的像素数。每组检查四只动物，每只动物至少检查十张图片。

蛋白质印迹

使用裂解缓冲液（50 mM Tris-HCl，pH 7.4；1%Nonide P-40；0.25%脱氧胆酸钠；150 mM NaCl；1 mM EDTA；1 mM-PMSF；1µg/mL抑肽酶、亮氨酸蛋白酶、胃蛋白酶抑制素）获得分离的小鼠肝细胞的全细胞裂解物，然后在15000×g的温度下在4°C下离心15分钟以去除细胞碎片。等量的蛋白质（50µg）将其加载到SDS-PAGE凝胶上，转移到硝化纤维素膜上，并与抗光滑抗体（ab72130，Abcam，Cambridge，MA）以1∶5000的稀释度孵育过夜。辣根过氧化物酶结合二级抗体（SantaCruz Biotechnologies）以1∶5000的稀释度使用。GAPDH蛋白水平用作负荷控制。使用增强化学发光试剂（Amersham，Arlington Heights，IL）和柯达X-OMAT胶片检测结合抗体。

定量实时聚合酶链反应

从肝组织、原代细胞和Huh-7细胞中提取总RNA，用RNeasy Plus Kit或RNeasy-Micro Kit（加利福尼亚州巴伦西亚市齐根市）进行分离，并用Moloney小鼠白血病病毒逆转录酶和寡核苷酸随机引物（均来自加利福尼亚州卡尔斯巴德市Invitrogen）进行反转录。在LightCycler480仪器（Roche Applied，Indianapolis，IN）上使用SYBR绿色荧光通过实时聚合酶链式反应（PCR）进行基因表达的定量。特定引物列于表1使用ΔΔCt方法计算靶基因表达。表达标准化为18S rRNA表达水平，这在四个实验组中是稳定的。所有数据都表明，喂食标准饮食的车辆处理小鼠的表达发生了翻倍变化。

统计分析

数据表示为平均值±SEM。采用单向方差分析和Bonferroni事后检验比较各组之间的差异。采用非配对t检验对两组进行比较。采用单因素方差分析和Dunnett检验分析Huh-7细胞中DR5基因的表达。差异被认为在对<0.05. 所有分析均使用GraphPad Prism 5.0软件（加利福尼亚州圣地亚哥）进行。

在喂食FFC饮食的小鼠中，Vismodegib治疗可抑制肝损伤，但不能抑制肝脂肪变性

通过组织学、CARS显微镜和肝脏中性甘油三酯的生化定量评估，与喂食食物的动物相比，喂食FFC三个月后，小鼠表现出明显的肝脏脂肪变性(图2A、B和C). 根据这些参数，维斯莫杰吉布治疗并没有改善肝脂肪变性(图2A、B和C). 事实上，在FFC饮食喂养的动物中，vismodegib治疗略微加重了肝脏中甘油三酯的积聚。为了深入了解这一观察结果，我们检测了参与脂肪生成、脂肪分解和极低密度脂蛋白分泌的酶的表达。我们评估了关键产脂酶的肝脏mRNA水平，包括乙酰辅酶A羧化酶-1（ACC1）、脂肪酸合成酶（FASN）、硬脂酰辅酶A去饱和酶-1（SCD1）、脂解酶，如过氧化物酶体酰基辅酶A氧化酶1（ACOX1）、肉碱棕榈酰转移酶（CPT）1a和2。我们还评估了参与甘油三酯合成的酶的mRNA水平，如酰基辅酶A：二酰基甘油酰基转移酶（DGAT）1和2，以及微粒体甘油三酸酯转移蛋白（MTTP）的表达，MTTP是极低密度脂蛋白组装和分泌的关键酶。FFC饮食诱导脂肪生成酶和CPT1a(图2D). 出乎意料的是，在FFC饮食喂养的小鼠中，vismodegib治疗降低了脂肪生成基因的表达(图2D). 它还降低线粒体脂肪酸氧化的关键酶（CPT1a和CPT2），但不降低过氧化物酶体脂肪酸氧化（ACOX1）的关键酶(图2E). 随着vismodegib治疗使肝脏积累脂质，推测MTTP的抑制和线粒体脂肪酸氧化的降低会抵消脂肪生成酶的抑制。

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图2

FFC饮食导致严重脂肪变性。

按照图1所示对小鼠进行治疗。（A） 固定肝标本用H&E染色。（B）无标签冷冻肝组织切片用CARS显微镜成像，以25倍物镜观察脂肪变性。（C） 测量肝组织中中性甘油三酯的浓度，并将其归一化为蛋白质浓度。（D-F）从肝组织中提取总RNA，通过实时PCR定量脂肪生成酶（D）、脂肪分解酶（E）和参与甘油三酯合成和分泌的酶（F）的基因表达。数值表示为平均值±S.E.M***对<0.001, **对<0.05, *对<0.01.

正如我们之前报道的那样，FFC饮食也会导致肝脏损伤，表现为血清ALT值显著升高(图3A). 相反，与车用FFC饮食动物相比，vismodegib-treated FFC饮食小鼠的血清ALT值降低。肝细胞凋亡是NASH的一个显著组织病理学特征[2]接下来，我们使用TUNEL分析检测肝组织样本中的凋亡。与喂食食物的动物相比，喂食FFC的小鼠肝TUNEL阳性细胞增加了约3倍(图3B). 与其对血清ALT值的影响一致，vismodegib还减少了FFC饮食小鼠的肝脏TUNEL阳性细胞。这些数据表明，vismodegib治疗可以减轻FFC饮食诱导的肝损伤，而不会改变肝脂肪变性。

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图3

内脏模型治疗的FFC饮食喂养小鼠的肝损伤减轻。

（A） 用标准技术测量图1中处理的小鼠样品的血清ALT值。（B） 用TUNEL法检测冷冻肝组织标本中肝细胞的凋亡。通过荧光显微镜在20个随机显微镜场（20×）中计数TUNEL阳性细胞核来量化凋亡细胞。数据表示平均值±标准误差***对<0.001, *对<0.01.

Vismodegib可防止FFC饮食诱导的小鼠TRAIL受体DR5上调，并防止DR5介导的FFC饮食小鼠损伤

当我们检测到vismodegib治疗后细胞凋亡率下降时，我们通过实时PCR分析了肝脏中死亡受体的表达。喂食FFC饮食的小鼠肝脏DR5表达显著增加（约9倍），而TNFR1和Fas表达水平上调不太明显（约1.5倍）(图4A). 在FFC饮食喂养小鼠中，vismodegib治疗抑制了所有三种死亡受体的表达，但结果最显著的是DR5上调。此外，我们评估了相应死亡受体配体的mRNA水平。全TRAIL、Fas配体和TNF-α在FFC饮食小鼠中的表达上调(图4B). 与死亡受体mRNA数据类似，vismodegib治疗消除了这些增加。这些数据表明，由于DR5的强烈上调，脂肪肝更容易受到TRAIL介导的肝损伤，这是一个已经提出但从未直接测试过的假设[21]为了更直接地验证我们的观察结果的这种解释，我们给FFC和用载体或vismodegib治疗的饮食喂养小鼠注射了一种激动性抗DR5抗体MD5-1。虽然喂食MD5-1的小鼠没有肝毒性，但同样的治疗显著增加了FFC喂食小鼠的血清ALT值(图4C)表明这种饮食会使小鼠对DR5介导的肝损伤敏感。最重要的是，vismodegib通过降低MD5-1给药的FFC饮食喂养小鼠的ALT值发挥了强大的保护作用(图4C). MD5-1给药也能诱导FFC饮食小鼠的肝细胞凋亡，但在饮食小鼠中没有诱导肝细胞凋亡(图4D). 总的来说，这些数据表明，vismodegib可以减少FFC饮食喂养动物中TRAIL:DR-5介导的肝损伤。

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图4

Vismodegib可消除FFC饮食诱导的死亡受体DR5上调，并防止FFC饮食小鼠中DR5介导的肝损伤。

（A，B）给小鼠喂食食物或FFC饮食3个月。然后，在处死小鼠之前，用vismodegib或载体再治疗一周。从肝组织中提取总RNA，并通过实时PCR定量死亡受体（A）和死亡受体配体（B）的表达。（C，D）将一组小鼠用chow或FFC饮食喂养3个月，然后用vismodegib或载体治疗2周。在献祭前的最后一周内，对vismodegib和车辆治疗组的每种饮食进行了两次MD5-1（一种激动性抗DR5抗体）注射。分析各组血清ALT值（C）和肝脏TUNEL阳性细胞（D）。（E） Huh-7细胞用vismodegib（0–1µM）预处理16 h，然后用600µM棕榈酸（PA）再处理8 h。提取总RNA，并通过实时PCR评估DR5的表达。Huh-7细胞中DR5的表达表示为四个独立实验的平均值。数据表示平均值±标准误差***对<0.001, **对<0.05, *对<0.01.

为了测试vismodegib是否可以直接调节肝细胞中DR5的表达，我们用vismodegig和棕榈酸（600µM）处理人类肝癌细胞（Huh-7），棕榈酸是已知的DR5诱导剂[16]，并通过实时PCR评估死亡受体的基因表达。虽然棕榈酸诱导Huh-7细胞中DR5的表达增加了2倍以上，但用vismodegib预处理以浓度依赖的方式完全消除了这种上调(图4E). 这些数据表明，vismodegib可能降低肝细胞中DR5的表达。虽然Huh-7细胞已被广泛用作脂肪凋亡模型，但我们注意到，将转化细胞系用作正常肝细胞病理生物学模型存在局限性。

Vismodegib治疗减少喂食FFC饮食的小鼠的巨噬细胞肝蓄积

几项研究表明，肝脏脂毒性在一定程度上是由肝脏内单核细胞谱系细胞的流入和激活介导的[22],[23]此外，在胃组织中，声波刺猬作为巨噬细胞的化学引诱剂[24]因此，我们确定了在FFC饮食中该谱系的细胞是否在小鼠肝脏中积累。值得注意的是，我们观察到FFC饮食喂养小鼠的CD14、CD68和F4/80的肝脏mRNA增加，所有巨噬细胞标记物(图5A). Mac-2结合蛋白免疫组织化学证实，与食用食物的动物相比，FFC饮食中肝巨噬细胞大量积聚，这是吞噬活性巨噬细胞的标志(图5B). 在用vismodegib处理的FFC饮食喂养的小鼠中，这种肝巨噬细胞标志物的增加被显著抑制(图5A、B). 通过测定TNF-α在肝脏中的mRNA表达来检验巨噬细胞激活的证据(图4B)、白细胞介素（IL）-1β、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）(图5C). 事实上，已知由活化巨噬细胞分泌的这些细胞因子和趋化因子的肝脏mRNA在FFC饮食喂养小鼠中升高，而通过vismodegib治疗后降低。此外，凋亡的肝细胞最近被证明能释放MCP-1，这是单核细胞和巨噬细胞的趋化因子[25]从而减少细胞死亡(图3B)可能有助于减少巨噬细胞的积累和活化。此外，为了在我们的模型中评估平滑抑制剂对肝巨噬细胞中刺猬信号传导过程的影响，我们测量了从小鼠的原代巨噬细胞中分离出来的刺猬靶基因的mRNA水平以及用载体或vismodegib处理的FFC饮食。无论是饮食还是药物治疗，patched 1、Gli1和Gli2的基因表达都没有改变(图5D). 然而，这些数据并不排除vismodegib通过非规范刺猬信号通路对巨噬细胞反应的影响。总的来说，目前的观察结果表明，vismodegib通过减少肝脏内巨噬细胞的浸润和/或活化，在一定程度上抑制了饮食诱导的肝损伤。

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图5

使用FFC饮食的vismodegib处理小鼠的巨噬细胞积聚和活化减少。

（A） 从按图1所述处理的小鼠肝组织中提取总RNA，并通过实时PCR评估几个巨噬细胞标记物的表达谱。（B） 另一种巨噬细胞标记物Mac-2在石蜡包埋的肝组织上通过免疫组化进行了检测，并显示了20倍物镜下的典型显微照片。如右图所示，通过对每个肝组织切片中十个随机区域的Mac-2阳性区域进行形态计量分析来评估巨噬细胞的聚集。（C） 通过实时PCR分析每个实验组获得的肝组织中与巨噬细胞激活相关的细胞因子IL-1β、IL-6和MCP-1的基因表达。（D） 从喂食食物和用载体或vismodegib处理的FFC饮食的小鼠中分离出肝巨噬细胞。提取总RNA，通过实时PCR评估刺猬信号靶基因的基因表达。条形柱表示平均值±S.E.M***对<0.001, **对<0.05, *对<0.01.

作者感谢Taofic Mounajjed博士在解释肝脏组织病理学方面的帮助，以及James Tarara博士在我们使用相干反斯托克斯拉曼散射和二次谐波显微镜进行研究方面的帮助。