衰老会降低大多数细胞的复制潜能和组织再生能力(1,2). 对此现象的机制进行了深入研究，但仍缺乏了解。在某些情况下，增殖的下降会达到一种不可逆转的状态，称为细胞衰老，其特征是细胞完全缺乏分裂，细胞形态、基因表达谱和染色质组织发生改变(三). 在任何衰老迹象出现之前，在出生后早期就已经看到细胞分裂速度的逐渐下降，这一点就更不为人所知了。
在啮齿动物和人类中，胰腺β细胞复制的流行率随着年龄的增长而急剧下降(4,5). β细胞进入细胞分裂周期对损伤作出反应的潜力在老年时也受到限制(6,7); 然而，我们最近发现，即使在非常老的小鼠的β细胞中，也保留了剩余的复制潜能(8). 这些表型的分子机制通常被认为集中于老年人中p16/INK4A的增强表达。p16缺陷减少，p16过度表达增强了β细胞复制中与年龄相关的下降(9). β细胞p16/INK4A表达的增加是由于多梳基因Ezh2和Bmi1水平的表达与年龄相关的下降，这些基因在年轻时起到抑制p16/INK4A的作用，而血小板源性生长因子受体减少(10,11). 除了p16/INK4A表达增加外，多种其他细胞周期蛋白激酶抑制剂随着年龄的增长而上调(7)但这些基因的功能意义尚不清楚。细胞周期抑制剂（包括p16/INK4A和其他）的表达增加与p38MAPK信号随年龄增长而上调有关(12).
值得注意的是，这些研究表明，与年龄相关的β细胞增殖下降源于β细胞周期抑制剂的细胞自主增加。然而，在β细胞领域之外，越来越多的证据表明，全身循环因素是衰老的重要决定因素，尤其是与年龄相关的细胞复制下降。一些引人注目的例子包括肌肉卫星细胞(13)、肝脏、皮肤(14)和神经干细胞(15). 在所有这些情况下，都表明幼年动物循环中存在的因子能够使老细胞再生，并使增殖速度达到幼年动物的水平。介导老年复制系统效应的因素的性质基本上仍不清楚。Notch和转化生长因子-β信号在卫星肌细胞中的作用(13,16)，和循环趋化因子与神经发生的年龄相关性下降有关(15). 更广泛地说，有人认为年龄变化的血传因子可能通过调节干细胞生态位来控制细胞复制(16). 其中许多研究中使用的一种特别有效的方法是异慢性联体共生，通过这种方法，年轻和老年小鼠的循环被结合起来，从而可以研究全身因素对衰老的影响(13).
最近的研究间接证明了系统因素在与年龄相关的β细胞复制下降中的重要性。在一项研究中，将年轻和年老的胰岛移植到高血糖小鼠体内。这项研究表明，当暴露于高水平的葡萄糖时，年轻和老年的β细胞都以相似的速度复制(17). 此外，当NOD-SCID小鼠的人类胰岛暴露于高水平葡萄糖时，供体年龄与β细胞增殖率之间没有发现联系(18). 最近，El Ouaamari等人发表了一篇文章(19)在β细胞增生的肝脏特异性胰岛素受体敲除模型中，利用联体共生证明存在来自肝脏的系统性因子。为了直接研究系统性因素在与年龄相关的β细胞增殖下降中的作用，我们建立了两个实验模型，将老年β细胞暴露在年轻环境中。通过异慢性联体共生和异慢性胰岛移植，我们发现存在调节年龄相关β细胞增殖率的循环因子。
研究设计和方法
老鼠。
动物实验由希伯来大学动物护理机构委员会批准。如前所述进行了共生(13)年龄为～1个月和～8个月的C57/Bl6雄性小鼠。3周后处死小鼠。不包括体重减轻25%以上的寄生动物。在移植实验中，将～125个胰岛移植到小鼠肾包膜下2.5周(20). 使用ELISA（Crystal Chem和R&D Systems，分别）测定胰岛素和IGF-1。
免疫染色。
如前所述准备胰腺石蜡切片(21). 使用了以下主要抗体：豚鼠胰岛素抗体（1:500；DAKO）、兔抗Ki67抗体（1:200；新标记物）和小鼠抗Nkx6.1抗体（1:2000；β细胞生物学联合会）。所有DNA染色均使用碘化丙酯（1:500）。二级抗体来自Jackson ImmunoResearch。使用ImageJ，每只1个月大的动物计数约30个胰岛或3000个β细胞，3个月大动物计数50个胰岛（8000–10000个细胞）。
逆转录聚合酶链反应。
所有实验均在应用生物系统7300实时PCR系统上进行，使用SYBER Green和每个基因的特异性引物。
统计。
使用双尾学生进行统计分析t吨检验和单因素方差分析，其中比较了两组以上。必要时进行临时Tukey测试。对于这两种分析，P（P）<0.05和P（P）<0.01被认为是显著的。
结果
异慢性联体模型的建立。
为了分析系统环境对β细胞复制的影响，我们比较了三组对映体：1.5个月龄的连接幼鼠（等时幼鼠）、7-8个月龄连接老年小鼠（等时老年小鼠）和连接幼鼠和老年小鼠（异时）。小鼠通过腹壁肌肉和皮肤进行手术连接，为期2-3周，然后处死。为了证明副肢之间存在连接的循环，将BrdU注射到一只小鼠体内，3小时后处死这对小鼠。注射小鼠的肠隐窝和所有三组副肢中附着的小鼠都显示出类似的BrdU信号，表明存在连接循环系统().
异慢性联体模型。A类：用BrdU注射一个对映体伴侣，3小时后杀死连接的对映体。对注射的小鼠和连接的小鼠进行DNA（绿色）和BrdU（红色）染色。B类：寄生小鼠体重显著下降(*P（P）学生<0.05t吨测试和方差分析），之后体重稳定。C类：1周后，连接小鼠（所有三组）的喂食血糖水平显著下降(*P（P）<0.05 ANOVA），并且在整个实验中保持较低水平(N个= 5). Het，异慢性；等时、等时。
接下来我们研究了联体的生理效应。1周后，所有三组副肢的体重都出现了轻微下降（约10–15%），在实验的剩余时间内保持稳定(). 有趣的是，联体小鼠的平均血糖也下降，2周后稳定在70-90 mg/dL。
异慢性联体增加老β细胞复制。
2–3周后，处死配对组和年龄匹配的非连接小鼠。然后用胰岛素和Ki67染色分析β细胞的增殖情况(). 年轻等时、年轻异时和未加入的小鼠的β细胞复制频率相似，约为3%。相反，与未连接的老年小鼠和等时老年小鼠相比，老年异慢性小鼠的β细胞增殖显著增加(). 虽然老的非连接和老的等时小鼠有约0.5%的β细胞复制，但老的异时小鼠中约1.25%的β细胞正在复制。这些结果表明，老年小鼠暴露在年轻的系统环境中，显著增加了β细胞的复制。
异慢性联体增加老年小鼠的β细胞复制。A类：在年轻小鼠和老年小鼠中进行共生，以创建等时和异时组。3周后，处死小鼠，并使用Ki67测定增殖。学生t吨试验表明，老年等时小鼠和老年异时小鼠之间的复制显著增加(**P（P）<0.01，而实验的方差分析得出P（P）< 0.001). 事后Tukey诚实显著性差异测试也显示了老年等时小鼠和异时小鼠之间的显著差异(*P（P）< 0.005).B类：四组不同的联体小鼠胰岛的代表性图像，分别用胰岛素（绿色）、DNA（红色）和Ki67（蓝色）染色(N个≥ 4). Het，异慢性；等时；NS，不显著；Yhet，年轻异慢性；Yiso，年轻等时。
异慢性胰岛移植受者年龄对β细胞复制的影响。
为了进一步研究系统因素在与年龄相关的β细胞增殖下降中的作用，我们建立了一种异慢性移植试验。我们创建了四组小鼠：150个幼年胰岛移植到幼年（1.5个月龄）小鼠，150个幼龄胰岛移植给老年小鼠（7-8个月龄的小鼠），150个老年胰岛移植至幼年小鼠，以及150个老年胰岛素岛移植至老年小鼠。少量移植的胰岛用于维持正常的葡萄糖稳态，这可能会独立地改变β细胞复制率。在任何一组中，喂食和空腹血糖水平均无显著差异(补充图1A类和B类). 手术后两周，通过对胰岛素、Nkx6.1和Ki67进行染色来确定移植β细胞中的复制频率(). 胰岛素和Nkx6.1均被用作β细胞标记物，以准确检测增殖的移植细胞；2.5%的幼年小鼠移植的幼年β细胞分裂。然而，当年轻的胰岛移植到老年小鼠时，只有0.5%的β细胞分裂。相反，移植到老年小鼠的老年胰岛中有0.5%的β细胞分裂，而移植到年轻小鼠的老年β细胞的复制率显著高于2%。这些结果进一步表明，系统环境的年龄调节β-细胞的增殖速率。
异种慢性胰岛移植增加老β细胞的增殖，减少年轻β细胞的增生。A类：将胰岛移植物放置在年轻和老年小鼠的肾包膜下，以创建等时和异时移植组。2周后，处死小鼠，并使用Ki67测量增殖。使用Student，异慢性移植成功地增加了旧胰岛的β细胞增殖和减少了年轻胰岛的增殖t吨测试(*P（P）<0.05）和方差分析(P（P）< 0.01). 事后Tukey诚实显著性差异测试也显示两个异慢性移植组之间存在显著差异(P（P）< 0.007;N个= 4).B类：四组不同移植小鼠肾包膜下移植的β细胞的代表性图像，分别染有胰岛素（绿色）、Nkx6.1（红色）和Ki67（蓝色）。胰岛素；NS，不显著；O、 老；Y、 年轻。
异慢性联体共生试验中的血清和局部因素分析。
接下来，我们研究了异慢性联体模型，以确定调节异慢性联体内β细胞复制上调的可能因素。年轻小鼠、老年小鼠、老年等时小鼠和老年异慢性小鼠的空腹胰岛素水平没有显著差异(). 有趣的是，我们发现年轻和老年小鼠的血清IGF-1水平升高；然而，老年等时小鼠和老年异慢性小鼠之间没有差异(). 我们进一步分析了已知影响细胞周期进展和β细胞生理学的选定基因的mRNA水平。虽然先前确定的细胞周期基因（p16/INK4A和Ezh2）在年轻和老年小鼠之间的表达存在显著差异，但在老年等时小鼠和老年异慢性小鼠之间，这些或其他因素没有发现差异().
异时性共生中的血清因子和基因表达。A类：对年轻、老年、老年等时和老年异慢性小鼠的空腹胰岛素进行分析。两组之间没有显著差异（两组均使用t吨测试和方差分析）。虽然老年小鼠的IGF-1水平显著升高(*P（P）< 0.05;t吨试验），老年等时小鼠和老年异慢性小鼠之间未检测到差异（方差分析中未发现显著差异；N个= 4).B类：年轻、老年和联体小鼠胰岛中选定细胞周期基因的表达。所有基因均归一化为年轻小鼠组，但p21和p16除外，后者归一化至老年小鼠组。对年轻伴侣的寄生并没有改变老年小鼠中任何基因的表达(N个= 3). Het，异慢性；等时；NS，不显著。
讨论
我们研究了与年龄相关的β细胞复制下降是否受到局部或全身因素的控制。通过两次手术化验，我们发现血液对这一下降有贡献。在异慢性联体共生中，当与年轻伴侣结合时，老年小鼠的β细胞复制显著增加。这些结果得到了异慢性胰岛移植实验的支持。这里，我们发现移植到年轻小鼠体内的旧胰岛增加了β细胞复制，而移植到老年小鼠体内的年轻胰岛减少了β细胞的复制。后一个结果表明，一个与年龄相关的β细胞复制下降有关的系统性因素也是年轻小鼠β细胞复制的主要调节因子。
我们的结果与其他器官的类似研究结果相类似，这些器官描述了系统因素对肌肉、肝脏和皮肤细胞复制的年龄相关性下降以及神经发生的年龄相关性降低的贡献(13,15,22). 此外，我们的工作与El Ouaamari等人最近的文章一致(19)在联体实验中显示系统因子作为β细胞有丝分裂原的能力。最近的研究表明，与年龄相关的β细胞复制下降是由于细胞周期抑制剂，尤其是p16/INK4A的表达增加所致(10). 我们的结果表明，调节β细胞增殖随年龄下降的系统性因子不太可能通过该途径发挥作用，因为老年小鼠中p16/INK4A、p18、p27和p21细胞周期蛋白激酶抑制剂的mRNA水平在暴露于年轻循环时没有改变，这导致复制增加().
我们还研究了胰岛素或IGF-1对异慢性联体症中β细胞增殖增加的潜在作用。然而，这些因子的血清水平在异慢性联体共生中没有改变，这并不支持这一观点(). 需要进一步研究，以确定对β细胞有丝分裂或细胞抑制的循环因子，并随着年龄的增长而改变，血小板衍生生长因子、肝细胞生长因子和表皮生长因子是主要靶点。
一个令人振奋的可能性是，葡萄糖本身是年龄相关性β细胞增殖下降的决定因素。葡萄糖通过葡萄糖代谢作用是一种关键的生理β细胞有丝分裂原(21,23,24). 此外，最近的两项胰岛移植研究表明，当移植到高血糖宿主中时，年轻和老年β细胞的复制速度相似(17,18). 重要的是，4-9个月大的小鼠血糖水平显著降低(25)我们观察到这种现象（127±11.878 mg/dL[年轻]和88.25±4.787 mg/dL（老年）；P（P）< 0.0001;N个= 8). 因此，随着小鼠年龄的增长，血糖水平的轻微下降可能至少部分地介导了β细胞复制的下降。
总之，我们表明，与年龄相关的β细胞复制下降受循环因素的影响，而将老β细胞暴露在年轻环境中可以恢复β细胞的复制。确定这种影响的因素可能为糖尿病的再生治疗提供新的方向。
