自然遗传学。作者手稿;PMC 2013年7月18日发布。
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CSK调节多态性与系统性红斑狼疮相关并影响B细胞信号传导和活化
,1,2 ,1 ,三 ,2 ,2 ,2 ,2 ,2 ,1,* ,2 ,4 ,2 ,5 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 ,4 ,7 ,三 ,1,§和2,§
纳塔利·曼贾雷兹·奥杜尼奥
1纽约州曼哈塞特北海岸路易斯安那州范斯坦医学研究所自体免疫和肌肉骨骼疾病中心。11030
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
埃米利亚诺·马拉斯科
1纽约州曼哈塞特北海岸路易斯安那州范斯坦医学研究所自体免疫和肌肉骨骼疾病中心。11030
沙龙·A·钟
三罗莎琳德·罗素关节炎医学研究中心,加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学医学系,邮编94117
马修·卡茨
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,纽约曼哈塞特北岸LIJ范斯坦医学研究所。11030
詹娜·基里迪
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
金·辛芬多佛(Kim R.Simpfendorfer)
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
简·弗洛伊登伯格
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
大卫·H·巴拉德
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
埃米尔·纳什
1纽约州曼哈塞特北海岸路易斯安那州范斯坦医学研究所自体免疫和肌肉骨骼疾病中心。11030
托马斯·J·霍普金斯
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
黛博拉·S·坎宁安·格雷厄姆
4英国伦敦大学国王学院医学院遗传与分子医学系医学与分子遗传学系SE1 9RT
安妮特·李
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
玛丽克·J·H·科宁
5荷兰奈梅亨Radboud大学奈梅亨·医学中心人类遗传学系
芭芭拉·弗兰克
5荷兰奈梅亨拉德布大学奈梅亨医学中心人类遗传学系
多琳·W·斯温克斯
6荷兰奈梅亨Radboud大学奈梅亨·医学中心,实验医学系,遗传内分泌和代谢疾病实验室
罗伯特·格雷厄姆
7人类遗传学部,Genentech,南旧金山,加利福尼亚州94080
罗伯特·P·金伯利
8阿拉巴马州伯明翰市阿拉巴马大学医学系,邮编35294
帕特里克·M·加夫尼
9俄克拉荷马医学研究基金会关节炎和免疫学研究项目,俄克拉荷马城,俄克拉何马州73104
蒂莫西·J·维斯
4英国伦敦大学国王学院医学院遗传与分子医学系医学与分子遗传学系SE1 9RT
蒂莫西·W·贝伦斯
7人类遗传学部,Genentech,南旧金山,加利福尼亚州94080
林赛·A·克里斯维尔
三罗莎琳德·罗素关节炎医学研究中心,加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学医学系,邮编94117
贝蒂·戴蒙德
1纽约曼哈塞特北岸LIJ范斯坦医学研究所自身免疫和肌肉骨骼疾病中心。11030
彼得·格雷格森
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
1纽约州曼哈塞特北海岸路易斯安那州范斯坦医学研究所自体免疫和肌肉骨骼疾病中心。11030
2Robert S.Boas基因组学和人类遗传学中心,Feinstein医学研究所,纽约州曼哈塞特市北海岸-LIJ。11030
三罗莎琳德·罗素关节炎医学研究中心,加利福尼亚州旧金山加利福尼亚大学医学系,邮编94117
4英国伦敦大学国王学院医学院遗传与分子医学系医学与分子遗传学系SE1 9RT
5荷兰奈梅亨Radboud大学奈梅亨·医学中心人类遗传学系
6荷兰奈梅亨Radboud大学奈梅亨·医学中心,实验医学系,遗传内分泌和代谢疾病实验室
7人类遗传学部,Genentech,南旧金山,加利福尼亚州94080
8阿拉巴马大学伯明翰分校医学系,邮编35294
9俄克拉荷马医学研究基金会关节炎和免疫学研究项目,俄克拉荷马城,俄克拉何马州73104
§共同指导这项工作。
*当前地址:麦吉尔大学健康中心临床免疫学部。加拿大蒙特利尔
全基因组关联研究(GWAS)已经确定了数百种常见的风险变异体,这些变异体在自身免疫性疾病的发展中涉及多种信号通路1许多风险变体可能通过依赖于信号反应阈值效应的谱系或成熟特异性机制发挥作用1在参与BCR信号通路的分子中描述了系统性狼疮的几个全基因组关联2,三然而,关于这些变异体是如何改变正常淋巴细胞信号传导和易患自身免疫的,目前还缺乏信息,而且往往相互矛盾。
在淋巴细胞中,T细胞或B细胞抗原受体参与的早期后果之一是酪氨酸激酶Src家族成员的激活。SFK的激活受Lyp-Csk复合物的调节。Lyp(产品PTPN22型基因)通过酪氨酸去磷酸化破坏SFK激酶结构域的稳定性,而Csk磷酸化SFK中的C末端酪氨酸,导致封闭的、不活跃的构象4Lyp变体R620W破坏Lyp和Csk的SH3结构域之间的相互作用,并与许多自身免疫性疾病密切相关5因此,我们在CSK公司欧洲血统SLE患者先前GWAS的基因座2我们观察到标记a的几个单核苷酸多态性(SNP)CSK公司在之前公布的数据集中,单倍型“B”与系统性红斑狼疮有名义关联,远低于全基因组统计显著性水平(OR~1.15,未修正的p值0.004-0.007,1311例和3340例对照)2。因此,我们对CSK公司24名受SLE影响的欧洲种族“B”单倍型纯合子受试者的发现队列中的外显子和五个高度保守的内含子区域(). 在发现数据集中存在的四种多态性中(补充表1),内含子变异体rs34933034(G>A)的次要等位基因(A)存在于48条单倍型为“B”的染色体中的34条中,因此特别值得关注。
的遗传结构CSK公司轨迹。(a)CSK公司跨越垂直框所示的14个外显子。该图显示了哺乳动物之间的序列同源性,高度保守区域显示为峰值(摘自基因组.ucsc.edu). 水平条突出显示了为测序选择的保守区域。测序的第一个保守区域下方的垂直记号显示了变异体rs34933034的位置(
). (b) SNP标记物与SLE的相关性;约80000bp的区域围绕CSK公司轨迹如图所示。利用1000个基因组数据插补SNP。灰色区域突出显示CSK公司基因。许多与SLE有中间关联的标记标记为B单倍型。所示标记要么是插补(●),要么是在一些样本中进行基因分型,而在其他样本中进行插补(○)。箭头指向rs8033381,它是标记B单倍型的许多标记之一,(c)在条件处理rs34933034后,所有的关联信号都位于CSK公司基因被消除。(d) rs8033381上的条件处理仍然显示与rs34933034的关联信号。(e) LD热图(r2)SLE相关标记CSK公司该基因揭示了欧洲血统受试者的单一主要单倍型阻滞。注意下面的r2对于带有此块(r)的rs34933032~ 0.5). (f) 主要的单倍型CSK公司图中显示了欧洲对照中的基因座及其频率。
评估rs34933034变异体的A等位基因与B类我们对来自11个队列的3769例SLE患者和3404名欧洲血统对照进行了基因分型,并分析了三组数据(方法、,和补充表2). 结果为SLE与变异rs34933034的A等位基因之间的关联提供了令人信服的证据:等位基因O.R.1.32,第页-值1.04×10−9连锁不平衡分析表明,rs34933034 A等位基因几乎只存在于B单倍型上(D′=0.95),总体相关性相对较低(r2<0.5)与定义该单倍型的任何其他SNP,如。两个SNP存在于CSK公司最近,B单倍型与几种自身免疫性疾病相关6,7因此,我们利用1000基因组项目的数据插补了SNP(补充表3)并对rs34933034进行条件分析,表明标记B单倍型的变异体的关联性仅次于rs349330034 A等位基因。例如,标记普通B单倍型的rs8033381标记显示出关联(P值:9×10−8)在rs34933034(P值:0.19)调节后消除(,箭头)。相反,rs8033381上的条件反射显示rs34933034中的关联(P值:2.49×10−4). 值得注意的是,我们没有观察到rs34933034和rs2476601之间存在遗传交互作用的证据(第22页,R620W)。
表1
rs34933034的频率CSK公司欧洲血统病例和对照中的风险等位基因。
分析组1 | N(病例/对照) | 基因型频率(病例/对照) | MAF公司2, % (病例/对照) | 或三 (95%到岸价格) | P值等位基因4 | P值加法5 | P值加法6 |
---|
AA公司 | AG公司 | GG公司 |
---|
我 | 1378/919 | 0.040 / 0.018 | 0.28 / 0.23 | 0.68 / 0.75 | 18.17 / 13.54 | 1.42 (1.20–1.67) | 3.2 × 10−5 | 4.3 × 10−5 | 9.2 × 10−5 |
二 | 1368/1228 | 0.032 / 0.028 | 0.29/0.24 | 0.68 / 0.73 | 17.50 / 14.78 | 1.22 (1.05–1.42) | 7.8 × 10−3 | 8.6 × 10−3 | 9.8 × 10−3 |
三 | 1023/1257 | 0.023 / 0.190 | 0.31 / 0.24 | 0.67 / 0.74 | 17.74 / 13.76 | 1.35 (1.15–1.59) | 2.3×10−4 | 1.9 × 10−4 | 4.1 × 10−4 |
总计 | 3769/3404 | 0.032 / 0.022 | 0.29 / 0.24 | 0.68 / 0.74 | 17.81 / 14.07 | 1.32 (1.20–1.44) | 1.0 × 10−9 | 1.35 × 10−9 | 3.35×10−8 |
ENCODE数据报告在rs34933034附近存在DNA敏感位点,表明该变异位于CSK公司同样,据报道CSK公司在免疫系统的细胞中表达最高,尤其是在B细胞亚群中8这一点通过对CSK公司健康人外周血单个核细胞(PBMC)不同亚群中的表达,包括B细胞的过渡性、幼稚性和记忆性亚群(至少5名受试者恢复了所有亚群),以及CD4+和CD8+T细胞和单核细胞(n=3)(). 如前所述,CSK公司在B细胞中表达最高()与B细胞成熟度呈负相关(n=5,p=0.03)。因此,最近从骨髓中出现的过渡性B细胞CSK公司表达量高于成熟的幼稚B细胞,后者的表达量又高于记忆B细胞。我们从29名rs3493034基因型的健康献血者中分离出原始B细胞,这些献血者均为B单倍型纯合子。如图所示更高级别的CSK公司幼稚B细胞中的转录物与rs3493034 A等位基因显著相关。
CSK公司淋巴细胞亚群中的表达不同,与CSK公司基因型。(a) 门控策略用于区分单核细胞和T细胞(上面板)以及B细胞亚群(下面板)。(b)CSK公司外周B细胞从过渡细胞向记忆细胞成熟时,其表达降低(p=0.030,Kruskal-Wallis检验)。CSK公司外周血T细胞的表达较低(p=0.0047,五个细胞亚群之间的Kruskal-Wallis检验)。(c) 在幼稚B细胞中,rs34933034风险等位基因(A)与CSK公司表达(分析29名受试者,Kruskal-Wallis测试)。如(a)所示,通过细胞分类从外周单核细胞中分离出细胞亚群。用qPCR对从非基因型献血者(b)或单倍型匹配GaP受试者(c)的单个核细胞分离的亚群RNA合成的cDNA进行表达分析,水平条标记数值的中位数。
接下来,我们检查了是否增加了CSK公司表达影响B细胞功能。据报道,在静止的小鼠T细胞中,Csk介导的C末端磷酸化将SFK维持在非活性构象中9在B细胞中,Lyn是最丰富的SFK;因此,我们假设Csk升高会增加B细胞Lyn的C末端酪氨酸的基础磷酸化。我们通过流式细胞术分析了27名健康成人静止期幼稚B细胞(CD20+,CD27-)中的Tyr508磷酸化。如所示和补充图1,来自携带CSK公司与非风险等位基因携带者相比,危险等位基因显示Lyn的Tyr508磷酸化更高。
这个CSK公司风险等位基因与磷酸-Lyn增加相关508增强成熟B细胞的活化。(a) 用流式细胞术在单倍型匹配GaP供体纯合rs34933034变异体任一等位基因的幼稚B细胞中测定磷酸化酪氨酸508;显示了风险(粗体)和非风险(阴影)对象的轮廓,细线显示了同型控制;(b) 佩林508CSK风险等位基因携带者。佩林508标准化为每日平均值(n=27,p=0.0136,Mann-Whitney检验,见多次比较后的校正方法,以及补充图1Kruskal-Wallis检验P=0.0569)。(c) 钙动员的代表性实验。在用抗IgM(Fab′)激活前,读取基础钙40秒2记录至少6分钟后,将离子霉素用作钙动员的阳性对照,并且基因型之间没有差异(数据未显示)。(d) 来自11个不同“B”单倍型捐赠者的数据被归一化为一个无风险(GG)受试者,以便在四个单独的实验日中进行比较。图中显示了前90秒曲线下的面积(4分钟时的类似结果)(见统计分析方法)。(e) 42名B单倍型纯合受试者的IgM血浆水平,Kruskal-Wallis试验。在每幅图中,水平线表示中间值。
有趣的是,与Lck在T细胞中的激活作用相反,据报道,Lyn介导BCR信号的负调控10因此,我们在B细胞中进行BCR交联后,测量了11名纯合供体B细胞的B单倍型幼稚B细胞中的钙动员。正如预期的那样,A等位基因纯合的幼稚B细胞表现出由BCR交联触发的钙动员增强(和; 没有与以下方面相关的信令容量差异CSK公司用离子霉素刺激后观察到基因型(数据未显示)。这一结果与Lyn对B细胞活化具有负调节作用的报道一致10此外,携带CSK公司危险等位基因在血浆中也有更多的IgM(n=44,)与具有非风险等位基因的受试者相比,这与成熟B细胞的激活增强相一致。
鉴于此CSK公司在移行B细胞中表达最高,我们研究了风险等位基因如何影响早期B细胞分化。为了研究B细胞在最原始状态下的成熟,我们分析了27份脐血样本中的B细胞亚群,发现新生儿受试者纯合子为CSK公司危险等位基因的频率是移行细胞(CD38)的两倍你好,CD10你好)与非危险受试者脐血中观察到的水平相比(和). 对该B细胞室的进一步解剖表明,具有风险等位基因的个体比其非风险对应者具有更多的“晚期”过渡细胞;这些细胞还具有CD21的高表面表达特征,并获得了表面IgD,同时仍保持CD38和CD10的高表达(、和补充图2).
这个CSK公司危险等位基因与脐带血中移行B细胞的扩增有关。(a) B细胞由CD19定义+门(CD3/CD14/CD16除外);移行细胞被定义为CD38你好,CD10你好通过获得IgD,将移行细胞进一步分为早期和晚期,并降低晚期移行B细胞的CD10。该面板显示了每个纯合子基因型的代表图。(b) 与杂合子相比,纯合风险等位基因携带者CD19室中的过渡细胞百分比显著高于杂合子,与野生型纯合子个体相比,其趋势相似(n=27,Kruskal-Wallis检验)。(c) 在移行细胞中,携带风险等位基因的个体中晚期移行细胞室扩大(Kruskal-Wallis试验)。水平线标记中间带。
我们的研究结果清楚地支持这样一个假设:CSK公司表达水平可以改变正常的B细胞生物学。我们已经证明了这一点CSK公司在B细胞成熟的早期阶段(过渡期B细胞)表达最高,携带危险等位基因的正常人表现出晚期过渡期B淋巴细胞群的扩张。这可能反映了耐受性检查点受损或晚期过渡期B细胞阳性选择增强。这两种模型都预测到,在健康携带者的外周储备中,自身反应性B细胞的数量会增加CSK公司风险等位基因,与自身抗体产生的可能性增加一致。
Lyp-Csk复合物通过设置BCR信号的阈值发挥作用,但具体效果可能因B细胞发育阶段和该阶段具有功能的特定SFK而异。在携带PTPN22型风险等位基因,均降低11和增强的12,13已经报道了对BCR交联的反应,以及携带风险等位基因的健康受试者早期B细胞库中较高的自身反应性14这里报告的结果表明,随着信号装置的成熟,Csk的水平在不同的发育阶段有所不同。我们注意到Lyp的表达和活性(PTPN22型)尚未对人类移行性B细胞进行详细研究。我们的结果清楚地表明PTPN22型对过渡性B细胞信号阈值的影响必须考虑到CSK公司基因型,正如我们在这里所做的PTPN22型此外,两个SFK,林恩和黑色,与系统性红斑狼疮的风险有关2,15。我们小组的研究表明黑色风险等位基因也主要影响B细胞发育早期的表达差异16尽管Blk表达差异的功能后果尚未确定。这强调了需要进一步探索信号分子在免疫细胞不同发育阶段的作用,以了解导致自身免疫性疾病的机制,从而为合理开发靶向治疗方法提供信息。
方法
研究对象和标本
从UCSF狼疮遗传学项目中获得SLE患者队列的DNA18,多重自身免疫疾病遗传学联合会(MADGC)19明尼苏达大学20英国SLE研究21,ABCoN公司2阿拉巴马大学三和OMRF三如前所述。对照DNA样本取自纽约癌症项目收集22,23荷兰奈梅亨生物医学研究(NBS,一个基于人群的队列,由荷兰奈梅根的自报随机选择居民组成)24以及费恩斯坦医学研究所(FIMR)和阿拉巴马大学的基因型和表型登记处(网址:www.gapregistry.org). 所有受试者都出具了书面知情同意书,机构审查委员会在其所在机构审查了协议。根据ACR指南确定SLE诊断2,三,18–20。有关每个数据集的样本数的详细说明,请参见补充表2.
健康对照组的所有基因型匹配血样均取自GaP注册的志愿者;承运人PTPN22型风险等位基因(rs2476601,T)被排除在功能研究之外。从长岛血库获得了被认为不适合储存的脐带血样本和白细胞单位,并对其进行了鉴定。FIMR IRB审查并批准了所有方案,放弃了对未经鉴定的脐血和白细胞单位的同意。
基因分型
CSK公司Polymorphic DNA Technologies(加利福尼亚州阿拉米达)对发现队列中的24个SLE样本进行了测序。在三个分析组中依次进行数据集的基因分型。欧洲血统由每个分析组内的血统信息标记确定。补充表2描述了三组数据集中的每一组。这个CSK公司通过焦磷酸测序对I组和II组进行基因分型(补充表4). 的基因分型CSK公司第三分析组的rs34933034在ViiA7机器(Applied Biosciences)中使用TaqMan分析C_60143137_10对来自NBS和OMRF的样品进行qPCR。
从每个队列的全基因组分型中获得了关于大陆起源和欧洲种群多样性的SNPs信息,并用于将研究局限于欧洲血统的受试者。通过主成分分析匹配案例和控制25以及使用SNP和变异套件(黄金螺旋)对等位基因和加性基因模型进行关联分析。使用之前报告的基于样本量的分析策略,对加性遗传模型的荟萃分析p值进行主成分分析校正26.
插补和条件分析
对于每组数据集,我们获得了位于CSK公司我们使用了1000个基因组项目数据(第1阶段,第3版,2012年3月)作为参考,以插补120 Kbp片段(chr15:75024425–75145539,hg19)上的变异CSK公司在中间。使用IMPUTE2.2进行推测17在随后的分析中,仅使用概率高于90%的插补多态性,未使用每个数据集90%以上样本中未调用的变体(补充表3). 使用SNPtest2对通过质量控制的变异体进行条件分析17,使用加性关联模型。
样品处理、流式细胞术和细胞分选
通过Ficoll-Paque(GE HealthCare)分层回收外周血中的单核细胞。为了进行细胞分选,使用包含以下抗体鸡尾酒之一的抗体混合物对细胞进行10分钟染色:CD8(FITC,551347)、CD20(PE,555623)、CD4(PerCP,340671)、CD3(APC,340440)和CD14(太平洋蓝,558121),所有这些都来自BDBiosciences,用于单核细胞和T细胞亚群的分选(3个样本)。B细胞:抗IgD(FITC,555778)、太平洋蓝结合CD3(558124)、CD14、CD16(558122)、CD19(APC-Cy7,557791),均来自BDBiosciences;来自Invitrogen的CD27(PE,MHCD2704)和CD38(PE-TR,MHCD3817);和来自Biolegend的CD10(PE-Cy7,312214)。在FACSAria仪器(BDBiosciences)中对细胞进行分类,在通过正向和侧向散射面积和宽度参数排除双重因子后,为单核细胞(CD3)设置门−,CD20−,CD14+),CD4+和CD8+细胞(CD20之后−和CD3+闸门)。B细胞被定义为CD19+,CD3/14/16−随后对B细胞亚群进行门控:记忆(CD19+,CD27+)和免疫前(IgD+,CD27−). 为了划分免疫前B细胞群,使用T细胞(阴性)CD10荧光的上限来定义过渡期B细胞(CD38)CD10阳性的下限你好,CD10你好)和原始细胞(CD38昏暗的,CD10低的). 其中13份脐血样本用CD21 PE染色,以确定早期和晚期过渡期B细胞的门27使用Kruskal-Wallis单向方差分析对B细胞亚群进行统计分析。
表达式分析
CSK公司对分选的细胞进行外周血细胞的表达分析。使用Micro RNeasy Isolation Kit(Qiagen)提取RNA。cDNA通过iScript(Bio-Rad)线性逆转录合成。cDNA随后用于qPCRCSK公司(Hs01062585_m1,应用生物系统)和POLR2a型(Hs01108291_m1,应用生物系统)在Lightcycle 480 II(罗氏)中。根据改进的Livak方法ΔCt:2计算归一化表达(抄送波兰R2a−CtCSK公司)28。所有表达分析均重复进行。分析CSK公司在Kruskal-Wallis试验中进行B细胞亚群的表达;分析CSK公司使用单向方差分析进行基因型间的表达。
细胞信号
对B单倍型纯合健康受试者的PBMC进行细胞信号检测。用PBS清洗细胞,并在含有2%FCS的RPMI中37°C下静置1 h。对于pLyn,细胞被固定、清洗并用CD20、CD24、CD38、CD27和CD3进行表面染色。在BDPerm渗透步骤后,用抗pLck(Y505)抗体(BDPhosflow,557879)对细胞进行染色,该抗体与pLyn发生交叉反应。通过FlowJo软件对数据进行分析,获得了原始B细胞的中值荧光强度(MFI)。如果仅基于MFI或MFI减去同种型对照来分析数据,则没有观察到差异。将数据归一化为每次实验的MFI平均值。考虑到多重测试的修正,两两比较在p<0.0166水平上被认为是显著的。
对于钙流量,在休息1小时后,用Indo-1装载细胞,然后像以前一样用抗CD2、CD14、CD16、CD20、CD27、CD38和CD10标记。数据在BD-LSRII机器中收集为Ca的比率2+-在自由Indo(450nm)上结合Indo(405nm)一分钟。然后用10μg/ml F(ab′)刺激细胞2山羊抗人IgM(Southern Biotech)和数据再记录5分钟。随后用离子霉素激活所有样品作为对照。使用FlowJo软件分析数据,计算前90秒和4分钟激活曲线下的面积。
SAS 9.2版用于执行层次线性混合模型(HLMM),以分析曲线下面积的归一化值。为了适应实验条件的日常变化,我们在一天中“封闭”,并考虑在几天内嵌套的受试者。此外,实验当天被视为随机效应。这一结果在p<0.05的水平上被认为具有统计学意义。
酶联免疫吸附试验
96孔板预先涂有10μg/mL抗人IgM抗体(Southern Biotech),并用PBS(1%BSA)封闭。对样品进行电镀,并在孵育1小时后,用与碱性磷酸酶结合的抗人IgM清洗和孵育微孔,然后在碳酸盐缓冲液中用对硝基苯基二钠(Sigma)进行培养。测量405nm处的光密度。样品一式两份,使用IgM标准曲线(Sigma-Aldrich)定量IgM。