单病毒融合实验揭示质子流入痘苗病毒和半融合滞后时间

试剂

2-（N-吗啉基）乙磺酸（MES）、三（羟甲基）氨基甲烷、Triton X-100、BSA、BSA-FITC和六甲基二硅氮烷（HMDS）均来自西格玛-奥德里奇（密苏里州圣路易斯）。SU-8 3005、SU-8 2050、AZ1518以及抗蚀剂的开发人员从Microchem（马萨诸塞州牛顿）购买。聚二甲基硅氧烷（PDMS）（Sylgard 184）来自道康宁（密歇根州米德兰）。1H，1H，2H，2H-全氟十二烷基二甲基氯硅烷是从ABCR（德国卡尔斯鲁厄）获得的。R18和磷酸盐缓冲盐水（PBS）来自Invitrogen（加利福尼亚州卡尔斯巴德）。杂交瘤细胞产生小鼠抗L1（单克隆抗体（MAb）7D11）(24)经Alan Schmaljohn（马里兰州巴尔的摩马里兰大学）许可，Bernard Moss（马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院，马里兰州）善意提供。由BioGenes（德国柏林）从杂交瘤上清液中纯化单克隆抗体。

细胞系

BSC-40（非洲绿猴）在DMEM（加利福尼亚州卡尔斯巴德生命科技公司）中培养，补充10%热灭活胎牛血清、谷氨酸MAX、非必需氨基酸、丙酮酸钠和青霉素链霉素。HeLa S3悬浮细胞在含有10%热灭活胎牛血清、非必需氨基酸和青霉素-链霉素的RPMI 1640谷氨酸MAX培养基（生命科技）中生长。

病毒

R18标记的VACV株WR EGFP-A4 MVs(25)或WR EL EGFP(15)在BSC-40细胞中产生，并按照前面所述进行纯化/标记(26). 细胞溶质提取物的MV通过36%蔗糖缓冲液沉淀（80 min，43000×克，4°C），在10 mM TRIS中重新悬浮，pH 9.0，并与最终浓度为22.5的R18孵育μM在室温下持续2小时。对标记的MV进行沉淀（40分钟，38000×克，4°C）并通过25–40%蔗糖梯度（50 min，12000×克，4°C）。最后一次沉淀来自抽吸带的病毒（40 min，38000×克，4°C）。MV在pH 9.0的1mM TRIS中再次悬浮，并储存在−80°C下。通过使用Cary Eclipse荧光分光光度计（加利福尼亚州帕洛阿尔托瓦里安）比较PBS和1%Triton X-100/PBS中病毒悬浮液的发射光谱，验证了v膜中R18的自猝灭，该荧光分光光谱仪的激发波长为560±5 nm，发射波长为565至750 nm±5 nm。作为融合的阴性对照，标记的MV被100个培养物中和μg/mL 7D11，一种小鼠单克隆抗L1抗体，在37°C下保持1小时。

大块聚变实验

为了监测整体融合，使用Cary Eclipse荧光分光光度计（Varian）测量低氢诱导融合期间R18-去猝灭，其激发波长为560±5 nm，发射波长为590±5 nm。为了在相同的实验中测量R18和EGFP荧光（使用相同的光电倍增管设置），EGFP荧光用488±5nm激发，在509±10nm处测量，而R18用560±5nm激发，在640±5nm处测量。R18荧光测量波长大于发射最大值，以调整信号强度至EGFP荧光。R18标记的WR EGFP-A4 MV与7×10绑定⁵低温下的HeLa S3细胞（MOI 30）。1小时后，100个细胞沉淀并重新悬浮μL PBS。将带有结合病毒的细胞悬浮液添加到900μl在1.5ml荧光池（119.004-QS，Hellma，Müllheim，德国）中预加热PBS。1分钟后，反应杯中的pH值通过添加100降低μl MES溶液（0.063–1 M），pH值为6.5至5.0。R18荧光测量10分钟，当所有R18通过添加110脱色时μl 10%Triton X-100。添加Triton X-100后，R18荧光归一化为信号强度。

单病毒颗粒融合实验

R18标记的VACV MV或IAV颗粒与5×10结合⁵4°C下的HeLa S3悬浮细胞（MOI 5）。1小时后，细胞沉淀并在500μl PBS。将微流体装置和所有溶液在TIRF显微镜的培养室中加热至37°C。这样可以避免设备中出现气泡，并确保熔合实验的温度正确。使用neMESYS泵（cetoni，Korbussen，德国）操作2.5 ml Hamilton玻璃注射器，将液体通过通道抽出，该注射器与聚四氟乙烯管连接至芯片。细胞悬液（50μl） 以5的流速加载到芯片中μl/min。用PBS以相同的流速冲洗未困在栅栏中的细胞。

通过TIRF显微镜确定了一个包含多个带有单个病毒颗粒的细胞的视野，并通过将PBS（pH 7.4）中的缓冲液更改为PBS中的90 mM MES（pH 5.0）来诱导结合MV与质膜的融合。在更换储液罐中的溶液时，将流速降低到足以使细胞保持原位的最小流量（0.1μ升/分钟）。这确保了缓冲液交换后视野中的pH值迅速下降，并有一定的延迟。采集开始后，流速立即增加至5μ升/分钟。细胞陷阱处的pH值在~15 s后下降。

单粒子融合检测

为了可视化和记录单病毒融合事件，我们使用了一种微流控装置，在该装置中捕获带有结合R18标记MV的单个HeLa S3细胞(图1). 随着时间的推移，荧光病毒可以在显微镜上观察到，并且在快速交换到pH值为5.0的缓冲液（在一个框架内）后与质膜融合时，荧光病毒更为重要。将带有结合VACV MV的HeLa S3悬浮细胞加载到微流体装置中。捕获的细胞通过TIRF显微镜进行成像，消逝场为～250 nm。因此，只有直接接触细胞膜和靠近玻璃的病毒才会被激发。在一个典型的实验中，我们记录了三到四个细胞和大约一到五个可检测的病毒粒子(图3). 只有在pH降低之前，两个通道（R18和EGFP）中都能清楚检测到荧光时，才考虑病毒。由于R18在酸诱导融合过程中重新分配到质膜中，因此在整个实验过程中，使用病毒核心蛋白EGFP-A4的荧光追踪单个病毒颗粒及其荧光。

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图3

典型微流体实验的图像。R18标记的WR EGFP-A4 MV在低温下与HeLa S3细胞结合。随后将细胞捕获在微流控室中，并在37°C下用TIRF显微镜进行检测。t=26 s时，PBS被MES/PBS（pH 5.0）取代。左栏显示了完整的视野（合并了两个通道）。在时间零点，由于R18和EGFP信号的共定位，很容易识别出单个病毒；单元格用虚线圆圈标记。其他列表示用粗体圆圈高亮显示的单元格的放大倍数。中间一栏显示EGFP-A4的荧光，右侧一栏显示相应的R18信号。箭头标记着两个正在融合的典型病毒粒子。当pH值降低时，观察到核心中的EGFP荧光以及pH传感器信号立即降低。几秒钟后（t=107秒），由于半融合和染料去淬，膜上的信号显著增加。实验结束时（t=339 s），一些病毒粒子部分恢复了核心的荧光，而R18分布在整个质膜上。

将微流体装置储液罐中的缓冲液从pH 7.4改为pH 5.0后，立即开始采集，持续约5分钟。缓冲液交换后约15秒，pH值为5.0的缓冲液到达视野。pH降低后，BSA-FITC微球和核心EGFP-A4的荧光强度立即下降。在使用的时间分辨率（3-4 s）下，我们无法观察到直接接触的BSA-FITC和病毒核心内膜包裹的EGFP-A4的荧光强度变化之间的任何滞后时间。稍后将更详细地讨论这一观察结果。经过一个滞后阶段后，绿色通道中的荧光强度损失后，病毒颗粒中R18荧光逐渐增加。R18荧光的增加是由于染料稀释到质膜中所致。尽管R18荧光的增加并不严格排除膜双层的两个小叶同时合并，但通常认为病毒融合涉及半融合中间体，这足以使R18去猝灭(28). VACV MV膜蛋白L1是酸诱导合胞体形成（从内部融合）所必需的事实(29)，但在正常感染过程中不用于R18去淬火(26)支持VACV融合的两步模型。因此，我们将VACV中R18去淬视为半融合的读数。当带有结合病毒粒子的捕获细胞保持在pH 7.4时，未观察到R18去淬现象(图S3).

单个病毒颗粒的半融合和脱淬率

为了分析单个融合事件，我们绘制了单个追踪病毒的R18荧光随时间的变化(图4 一). 我们计算了每个单个粒子的荧光增加，只考虑了荧光至少加倍的粒子（增加>100%；177个跟踪粒子中有33个）。接下来，我们提取了pH值变化和R18去猝灭开始之间的滞后阶段，即半融合(图4 b). 这揭示了在大体积聚变实验中未检测到的滞后相的意外异质性，在该实验中未观察到明显的滞后相。虽然大多数病毒在pH值下降后的8到24秒之间开始半融合，但pH值变化后的延迟期从几秒到77秒不等。

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图4

R18单一病毒颗粒的去淬。(一)使用中描述的实验装置获得的单一痘苗病毒的归一化R18荧光痕迹图3虚线是微接触型BSA-FITC的荧光，因此对应于pH值。pH值下降的时间设置为t=0 s(b和c（c）)滞后时间分布(b)和去淬速度(c（c）)所有测量的病毒颗粒（n=33）。

当R18标记的IAV X31与HeLa S3细胞的酸诱导融合在我们的微流控装置中被可视化为对照时(图S4)在半融合前也观察到明显的滞后期。

VACV融合过程中R18脱淬速率均匀(图4 c（c）)，但比单个病毒颗粒与SLB融合后通常观察到的速度慢得多(10,30). 在MV融合期间，R18荧光增强了约1分钟，然后达到平台，IAV融合发生了类似的动力学。脱淬速度预计主要取决于R18染料在细胞膜中的扩散，因此，R18脱淬可能遵循所有病毒颗粒的类似动力学。虽然在大多数情况下，照明区域外融合事件产生的R18荧光掩盖了单个病毒的荧光，但随后偶尔观察到R18荧光的消散（>200 s）。

半融合延迟期和R18去猝灭率与融合前检测到的R18荧光强度无关(图S5). 滞后期持续时间和R18脱淬速率也不相关(图S5)，表明所测量的性质不受结合到病毒膜中的R18的量的影响。由于用于选择要分析的融合事件的严格条件，未量化接受融合的MV的百分比。然而，应用条件与大块聚变实验中使用的条件相同。

含EGFP岩心酸化

在我们的所有实验中，我们观察到微流体装置中的pH值降低后，核心内的EGFP荧光迅速降低(图5 一). 这种减少之后，R18荧光增强，即半融合。在某些情况下，EGFP荧光恢复（另请参阅图5,b和c（c）).

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图5

融合孔开放后EGFP的恢复。(一)两个病毒粒子与质膜融合的时间序列，使用中描述的实验装置获得图3EGFP-A4信号(上排)pH值在时间零点下降后迅速下降，但在～100 s后开始恢复。R18信号(下排)在半融合过程中增加，在120s达到最大值，随后再次减少，可能是因为染料被稀释到了质膜中。病毒颗粒随细胞横向移动，表明它们没有与芯片表面结合。(b)归一化荧光示踪（R18，打开的符号; EGFP、，实体符号)病毒颗粒的一. (c（c）)pH降低后EGFP-A4荧光的典型归一化荧光曲线。荧光在一些病毒粒子中恢复，而在其他病毒粒子中仍然熄灭。两张图中的虚线表示pH传感器BSA-FITC的荧光，并指示pH值何时降低。

使用的GFP变体EGFP对pH敏感，具有明显的pK′_一在酸性pH值下，荧光强度的损失可逆转至pH值5.0(31). 因此，pH值下降后EGFP-A4的荧光强度降低可能与病毒核心的pH值降低有关。然而，观察到的核心EGFP猝灭令人惊讶，因为围绕病毒核心的脂质双层预计对质子高度不渗透。

由于R18荧光不会随着pH值的降低而降低，并且观察到的每个核心中的EGFP荧光都会降低，因此我们可以排除EGFP的荧光损失是由于病毒粒子移出焦平面所致。因此，我们假设VACV MV膜含有质子通道，可以沿着浓度梯度将质子传递到病毒内部。

固定化MV的pH-依赖性EGFP荧光

为了进一步研究核心酸化，我们设计了一个额外的实验来同时测量许多病毒颗粒的pH依赖荧光。我们使用了相同的微流体装置，但没有用BSA阻塞表面。然后将WR EGFP-A4 MV引入该装置，并在室温下培养，以便通过静电相互作用结合到玻璃底部。在一个焦平面中结合和获取多个病毒颗粒有几个优点：由于细胞移动，没有MV可以离开焦平面，缓冲区可以更快地多次交换，而不会丢失被捕获的细胞。由于没有记录到R18荧光，因此可以以较高的帧速率（2s）获取EGFP荧光。图S6显示了使用约100个病毒颗粒进行的典型实验。与之前一样，BSA-FITC被用作微流体装置中的pH传感器。我们观察到，通道中的pH值下降与MV中EGFP-A4荧光的强烈下降一致。由于在所有病毒颗粒中都观察到这种现象，因此由于膜上的缺陷，病毒粒子极不可能具有质子渗透性。当相同微流控装置中的pH值变回7.4时，EGFP荧光迅速增加。这表明EGFP的低氢猝灭是可逆的，质子可能会双向穿过病毒膜。

尽管病毒编码的质子通道多种多样，也不存在通用的质子通道抑制剂(32)两个无关的病毒离子通道IAV质子通道M2和丙型肝炎病毒阳离子通道p7对金刚烷胺敏感(33,34). 当WR EGFP-A4 MVs被预处理并保存在金刚烷胺或相关化合物金刚乙胺中时，我们观察到EGFP-A4荧光在低pH下仍然猝灭(图S7)表明质子流入VACV MV对金刚烷类抑制剂不敏感。

融合后单个病毒中EGFP-A4荧光的恢复

当在单病毒融合实验中跟踪含EGFP-A4核心的时间后，我们反复观察到EGFP荧光在半融合后有一定的延迟恢复。平均而言，EGFP在121秒后开始恢复，并在pH下降前达到荧光强度的36%(n个=8）。由于R18荧光同时被记录，并且没有表现出同等的变化，我们可以排除EGFP荧光的增加是由于病毒颗粒进入焦平面。由于EGFP的酸猝灭被证明是可逆的，当病毒核心内的pH值恢复到生理水平时，EGFP可能会恢复。当病毒核心在融合孔形成后进入宿主细胞胞浆时，预计会发生这种情况。由于细胞的膜电位和质子对浓度梯度的能量依赖性转移，细胞可能可以维持生理pH值，尽管周围是酸性的。细胞胞浆的体积比病毒的体积大几个数量级，可以缓冲病毒内部的酸性pH值。因此，EGFP荧光的恢复表明融合孔的形成是成功的。然而，由于EGFP-A4荧光的恢复相对较慢，我们不能排除病毒核心的中和作用有所延迟。这可能是由于病毒质子通道的持续活动所致。或者，VACV MV融合期间的半融合中间产物可能非常稳定。

我们感谢Ari Helenius（苏黎世联邦理工大学）的有益讨论，感谢Yohei Yamauchi和Sarah Stauffer（苏黎士联邦理工学院）在甲型流感病毒标签方面的帮助。感谢您使用光学显微镜中心（LMC，ETH苏黎世）和无尘室设施FIRST（ETH苏里世）。

这项工作由欧洲研究委员会（ERC启动拨款No.203428，nμLIPIDS授予P.S.D.，ERC高级研究员拨款No.232974授予Ari Helenius）资助，并由瑞士国家科学基金会Ambizione拨款（PZ00P3_131988）授予J.M。