金雀异黄素对大鼠睾丸生精功能恢复的影响

摘要

介绍

化疗药物或放射治疗导致的精子生成障碍已被确定为人类癌症治疗不可避免的副作用。以前使用大鼠模型的研究表明，通过使用GnRH激动剂治疗，辐射或化疗损伤的精子发生可以恢复[1-三]或拮抗剂[4-6]在之前服用[7,8]或之后[6,9]癌症治疗。GnRH类似物诱导的精子发生恢复的潜在机制之一是睾酮和卵泡刺激素的抑制[10-13]; 另一个最近提出的潜在机制是抑制睾丸内睾酮（ITT）水平[14]. 在正常条件下，高ITT水平对维持精子发生至关重要，而在化疗诱导的病理条件下，它们会抑制精原细胞分化。先前的研究发现，外源性雌激素通过抑制ITT刺激受照大鼠生精恢复[15].

然而，雌激素治疗的副作用，如男性乳房发育和心血管问题[16]是其临床应用的主要障碍。染料木素是一种植物雌激素（存在于植物中的一种雌激素样化合物），与雌激素受体结合[17-19]具有弱雌激素和抗雌激素作用[20]. 围产期暴露于低剂量植物雌激素会影响成年大鼠Leydig细胞的功能，导致睾丸睾酮分泌减少[21]. 此外，与雌激素不同，染料木素可以预防乳房[22,23]和前列腺癌[24,25]并表现出抗肿瘤活性[26-28].

在本研究中，我们研究了金雀异黄素对大鼠ITT水平、睾丸重量和生精恢复的影响，以评估金雀异黄酮临床应用的可能性。

方法

1.动物和药物

所有动物饲养和手术程序均按照韩国首尔MizMedi医院动物护理和使用机构委员会的指南（Miz-ani-IRB 20090715）进行。

共有150只雄性Sprague-Dawley大鼠被用于本研究，它们被维持12小时的光/暗循环，并被允许进食和饮水随意在实验开始前，所有大鼠均已适应环境至少7天，当时它们只有7周大。

首先将抗癌药物Busulfan（Sigma，St.Louis，MO，USA）溶解在100%二甲基亚砜溶液（8 mg/mL）中。在使用之前添加相同体积的蒸馏水，以获得最终浓度的白磺隆（4 mg/mL）。以25 mg/1 kg体重的剂量向大鼠腹腔内注射白消安溶液。当大鼠的体重为200 g时，给药5 mg（1.25 mL）白消安。

GnRH激动剂（亮丙瑞林）来自Dong-gook Pharmaceutical（韩国首尔）。通过将2.6 mg GnRH的小瓶悬浮在1.6 mL其溶剂中来制备GnRH注射液。向大鼠背部皮下注射0.65 mg GnRH溶液（0.4 mL）。

金雀异黄素购自LC Laboratories（Woburn，MA，USA），每天以50或100mg/kg的剂量口服给大鼠，口服唑烷4周（3周至7周）(图1).

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图1

实验设计示意图。150只大鼠平均分为5组。在第0周注射白消安，然后在第3周单次注射GnRH激动剂或口服金雀异黄素4周。用一氧化碳处死大鼠₂在实验第13周窒息，以评估睾丸内睾酮水平和睾丸组织学分析。

结果

1.睾丸重量

白消安治疗组的睾丸明显小于对照组。对所有组的睾丸进行双侧称重(图2). 与对照组（100%，3.49 g，第页<0.05). 通过GnRH激动剂或染料木素的额外治疗，用白消安治疗后睾丸重量部分恢复。GnRH激动剂和染料木素治疗组之间的睾丸重量没有差异。

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图2

金雀异黄素治疗对busulfan治疗后缩小睾丸重量的影响。CO处死所有动物₂实验第13周窒息。将两个睾丸从睾丸被膜中取出并称重。^{a、 b、c}每组不同上标的数字表示有显著差异(第页<0.05).

2.定性睾丸组织学

观察生精小管横截面，然后根据存在的生殖细胞层数分类如下：“恢复”（至少五层）、“半恢复”（三层或四层），“恢复差”（一层或两层）和“萎缩”（无生殖细胞）。对于每只大鼠，用这种方法评估了大约300个生精小管(图3).

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图3

根据存在的生殖细胞层数对化学损伤睾丸中的生精小管进行分类。睾丸固定在Bouin的固定剂中，脱水，然后用石蜡包埋。随后，制备5µm厚的连续切片，并用苏木精和伊红染色，以进行组织学评估。观察生精小管横切面，然后将其分为：（A）恢复期（星形，至少五层），（B）半恢复期（星状，三层或四层），，（C）恢复差（星形，一层或两层），以及（D）萎缩期（星形，无生殖细胞）。对于每只大鼠，大约300个生精小管以这种方式进行评估（×200）。

研究了金雀异黄素治疗对白消安治疗的生精小管恢复的影响(图4). 白消安诱导的细胞毒性导致高百分比的曲精小管萎缩（76.5%，第页<0.05），但通过额外使用GnRH激动剂（54.7%）或染料木素（40%至43%）治疗，该百分比显著降低。此外，使用GnRH激动剂（17.1%）、染料木黄酮（50 mg）（14.8%）和染料木黄酮100 mg）（22.6%）治疗的动物的“恢复”小管百分比显著高于白消安组（8.3%，第页<0.05). 组织学分析显示，布苏芬治疗大鼠的许多小管中没有可检测到的精子，也没有生殖细胞。尽管GnRH激动剂组和染料木素组之间的精子发生恢复没有显著差异，但100 mg染料木素似乎是恢复白消安损伤的曲细精管精子发生的最有效方法。

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图4

金雀异黄素治疗对白消安治疗的生精小管恢复的影响。通过分类生精小管的百分比，如恢复（至少5层）、半恢复（3或4层）、恢复差（1或2层）和萎缩（无生殖细胞），研究染料木素的作用。^{a、 b、c}每组不同上标的数字表示有显著差异(第页<0.05).

3.ITT水平

在实验第13周评估每克睾丸的ITT水平(图5). 白磺坦组的ITT水平显著高于对照组（365.1±277.3 ng/g，第页<0.05）比对照组（75.5±33.5 ng/g）。白芥多糖+促性腺激素释放激素激动剂（159.6±83.8 ng/g）和白芥多糖+染料木素（100 mg）（155.0±134.3 ng/g，第页<0.05）显著高于对照组。这表明，与GnRH激动剂治疗相比，50 mg和100 mg金雀异黄素治疗在抑制和维持ITT方面均有效。

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图5

金雀异黄素治疗对服用白消安的大鼠睾丸内睾酮（ITT）水平（ng/g）的影响。在实验第13周，将一个睾丸均质化，并使用T抗血清涂布管测定匀浆中睾丸上清液中的ITT水平。^{a、 b、c}每组中带有不同上标的数字表示显著差异(第页<0.05).

讨论

在本研究中，我们选择白消安作为化疗药物，因为它是一种有效的药物，优先杀死精原干细胞[29]与其他破坏分化精原细胞的化疗药物不同。服用白消安的大鼠的睾丸明显小于对照组，这与之前的研究结果一致[9]. busulfan处理后，生精小管的直径显著减小，这可能是生精细胞丢失的结果[9,30]. 通过使用促性腺激素释放激素激动剂或染料木素进行额外治疗，白藜芦丹诱导的睾丸重量减轻部分得以恢复。此前有报道称，白消安引起的这种损伤具有剂量依赖性和可逆性[31-33]; 然而，在本研究中，情况似乎并非如此。只有通过GnRH激动剂或染料木素的额外治疗，睾丸重量才显著恢复。

睾丸组织学分析显示，服用白消安的大鼠睾丸出现生精小管萎缩，其中不含明显的精子，也没有生殖细胞。这与之前的研究结果一致，尽管两项研究中“恢复”和“萎缩”小管的百分比有所不同。通过GnRH激动剂的额外治疗，白消安的细胞毒性显著降低，导致生精小管中精子发生的部分恢复。已有报道称，GnRH激动剂对使用白消安治疗的睾丸生精恢复的影响[9].

虽然还没有关于染料木素对白消安细胞毒性的影响的报告，但我们在此观察到，染料木素治疗也显著降低了白消安的细胞毒性，并诱导了精子发生的恢复。染料木素是一种与雌激素受体结合的植物雌激素（一组天然选择性雌激素受体调节剂，非甾体，双酚结构，存在于许多植物中，尤其是大豆制品中）[17-19]具有与内源性雌激素相似的生理特性[19,34]. 研究发现，照射后单独雌激素治疗可促进生精恢复[15]此外，它刺激了GnRH拮抗剂诱导的辐照大鼠生精恢复[35,36]. 这些报告支持并解释了我们的发现，即染料木素治疗可刺激化疗药物治疗大鼠的精子发生恢复。

人们注意到，辐照或化学处理后ITT水平升高，这表明过量ITT对精子发生有害。促性腺激素释放激素类似物通过向上和向下调节中断垂体-性腺轴，从而抑制ITT水平[9]. 在本研究中，我们观察到染料木素也能有效抑制ITT水平。金雀异黄素具有与雌激素相似的特性，作用于Leydig细胞，下调参与ITT生物合成的类固醇生成酶[37]作用于负反馈，降低FSH和黄体生成激素水平，从而降低睾酮水平[38]通过下调雄激素受体的表达[39]. 因此，金雀异黄素治疗可能抑制ITT水平并刺激化疗药物治疗的大鼠的精子发生。

在细胞毒药物损伤的大鼠睾丸中，ITT水平受到良好抑制从而刺激精子发生的机制尚未建立。高水平ITT可能有害精子发生的一个潜在机制是干细胞因子（SCF）表达模式的改变[10]. 有人认为，抑制ITT会诱导支持细胞表达更多膜结合SCF，这对精子发生至关重要。我们计划研究染料木素对SCF表达的影响。

预计将开发实用的激素治疗方案，帮助患者在化疗后恢复生育能力。然而，睾丸对放疗和化疗、GnRH类似物或两者的反应可能存在物种差异，因此在啮齿动物中成功的救援方案可能在灵长类动物中不起作用[40,41].

总之，我们观察到金雀异黄素有效地抑制了ITT水平，并刺激了化疗药物治疗大鼠的精子发生恢复。染料木素是一种植物雌激素，比雌激素更天然，副作用更少。这使得金雀异黄素成为GnRH类似物和雌激素的候选替代品，有助于人类癌症治疗后恢复生育能力。需要进一步研究以确定染料木素的作用是否存在物种差异。

脚注

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