介绍
表观基因组的协调变化对于谱系规范和维持细胞特性至关重要。DNA甲基化（DNAme）和某些组蛋白修饰对染色质结构和基因表达程序的表观遗传维护起着关键作用(周等。, 2011;Smith和Meissner，2013年)。组蛋白甲基转移酶和催化活性DNA甲基转移酶的基因缺失是胚胎或出生后致命的(李，2002)为他们在正确执行发展计划中的重要作用提供证据。
一些研究小组报告了多能干细胞和分化细胞类型中染色质和DNA甲基化的全基因组图谱。通过这些努力，体系结构和调控动态的全球图景开始显现。例如，活性启动子通常含有修饰物，如H3K4me3和H3K27ac，而活性增强子通常富集于H3K4me1和H3K27ac(海资曼等。, 2009;克雷格顿等。, 2010;恩斯特等。, 2011;拉达·伊格莱西亚斯等。, 2011)。抑制位点对H3K27me3、H3K9me2/3、DNAme或后两种修饰的组合表现出富集。抑制性组蛋白修饰的富集，如启动于CpG岛（CGI）的H3K27me3，被认为是一种兼性抑制状态，而DNAme通常被认为是更稳定的表观遗传沉默形式(Smith和Meissner，2013年).
最近的研究报告了表明表观遗传启动的动力学，例如在基因激活前常染色组蛋白修饰的出现体外T细胞分化(张等。, 2012)和心脏分化(瓦姆斯塔德等。, 2012)。这些结果让人联想到在重新编程的早期阶段发生的向诱导多能状态转变(科什等。, 2011)并强调分化和去分化之间可能存在的相似性。与这些进展平行的是，全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）已被用于绘制DNAme全基因组。对来自小鼠ESCs（mESCs）和神经前体细胞的WGBS数据的检查显示，远端位点的低甲基化区域（LMR）经常与DNAse I超敏位点（HS）重叠，并/或显示H3K4me1和p300富集定义的增强子特征(斯塔德勒等。, 2011).
研究表观遗传修饰在人类转录程序动态重组中的作用体内由于许多技术和道德限制而变得复杂。然而体外hESCs的分化提供了一个独特的机会来探索和描述准备、指导和可能调节细胞命运决定的关键事件。代表每个胚胎生殖层的种群是由胚胎干细胞产生的(克里克斯等。, 2011;陈等。, 2012;世界环境学会等。, 2012).
为了剖析hESC规范化期间的早期转录和表观遗传事件，我们使用了hESCs的二维定向分化，从三个胚层（即外胚层、中胚层和内胚层）产生具有代表性的种群(海伊等。, 2008;伊夫申科等。, 2010;李等。, 2010)然后进行荧光激活细胞分选（FACS），以富集所需的分化群体。除未分化的hESC（HUES64）外，这三种细胞类型还接受了ChIP-Seq 6种组蛋白标记（H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3、H3G27ac、H3K16me3和H3K9me3）、WGBS和RNA-Sequencing（RNA-Seq）。为了补充这一数据，我们还对未分化hESCs中的三种TF（OCT4、SOX2、NANOG）进行了ChIP-Seq，并对内胚层人群中的FOXA2进行了ChIP-BS-Seq。组合的数据集提供了丰富的信息，包括转录和表观遗传学动力学的整体观点，有助于进一步剖析人类生殖层规范过程中的分子事件。
结果
hESCs定向分化过程中的高分辨率转录测量
为了更好地理解与人类胚胎干细胞分化有关的分子动力学，我们制作了代表每个胚胎胚层的群体，即外胚层(李等。, 2010)，中胚层(伊夫申科等。, 2010)和内胚层(海伊等。, 2008)（请参见扩展实验程序)。我们选择了雄性hESC株系HUES64，这是一个NIH批准的株系，可以很容易地分化为三个胚层中的每一层。通过抑制TGFβ、WNT和BMP信号，这些hESC可分化为SOX2和PAX6阳性的神经外胚层样祖细胞群(，顶部)。或者，典型中胚层标记，如GATA2(，中间的)，可以使用ACTIVIN A、BMP4、VEGF和FGF2治疗诱导。最后，分化为明确的内皮样命运，标记物SOX17和FOXA2阳性(，底部)使用ACTIVIN A和WNT3A诱导。
人胚胎干细胞及其衍生细胞类型的产生和表征A.左侧用OCT4（POU5F1）和NANOG抗体染色的未分化人类胚胎干细胞（hESC）系HUES64的低倍（4倍）和高倍（40倍）重叠免疫荧光图像。正确的：利用建立的定向（二维）分化条件生成三个胚胎胚层的代表性种群：hESC衍生的外胚层、hESC派生的中胚层和hESC导出的内胚层。细胞在分化5天后用所示抗体进行固定和染色。显示了低（10倍）和高（40倍）放大率下的典型叠加图像。所有图像中的DNA均用Hoechst 33342染色。比例尺=200µm（4×）、100µm。
B。NanoString n计数器表达式数据（z-score日志2两个生物复制品的表达值）体外使用面板中显示的条件进行区分A类共分析了.541个基因，显示了268个变化超过0.7的基因。左侧显示了根据层次聚类确定的每个类别的选定谱系特异性基因（参见表S1所有人）。平均日志2显示了两个生物复制品的表达值。误差条表示一个标准偏差（SD）。
C。平均日志2图B显示了谱系特异性基因的两个生物复制品的表达值。误差条代表一个SD。如果没有明显的错误，SD<0.5 log2表达式单位。
D类.平均日志2图B中显示了多能基因的两个生物复制品的表达值。误差条代表一个SD。如果没有明显的错误，SD<0.5 log2表达式单位。
E。NanoString-FACS分离的外胚层（dEC）、中胚层（dME）和内胚层（dEN）的计数器图谱。的表达式级别MYOD1年(正确的)作为阴性对照。平均日志2显示了两个生物复制品的表达值。误差条代表一个SD。如果没有明显的错误，SD<0.5 log2表达式单位。
F、。HUES64和dEC、dME和dEN的生物复制物的特异性RNA-Seq测量的全球基因表达谱的层次聚类显示为树状图。使用Jensen-Shannon距离度量法测量重复之间的成对距离。
G.公司。图中显示了HUES64中表达（FPKM>1）的独特和重叠基因以及FACS分离的定向分化条件。
H。差分拼接DNMT3B公司响应定向分化。亚型1的相对表达({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_006892”，“术语id”：“1653962091”}}NM_006892号，绿色）和3({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_175849”，“term_id”：“1676317859”}}NM_175849，紫色），如右侧所示。
另请参见
图S1
我们首先测量了541个选定基因的表达，包括许多发育转录因子和谱系标记(博克等。, 2011)在向各胚层分化的过程中，每隔24小时。我们发现其中268个基因表现出表达变化（z-score log2表达）在分化的前五天()。中胚层基因，例如EOMES、T、FOXA2公司和GSC公司，在中胚层和内胚层诱导24小时时上调，但不上调外胚层分化(，表S1).GSC公司在中胚层样种群分化后48小时内表达减少，而内胚层种群的表达水平保持不变().EOMES公司和FOXA2公司在内胚层人群中也保持表达，伴随着GATA6、SOX17和HHEX公司()。在肠系膜标志物短暂上调后，中胚层标志物如GATA2、HAND2、SOX9和TAL1（目标1）在中胚层条件下检测到(，表S1)。这些标记物在早期外胚层分化期间均未检测到，相反，外胚层的分化上调了神经标记物，如PAX6，SOX10和EN1公司(，表S1).
我们发现了POU5F1（10月4日），NANOG公司在某种程度上SOX2标准在我们的内胚层种群中保持表达(，表S1)。这与先前的研究一致，这些研究表明OCT4和NANOG表达在早期内皮分化过程中检测到，并支持NANOG在内皮规范中的建议作用(Teo等人，2011年).SOX2标准表达在中胚层下调，在内胚层下调程度较小，但在外胚层维持在较高水平（log2表达10.9）(，表S1)，同时采埃孚42（REX1）在所有三个谱系中同样下调(，表S1)。我们通过诱导它们进一步分化，确认了这些种群确实代表了每个谱系的前体阶段，这导致了基因的上调，例如奥利2和不锈钢在外胚层(钱伯斯等。, 2012),TRPV6型在中胚层(伊夫申科等。, 2010)、和法新社和HGF公司在后期的内胚层种群中(图S1A) (DeLaForest公司等。, 2011)。最后，多维尺度分析证实，在24小时内，中胚层种群与内胚层非常相似，而外胚层种群已经向另一个方向移动(图S1B)。这些高时间分辨率的基因表达特征表明，与三个独特的细胞群体相关的表达程序，代表每个生殖层的早期阶段，是在类似的hESC分化时间框架内建立的。
hESCs和hESC衍生细胞类型之间的全局转录动力学
基于这些结果，我们选择第五天作为最佳时间点，以捕捉代表所有三个胚层的分化良好人群的早期调控事件。为了减少异质性，我们基于先前报道的表面标记，使用FACS来丰富种群(图S1C)；FACS分离出的种群被称为外胚层的dEC、中胚层的dME和内胚层的d EN。对分类种群的表达分析证实了对所需种群的进一步富集(，表S1).
接下来，我们通过对每天5个分化的FACS分离群体和未分化的HUES64的poly-A组分进行链特异性RNA-Seq来扩展我们选择的基因特征图谱(表S2)。基于每种细胞类型的全局表达谱的层次聚类显示，dME群体是最为相关的细胞类型，dEN和dEC彼此之间的相似性大于dME或hESCs()。这是意料之外的，因为dME和dEN种群可能是通过共同的肠系膜前体阶段衍生而来的(，表S1)而dEC没有上调与该阶段相关的标记(EOMES、T、GSC；
表S1)。总的来说，至少一个群体中表达了14196个RefSeq定义的编码和非编码转录物（约占定义转录物的38%）（FPKM>1），所有三个群体中都表达了11579个（占我们细胞类型中检测到的转录物总数的81.6%）。检查每个群体中表达的基因重叠（FPKM>1）表明，dME群体表现出最大数量的独特基因表达（n=448，)，例如运行NX1（FPKM:3.4）和手动2（FPKM:17.8）。研究一对分化细胞类型特有的基因也表明，dEC和dME的共同点最少（n=37，)而dEC和dEN有最多的共同转录本（n=171，)与我们的聚类分析一致。基因，如PAX6（dEC FPKM:25.9，dEN FPKM:5.6）和NKX6.1标准（dEC FPKM:2.3，dEN FPKM:3.3），这是两个大脑都需要的(埃里克森等。, 1997)和胰腺发育(砂光机等。, 1997)，用dEC和dEN表示。胚胎发育的典型标记，如FOXA2公司dEN中的（FPKM:12.7）和EN1公司（FPKM:5.8）在dEC中仅限于我们早期阶段的预期胚层(表S2).
值得注意的是，我们还确定了1296个剪接事件（FDR=5%）以及我们人群中的替代启动子用法(表S3) (Trapnell公司等。, 2013)。例如，我们检测到多种亚型的表达DNMT3B公司（p=5×10−5)。的表达式DNMT3B公司亚型1({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_006892”，“术语id”：“1653962091”}}NM_006892号)仅限于未分化的hESCs（FPKM:214.3），而分化的细胞类型主要表达另一种亚型，DNMT3B公司亚型3({“类型”：“entrez-notide”，“属性”：{“文本”：“NM_175849”，“term_id”：“1676317859”}}NM_175849)（dEC FPKM:33.9，dME FPKM:14.2，dEN FPKM:20.0）()。这种亚型以及其他亚型的存在，以前曾在胚胎发育的更高级阶段和正常成人中报道过(罗伯逊等。, 1999)和癌组织(奥斯特勒等。, 2007)。我们的研究结果表明，无论特定的谱系如何，这种转变都与多能状态的退出相吻合。我们还发现了三个PITX2亚型，具有差异剪接导致dEN和dME之间的不同亚型表达(表S3)。在小鸡体内PITX2对心脏循环至关重要，每个亚型负责执行不同的功能(于等。, 2001)。综上所述，这表明转录水平和亚型表达都有助于细胞特性。
综合参考表观基因组图谱的生成
为了更全面地了解潜在的分子动力学，并研究三个胚层规范化期间的调控事件，我们收集了大约1200万个分别属于dEC、dME和dEN群体以及HUES64的细胞。所有样本均进行了ChIP-Seq（H3K4me1、H3K4me3、H3K27me3、H3G27ac、H3K16me3和H3K9me3）和全基因组亚硫酸氢盐测序（WGBS）()共生成32个数据集，超过120亿次对齐读取（数据可通过NIH路线图表观基因组学项目数据存储库公开获取：网址：http://www.roadmappegenomics.org/，表S4).
表观遗传重塑在定向分化过程中具有世系特异性A类未分化人胚胎干细胞系HUES64三个位点的WGBS（甲基化%）、ChIP-Seq（读计数标准化为1000万读）和RNA-Seq（FPKM，读计数标准）：NANOG公司（chr12:7935038-7957818），GSC公司（chr14:95230449-95250241），以及H19型（chr11:2015282-2027359）。CpG群岛（CGI）以绿色表示。
B。在至少一种细胞类型（hESC、dEC、dME、dEN）和/或在至少一个细胞类型（n=297617）中分类为UMR或IMR的基因组区域的大小分布因我们的6种组蛋白修饰中的至少一种而丰富。
C。本研究中使用的表观遗传状态的定义以及它们在所研究的四种细胞类型中所占的基因组空间。
D。小组中定义的不同表观遗传状态基因组区域的CpG含量中位数C类.
E类.本研究中使用的表观遗传状态的中位数表达水平(C类)基于将每个区域分配给最近的RefSeq基因。计算所有四种细胞类型的状态和相应的表达谱的中位数。
F、。在至少一种细胞类型中富集五种组蛋白修饰之一的区域的表观遗传状态图，或在至少一个细胞类型中分类为UMR/IMR，并在至少一类细胞分化时改变其表观遗传状况（n=157433）。状态定义列在面板中C类.
G.公司。由NANOG、OCT4、SOX2结合的区域，由ChIP-Seq确定，并使用染色质状态组织2楼.
H。OCT4、SOX2和NANOG在不同类别的动态基因组区域中的富集随人胚胎干细胞分化而变化，相对于其他细胞类型中表现出特定表观遗传状态变化的所有区域进行计算。表观遗传动力学分为三大类：抑制（H3K4me3或H3K4me1的丢失和H3K27me3或DNAme的获得）、开放染色质标记的维持（H3K4me3、H3K4-me1、H3K27ac）和先前抑制状态的激活。
另请参见
图S2.
表观遗传状态转换的综合分析
完成基本质量控制后（参见扩展实验程序和表S4)，我们将分析重点放在先前确定的与各种调节元件相关的信息染色质状态上(恩斯特等。, 2011;拉达·伊格莱西亚斯等。, 2011)，包括以下特定组合：H3K4me3+H3K27me3（二价/平衡启动子）；H3K4me3+H3K27ac（活性启动子）；H3K4me3（启动子）；H3K27me3+H3K4me1（平衡发育促进剂）；H3K4me1（平衡增强子）、H3K27ac+H3K4me1（活性增强器）；H3K27me3（多梳重压）和H3K9me3（异染色质）。此外，我们将WGBS数据分为三种DNAme状态：高度甲基化区域（HMR:>60%）、中度甲基化区域[IMR:11-60%]和非甲基化区域[UMR:0-10%]。后者不同于基因组的高度甲基化背景，可能表明功能重要性，如前所述(斯塔德勒等。, 2011)。接下来，我们将每个基因组区域指定给一个结果状态(图S2A，请参阅扩展实验程序详细信息）。
在四个细胞群体中，我们鉴定了268062个基因组区域，跨度从400个碱基对（bp）到10个千碱基（kb）()总长度为450058678 bp（占人类基因组的18.6%）()在8种染色质状态中富集了至少一种和/或在至少一种细胞类型中分类为IMR或UMR。在已确定的表观遗传状态中，H3K27me3富集区和HMR覆盖了大多数碱基对()H3K4me3和H3K27me3组合的CpG含量最高()，正如预期的那样，H3K27me3与高CpG密度之间存在密切联系(库伊等。, 2008)。大多数表观遗传动态区域并不位于启动子附近（TSS-启动子的6.8%+2kb至−500bp；TSS-间基因上游的48.8%>50kb；TSS--内基因/基因体下游的15.1%>500bp）(图S2B)。正如预期的那样，开放染色质区域显示出最高的中间表达值()。然而，总的来说，我们发现大多数（62-67%）的表观遗传重塑事件与最近基因表达的转录变化没有直接联系。
H3K4甲基化（me1和me3）的缺失通常与向高DNAme过渡有关()在dEN人群中最为突出，优先从神经发育相关基因中消除（即神经管发育q=9.6×10−12)。我们在人胚胎干细胞中鉴定出4639个近端二价结构域，并观察到其中3951（85.1%）个结构域在至少一种人胚胎干公司衍生的细胞类型中解析其二价状态(，图S2C)。当我们专门研究TF编码基因的启动子时，我们发现其中463个启动子在人胚胎干细胞中处于二价状态，其中400个启动子至少在一种分化细胞类型中发生改变(图S2D)。大多数仅以谱系特有的方式过渡到H3K4me3或H3K27me3，如下图所示ISL1系统(图S2E)。在dME中，H3K4me3是在ISL1系统H3K27me3基因缺失，导致表达（FPKM:14.3）。鉴于该基因在所有三个胚层中都有已知的作用，尽管在以后的时间点，该区域的谱系特异性动力学很有趣(Pfaff公司等。, 1996;阿格伦等。, 1997;蔡等。, 2003)。值得注意的是，与许多表观基因组动力学和表达变化之间有限的整体关联相反，我们发现这些二价TF（275）的很大一部分在分化过程中改变了其表达水平(图S2D).
多向TF结合与分化过程中的染色质动力学有关
为了进一步探索退出多能性期间染色质动力学的潜在调节器，我们对HUES64中的OCT4、NANOG和SOX2进行了ChIP-Seq(图S2F和G)。我们发现，由所有三个因子（n=1556）、仅由SOX2（n=923）或仅由NANOG（n=14531）结合的区域经常与基因间和基因内区域相关(图S2H–S2J，顶部)。相反，仅与OCT4结合的区域（n=8599）更频繁地与启动子区域相关(图S2H)。对hESCs中OCT4、NANOG和SOX2结合区域的检测表明，OCT4结合位点富集的H3K4me1区域在所有三种分化细胞类型中经常成为HMR，而NANOG与SOX2位点在dME中更容易转变为HMR状态()。一般来说，与dME和dEC相比，许多与NANOG结合的开放染色质相关的区域更有可能在dEN中保持这种状态()。我们还发现，在dEN或dEC中维持这种状态的hESCs中富集H3K27ac的区域可能被SOX2和NANOG结合。这与报道的SOX2在外胚层发育和分化中的作用一致(王等。, 2012)，但也支持我们的观察，即SOX2表达保持在dEN中。基序富集分析检测到OCT4和SOX2结合的区域中的GATA3基序在dEC中转变为活性状态。此外，我们发现OCT4、NANOG和SOX2s结合的区域在dEC获得活性标记后，PAX9、p63和STATs基序富集(表S5)。研究OCT4、NANOG和SOX2结合位点的表观遗传动力学进一步支持了以下观察，即一些与多能性相关的TF也参与下游规范。
DNAme在富含TF基序的开放染色质中获得
接下来，我们利用了WGBS数据，该数据涵盖了所有四种细胞类型中约2600万CpG（覆盖率≥5）。对WGBS数据进行的层次聚类分析（包括用于比较的成人肝脏和海马）表明，多功能性hESC和hESC衍生细胞类型相对于体组织形成单独的簇臂().
全球DNA甲基化动力学——DNAme A的获得A。使用皮尔逊相关系数（PCC），基于人类基因组中1kb片段的平均DNAme水平，对hESCs、hESC衍生人群（dEC、dME和dEN）、人类成年海马和人类成年肝脏进行分层聚类。Y轴表示以1减去PCC表示的样本距离。红色方框表示本研究中询问的细胞类型。
B。在hESCs和分化细胞类型之间，显著（p≤0.05）增加DNAme水平至少0.1的区域。色码表示hESCs中的DNAme状态。底部：基于RefSeq基因注释和RNA-Seq从头发现的启动子，与DMR在每种分化细胞类型中获得DNAme相关的基因组特征。
C。这些差异甲基化区域（DMR）的重叠增加了三个hESC衍生群体中的DNAme水平。
D。DNAme水平和RNA-Seq表达值FOXA2公司（chr20:22559343-22571189）。下图显示了高亮区域内单个CpG的DNAme值。右侧以红色显示整个高亮显示区域的平均DNAme值。CpG岛（CGI）以绿色条显示。表达式值（FPKM）显示在右侧。箭头表示两个已知的TSS。
E.公司。DNAme水平和OCT4、SOX2和NANOG ChIP-Seq数据库X1基因座（chr11:20169548-20277940）。
F、。远端元件（左）和启动子（右），通过相关基因FPKM的变化分离获得DNAme。
G.公司。在分化过程中获得DNAme的区域，hESCs中的染色质状态。没有检测到染色质标记的区域根据其在胚胎干细胞中的DNA甲基化状态进行分类。
另请参见
图S3.
我们确定DMR在我们的四种细胞类型中表现出0.1的CpG甲基化水平的显著（p≤0.05）最小差异。与以前的报告一致，大多数DMR发生在CpG-缺乏的基因间区域(，底部) (Stadler等人，2011年)。与dEC和dME相比，dEN显示获得DNAme的区域数量是其两倍以上(，顶部)。有趣的是，在所有三个群体中，只有65个DMR是共享的。然而，这组DMR包括OCT4的调节区，再次证实了我们的人群中缺乏多能干细胞(图S3A)。与少数共享区域一致，超过60%的获得DNAme的区域具有谱系特异性()并且包括基因座，例如座椅模块组件3（dEC），CTNNA3型（dME）和FOXA2公司（dEN）。FOXA2公司上游CGI显示DNAme增益()dEN中的转录在DMR下游的替代TSS处启动，表明TSS的使用可能由DNAme调节、稳定或反映(毛纳卡等。, 2010).
我们发现分化后作为DNAme靶点的各种TF基序显著富集(表S6)，这与在淋巴谱系中的髓系靶点观察到的甲基化增加类似体内(季等。, 2010;迪顿等。, 2011;博克等。, 2012)。为了扩展这一观察，我们检测了hESCs中SOX2、OCT4和NANOG结合区域的DNAme状态。例如数据库X1是一个与早期神经规范相关的基因，与所有三种TF结合，并在dME和dEN中获得DNAme。相反，该区域在dEC中保持低水平的DNAme，它激活了数据库X1()。我们通常发现共结合位点在dME和dEN中获得DNAme，但在dEC中没有(图S3B)。进一步支持这些动力学的功能相关性，我们发现具有增益DNAme的区域经常与DNAseI超敏位点一致(图S3C) (瑟曼等。, 2012)。而转录沉默很少与远端元件的DNAme增益相关(，左边)，在dEC和dME中获得DNAme的启动子与预期的表达减少相关(，正确的).
在检测分化过程中获得DNAme的区域的染色质状态时，我们发现大多数区域在hESCs中表现出一个或多个组蛋白修饰的富集()。这些结果证实，特别是远端调控元件在规范期间显示出DNA甲基化的高度动态调控。
DNA甲基化缺失倾向于dEC
DNAme的缺失在三个种群之间是不对称的(，顶部)并以比增益更具血统特异性的方式发生()。然而，损失也主要发生在基因间区域(，底部和，底部)。值得注意的是，dEC具有最多的DMR，许多与神经元基因类别相关（例如：神经管发育，q=3.13×10−13)。这包括外胚层TFPOU3F1，在人胚胎干细胞中有一个二价启动子，可分解为H3K4me3-唯一状态(图S4A)并在dEC中显示转录激活(表S2)。该基因座的染色质重塑和激活与dEC中该基因3’UTR下游的假定调节元件DNAme的特异性缺失相一致()。在全球范围内，DNAme缺失与表达之间的直接对应关系，如在POU3F1，发生在大约一半的地区()。在分化过程中丢失DNAme的DMR中，有70%以上的DMR因我们的组蛋白修饰而富集，尤其是H3K4me1或H3K27ac().
全球DNA甲基化动力学-DNAme损失A。在hESCs和分化细胞类型之间，显著（p≤0.05）降低DNAme水平至少0.1的区域。色码表示DNAme状态在分化细胞类型中的分布，表明大多数区域在失去DNAme后仍处于IMR状态(左边)。基于RefSeq基因注释和从头开始通过RNA-Seq发现启动子。
B。在三个hESC衍生人群中降低其DNA甲基化水平的已识别DMR的文氏图。
C。DNAme在POU3F1基因座（chr1:38493152-38532618）。下面的热图显示了灰色区域内单个CpG的DNA甲基化值。右侧以红色显示整个高亮显示区域的平均DNAme值。CGI以绿色条显示。表达式值（FPKM）显示在右侧。
D。获得DNAme的启动子（左）和远端元件（右）由相关基因的FPKM变化分开。
E.公司。分化过程中DNA缺失区域分化细胞类型中的染色质状态。
另请参见
图S4.
综上所述，我们的人胚胎干细胞分化系统揭示了几个有趣的DNAme动力学，包括默认或替代谱系中调控区域的谱系特异性沉默。不对称丢失也可以解释为什么我们的染色质状态分析显示在dEC人群中获得H3K4me3的区域较少。
H3K27ac的增益揭示了推测的监管因素
除了H3K4上的甲基化外，开放染色质也通过H3K27ac的富集来划分。也有人认为，H3K4me1和H3K27ac在远端区域的组合识别活性增强子元件，而H3K4me1和H3K27me3对应于平衡增强子元件(拉达伊格莱西亚斯等。, 2011)。为了扩展这些观察，我们特别关注分化过程中获得H3K27ac的区域，并发现超过一半的已识别区域是hESCs中的HMR()而另一大组分在hESCs中富集H3K4me1()。获得H3K27ac的大多数区域是基因间的(图S5A)，如所示运行NX1轨迹().
H3K27ac动力学标定新的世系特异性基因调控元件A。在三个种群中，正在向H3K27ac过渡的区域的hESCs中的区域数量和相关的表观遗传状态分布。
B。标准化ChIP-Seq轨道（H3K4me1、H3K27me3和H3K17ac）运行NX1区域（chr21:36091108-36746447），在dME中具有相应的RNA-Seq数据。
C。与GREAT分析确定的人胚胎干细胞相比，右图所示细胞类型中过渡到H3K27ac的区域富集了GO类别。获得H3K27ac的区域根据人胚胎干细胞的起源状态分为受抑制区域（None，IMR，HMR，HK27me3），稳定区域（H3K4me1/H3K17me3）和开放区域（H4K4me3/H3K24me3，H3K4me3，H3K4me1）。色码表示类别丰富的多次测试调整后的q值。
D。与人胚胎干细胞相比，右侧所示细胞类型中TF基序在H3K27ac区域富集。色码表示基序富集分数，包括背景总富集以及相应转录因子在相应细胞类型中的差异表达。区域在hESCs中按起源国进行划分，类似于面板C类对于每个地区类别，显示了八个最高等级的图案。
另请参见
图S5.
接下来，我们根据其在人类胚胎干细胞中的状态将每个区域分为三个不同的类别（抑制、稳定、开放），然后使用GREAT工具箱进行基因集富集分析() (麦克莱恩等。, 2010)。该分析揭示了与dEC和dME的谱系特异性分化轨迹一致的增强子动力学()。相反，dEN群体显示早期神经元基因意外丰富（例如神经管发育、，)。该观察结果与我们报告的dEC和dEN RNA-Seq数据之间的相关性一致，表明在我们的外胚层和内胚层规范的早期阶段诱导了类似的网络(范·阿伦斯贝根等。, 2010).
此外，我们发现dME中TGFβ、VEGF和BMP通路的下游效应基因大量富集，直接反映了被刺激诱导各自分化的信号级联。在dEN中，我们发现WNT/β-CATENIN和维甲酸（RA）信号传导相关基因的富集()。虽然我们没有使用RA，但这种信号级联在内胚层组织发育中有牵连，包括咽和胰腺细胞类型(温岭等。, 2000;奥斯特罗姆等。, 2008)。同时，我们也发现SMAD3基序在被抑制的dME和dEN中高度富集，特别是在稳定的假定增强子群体中()。同样，我们观察到关键谱系特异性TF基序的富集，例如dEC中的ZIC家族蛋白、dME中的TBX5和dEN中的SRF。有趣的是，我们还发现FOXA2基序在因子活跃的dEN和因子不活跃但在神经分化后期表达的dEC中高表达(克里克斯等。, 2011)，但不在dME中().
在没有转录激活的情况下获得H3K4me1表明表观启动
在hESCs中许多区域表现出高DNAme并在一个谱系中过渡到H3K4me1，这两种替代细胞类型中仍然存在HMR(，)。与分化过程中显示动态DNAme的区域相似，这些区域通常是基因间的，距离最近的TSS大于10kb()。对这些区域的GREAT分析显示，与大脑发育相关的类别非常丰富，如dEC中的小脑形态发生（q<10−30)，转化生长因子β通路靶点（q<10−10)dME和dEN中EMT的抑制（q<0.0001）。为了了解在我们的系统中获得H3K4me1的区域是否与体细胞身份相关，我们利用了24个人类组织的已发表微阵列数据，并确定了这些组织中与hESCs相关的上调基因（称为组织地图集，参见扩展实验程序)。重申我们动力学的相关性，我们发现dEC中获得H3K4me1的区域与胎儿大脑和成人大脑中发现的特定细胞类型有关()基于与其最近基因的区域关联。dME H3K4me1模式与一系列被询问的组织相关，如心脏、脊髓和胃，这可能是由于收集的组织的异质性所致()。dEN关联很有趣，因为与RNA-Seq和H3K27ac趋势一样，H3K4me1再次与脑相关类别相关().
H3K4me1在推测的远端调控元件上的动力学表征A。在三个分化人群中获得H3K4me1的区域与人胚胎干细胞相关的重叠。
B。在三个分化群体中的至少一个群体中，与hESCs相比，获得H3K4me1的所有区域的基因组分布。
C。底部显示的分化群体中特定获得H3K4me1区域的基因的组织特征富集水平。有关组织特征码的定义，请参见扩展实验程序.
D。分化群体中分配给获得H3K4me1区域的基因表达变化的数量和分布。相关基因被分类为相对于人类胚胎干细胞上调/下调或不变。
E.公司。标准化ChIP-Seq轨道（H3K4me1和H3K36me3）低分子氧化合物基因座（Chr.11:33865134-33977858）。y轴上的读取计数是每个单元类型的1000万次标准化读取。CGI以绿色表示。
F、。标准化ChIP-seq轨迹（H3K4me1和H3K36me3）CYP2A6/CYP2A7地区（Chr19:41347260-41395599）。y轴上的读取计数是每个单元类型的1000万次标准化读取。CGI以绿色表示。
G.公司。在底部所示的分化细胞类型中，前15个基序富集在特定过渡到H3K4me1的区域的标准化基序富集分数。以红色突出显示的基序对应于在内胚层分化的下一阶段（成肝细胞）上调的TF，而以绿色突出显示的模序在dEN中特异上调，但在dHep阶段下调。
H。与hESC相比，分配到dEN中特异性获得H3K4me1的区域的基因表达水平在dEN中上调，但在肝母细胞中上调(顶部)。底部显示了在dEN和dHep之间上调的基因表达水平（但在hESC和dEN之间没有上调）以及在dEN中获得H3K4me1的基因表达。
我dEN中变为H3K4me1并在人类肝脏中富集H3K27ac的区域分数（n=1346）。
另请参见
图S6.
总的来说，获得H3K4me1的基因中只有不到一半的基因表现出即时的转录变化().CYP2A6系列和CYP2A7型()是没有显示表达式相应更改的代表性示例，而低分子氧做()。为了更详细地研究这些区域，我们进行了基序富集分析，发现在获得H3K4me1的区域附近TF基序的谱系特异性富集。虽然FOXA2基序在所有三种细胞类型中都丰富，但DBX1基序与dEC中H3K4me1的增益相关()与该细胞类型中的转录激活相一致（FPKM:5.36）。相反，GLI3、HIC1和CTF1基序在dEN中获得H3K4me1的区域强烈富集().
为了进一步评估此DNAme到H3K4me1的转换是否作为启动事件，我们在BMP4和FGF2存在的情况下，将HUES64内胚层人群再分化五天，从而产生HNF4α阳性的肝母细胞样（dHep）细胞(表S2，图S6A)。有趣的是，在富含dEN的基序中，获得H3K4me1、HIC1、KLF4和CTF1()，其中一些基因在下一个分化阶段表达()。最后，1346个假定的启动区在人类肝脏中富集为活性增强标记H3K27ac().
DNA甲基化的缺失和H3K27me3在推定调控元件上的获得
更令人惊讶的是，我们观察到基因间区域从高DNAme转换为H3K27me3（dEN中n=3985）()。这种转变经常发生在CpG贫乏的远端区域，与Polycomb压制杂岩2和H3K27me3常见的CpG岛中心靶区不同()。此开关具有高度的谱系特异性，DNAme通常保留在两种可选的细胞类型中(，).
DNAme到H3K27me交换机和FOXA2绑定A。与hESC相比，在分化为三种hESC衍生细胞类型中的任何一种后，与获得H3K27me3（n=22643）的区域相关的基因组特征分布。
B。分化获得H3K27me3区域CpG含量分布。作为参考，显示了CpG岛的CpG含量分布。
C。与hESC相比，dEN人群中获得H3K27me3的区域的hESC、dEC和dME的表观遗传状态分布。
D。FOXA2在dEN（n=357）、OCT4（n=32）、SOX2（n=12）和NANOG（n=124）中的结合轮廓在分化后在dEN中获得H3K27me3的区域中在hESC中的分布。
E类.与hESC（n=369）相比，由dEN中的FOXA2结合的区域和dEN中获得H3K27me3的区域的中位数标准化标签计数（RPKM）的合成图。
F、。正常化H3K27me3和H3K4me3的hESCs、dEN和人类成人肝组织的ChIP-seq轨迹资产负债表基因座（chr4:74257882-74377753）。黑色条(底部)表示hESC中OCT4、SOX2或NANOG的TF结合。y轴上的读取计数标准化为1000万次读取。
G.公司。由FOXA2结合并在dEN中获得H3K27me3的区域甲基化水平的分布。描述了hESC和dEN WGBS数据集以及在dEN（n=369）中FOXA2 ChIP-亚硫酸氢盐实验的两个生物复制品的DNAme信息。
H。相对于与FOXA2结合区域相关并在dEN中获得H3K27me3（n=50）的dEN，成肝细胞期基因表达谱上调。
一、。在dEN中获得H3K27me3并在人类肝脏中富集H3K17ac的部分区域（n=192）。
另见图S7.
Motif富集分析结合来自ENCODE项目的公开可用TF结合位点（TFBS）数据的评估表明，在dEN中表现出这种转变的许多区域靠近先导因子FOXA2的结合位点。这种TF在染色质失活中可能起作用，但其独特的功能和局限性尚不清楚(锂等。, 2012)。为了研究这种关联，我们在内胚层人群中对FOXA2进行了ChIP-Seq。该分析表明，FOXA2结合位点经常与HMR向H3K27me3过渡的区域重叠()。我们还证实，H3K27me3在dEN-FOXA2结合位点的获得主要发生在dEN中，而不是dEC或dME()。这种转变的一个显著例子可以在资产负债表基因座，其中H3K27me3在法新社和原子力显微镜，靠近FOXA2结合位点()。在原发性肝组织中未发现该标记，表明它代表一种暂时状态()。许多表现出这种转变的地区都需要像法新社和原子力显微镜或HBB1型在dME中。重要的是，这些区域中的大多数尚未表现出显著的表达增加(图S7A).
先前的一份报告发现，FOXA1/FOXA2可以与显示DNAme的区域结合(塞朗杜尔等。, 2011)，这不是所有TF的共同特征(吉福德和迈斯纳，2012年)。这些因子结合的区域随后丢失了DNAme，并在我们的人群中获得了常染色组蛋白修饰。因此，我们将hESCs中FOXA2结合位点的DNAme与dEN进行了比较，发现dEN中的特异性DNAme略有减少()。为了更直接地评估这种关系，我们询问了在dEN中通过FOXA2-ChIP-二亚硫酸盐测序分离的区域的DNAme状态(布林克曼等。, 2012)。有趣的是，我们在FOXA2-ChIP分离的位点发现DNAme的大量耗竭()。为了确定这些区域在进一步分化后是否表现出转录激活，我们再次检查了我们的dHep RNA-Seq数据，发现50个与FOXA2结合并在dEN中获得H3K27me3的基因增加了它们的表达(，表S2)。我们还发现H3K27ac在人类肝脏的197个位点富集，这些位点经历了dEN中H3K17me3的增加().
讨论
通过将人胚胎干细胞定向分化为三个不同的、富含FACS的群体（代表胚胎发育的早期阶段），我们提供了一组广泛的新数据，并对人类发育过程中发生的转录和表观遗传动力学提供了许多见解体外谱系规范。
除此之外，我们描述了从高DNAme到H3K4me1或H3K27me3的两种非常有趣但独特的谱系特异性动力学。在我们分化的早期阶段，这些转变发生在许多没有显著改变基因表达的位点。值得注意的是，我们在重编程到iPSC状态的早期阶段对H3K4甲基化进行了类似的观察(科什等。, 2011)这表明这种表观遗传启动事件可能很常见。然而，目前尚不清楚这些事件是否反映了促进分化时及时激活的调节机制，或是否表明缺乏完整转录激活所必需的关键辅因子。我们也不能排除观察到的启动事件的子集是由于RNA-Seq未检测到的细胞群体异质性所致。我们观察到，在远端CpG-贫乏区域，高DNAme转化为H3K27me3富集，这更令人感兴趣。由于潜在的序列背景，在缺乏额外的协同因素的情况下，这些区域的DNAme靶向缺失是否会导致H3K27me3的默认增益，仍有待测试(门登霍尔等。, 2010)或者代表更积极的招募事件和监管机制。此外，H3K27me3在远端区域的增加可能是由于基因组构象的改变，并反映了H3K17me3在三维空间的扩散。最近有报道称，H3K27me3富集和附近的核小体缺失区域结合在一起，产生了适于TF结合的位点(塔伯雷等。, 2011)。基于这些结果，人们可以推测，特定的TF，如FOXA2，发挥染色质分解功能，导致DNAme丢失，从而获得H3K27me3，这为不能直接重塑异色状态的其他TF的后续结合创造了平台，而是在转录机制组装和转录激活中发挥作用。
总之，我们的数据为人类胚胎干细胞规范期间的转录和表观遗传动力学提供了新的见解，并为许多应用提供了有价值的参考图，包括再生生物学和人类发育生物学研究。
