螺内酯对持续性高血压大鼠脑血管结构的影响

摘要

缺血性中风是美国发病率和死亡率的主要原因，¹可供选择的治疗方法极其有限。高血压是中风的主要危险因素，高血压改变了脑血管系统，增加了缺血性中风发生的风险²并损害血管对缺血损伤的扩张能力，^三从而增加中风造成的伤害。中风自发性高血压大鼠（SHRSP）被广泛用于研究血管结构对脑缺血结局的影响；当喂食高盐饮食时，SHRSP会出现出血性中风，⁴当大脑中动脉（MCA）闭塞导致缺血时，它们的梗死面积明显大于血压正常的Wistar-Kyoto（WKY）大鼠。⁵高血压大鼠的脑小动脉发生向内富营养化重塑，其特征是管腔和外径减小，而壁面积不变。⁶在MCA中，我们还发现与WKY大鼠相比，SHRSP的管腔和外径减小。⁷较小管腔的存在对脑血管尤为重要，因为它会损害血管的自动调节能力⁸并扩张。^三这种管腔直径的减少可能是SHRSP中MCA闭塞所观察到的大面积脑梗死的原因。⁹因此，增加管腔直径的治疗可能是降低中风风险的有效主要预防策略。

人们对醛固酮的心血管作用或其受体盐皮质激素受体（MR）的激活的兴趣急剧增加。¹⁰MR出现在血管平滑肌和内皮细胞上，^11,12我们之前已经在脑血管系统中显示出强大的MR表达。¹³醛固酮和中风之间有明显的联系。¹⁴13%的原发性醛固酮增多症患者有中风病史，而在年龄、性别和血压相匹配的高血压患者中，只有3%的患者有中风史。¹⁵同样，由糖皮质激素可缓解的高血压引起的血浆醛固酮升高的患者中风频率也增加。¹⁶重要的是，以前被归类为原发性高血压的高血压病例中，有10-15%与醛固酮有关。¹⁷因此，醛固酮与中风之间的因果关系将显著增加被认为有脑血管事件风险的人群。

盐皮质激素与中风之间的联系也已在啮齿类动物中得到证实。MR拮抗剂（螺内酯和依普利酮）可在不降低高盐饮食的SHRSP患者血压的情况下预防自发性出血性中风。^18,19我们已经证明，螺内酯治疗可以显著降低SHRSP脑缺血引起的损伤⁵防止富营养化MCA重塑。⁷反之亦然；用脱氧皮质酮醋酸盐直接激活Wistar大鼠的MR，可增加脑缺血造成的损伤。²⁰这些研究是用年轻大鼠进行的，旨在测试MR在脑血管重塑发展中的作用。目前尚不清楚MR激活是否参与重塑的维持，以及在高血压重塑发生后，MR拮抗作用是否对脑血管系统有有益影响。这与临床相关，因为只有25-40%的患者血压得到控制。²¹

以前的研究表明，在血管明显重塑的情况下，肾素-血管紧张素-醛固酮系统的中断可以改善血管结构。这在用血管紧张素转换酶抑制剂西拉普利治疗的SHRSP患者的脑血管中得到了证实²²和培哚普利，²³在用血管紧张素II受体阻滞剂替米沙坦治疗的SHR中。²⁴在所有这些研究中，治疗也降低了血压。血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻滞剂抑制血管紧张素Ⅱ对血管系统的作用，但也降低醛固酮水平，使其无法区分血管紧张素II受体和MR介导的作用。因此，我们假设慢性螺内酯治疗可以逆转12至18周龄接受治疗的男性SHRSP的MCA重塑。这将通过MCA管腔直径的增加和壁/管腔比的降低来证明。本研究包括WKY大鼠，以提供SHRSP重塑程度的指标。

方法

动物和治疗。雄性SHRSP来自乔治亚医学院和密歇根州立大学的繁殖群体。12岁男性SHRSP在食物中加入螺内酯（SHRSP+螺，25mg/kg/天）治疗6周，对照组SHRSP未治疗。从哈兰（印第安纳波利斯）购买年龄匹配的WKY大鼠。动物在温度可控的环境中以12小时的光/暗周期进行饲养，并定期提供食物（Harlan Teklad，饮食#8656）和自来水随意佐治亚医学院和密歇根州立大学动物护理和使用委员会批准了实验方案，遵循美国生理学会概述的方案。

血压测量如前所述，使用遥测技术（明尼苏达州圣保罗市Data Sciences）持续监测血压，并将发射器放置在腹主动脉中。²⁵

动脉准备如前所述，通过压力肌电图评估MCA的结构和功能。^7,13简单地说，分离MCA并将其置于低温生理盐溶液中（mmol/l:141.9 NaCl，4.7 KCl，1.7 MgSO₄，0.5乙二胺四乙酸，2.8氯化钙₂，10.0 HEPES，1.2 KH₂人事军官₄和5.0葡萄糖）。MCA最靠近Willis环的第一个无分支段安装在小血管动脉造影仪（弗吉尼亚州伯灵顿市Living Systems Instrumentation）的两个玻璃微移液管上。用温热的含氧生理盐水冲洗血管，将腔内压力设置为75mmHg，血管平衡30min。没有保持压力的容器被丢弃。肌源性张力以被动管腔直径的百分比表示，根据主动和被动条件下75和125mm Hg管腔内压下的管腔直径计算得出，公式如下：%肌源性色调=（1−（ID_A类/ID编号_P（P）))×100，其中ID_A类是活动条件下的内径和ID_P（P）是被动条件下的内径。^7,26为了分析血管结构，将血管浸泡在含有2mmol/l乙二醇四乙酸的无钙生理盐溶液中，腔内压力以20mm Hg的增量从0增加到180mm Hg。平衡5分钟后，使用视频显微镜测量每个压力下的管腔直径、外径和壁厚。采用Baumbach和Hadju方法计算壁/腔比、周向壁应力和壁应变。²⁷根据单个血管的应力/应变曲线计算弹性模量（β系数），这些曲线拟合为指数模型(年=声发射^βx)其中，β是曲线的斜率：β系数越高，血管越硬。

插槽和西部印迹收集脑血管（MCA、前、后交通动脉和眼动脉），用slot blot分析胶原蛋白1和4的表达，用western blot分析基质金属蛋白酶（MMP）-13的表达。²⁸

逆转录聚合酶链反应按照制造商的方案，使用TRIZOL试剂（Invitrogen，Carlsbad，CA）从脑血管中提取RNA。使用上标II（Invitrogen）逆转录1µg RNA。使用TAQMAN引物（加利福尼亚州福斯特市应用生物系统公司）进行实时PCR。测定MMP-2、MMP-9、MMP-13、MMP-2组织抑制剂、胶原蛋白1和胶原蛋白4的mRNA表达。还检测了细胞增殖标记物MKI67、抗凋亡标记物Bcl-2和促凋亡标记物BAD的表达。研究了以下炎症标记物：细胞间黏附分子1（ICAM-1）、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子-α。同时评估MR表达。RPL32用于归一化。WKY表达的折叠变化使用2^-ΔΔCt方法。²⁹

统计数据通过双向重复测量方差分析（ANOVA）进行分析，并对所有剂量和压力反应进行Bonferroni多重比较后测试。通过等方差检验的所有其他数据均采用单因素方差分析和Bonferroni后验进行分析。当等方差检验失败时，采用秩和方差分析，然后进行Tukey后验。A类P（P）0.05或以下的值被认为是显著的。给出的所有值均为平均值±标准误差。；n代表动物的数量。

结果

生理参数

与SHRSP（305.8±8.8g）相比，SHRSP+spir（336.2±4.0g）和WKY大鼠（322.1±4.0g；P（P）< 0.05). SHRSP+spir和WKY大鼠的体重没有差异。螺内酯治疗对SHRSP中的血浆钾水平没有影响（4.5±0.1 vs.4.7±0.1mmol/l，SHRSP+螺内酯vs.SHRSP；P（P）> 0.05). WKY大鼠的血浆钾水平最低（4.2±0.1mmol/l）。在整个治疗过程中，螺内酯治疗并没有改变SHRSP患者的平均动脉压。与WKY大鼠相比，SHRSP两组的平均动脉压均升高(图1).

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图1。

螺内酯对雄性自发性高血压大鼠（SHRSP）的血压没有影响。男性SHRSP从12周龄开始服用螺内酯（25mg/kg/天）6周。使用放置在腹主动脉中的遥测仪，连续测量血压。显示了每天治疗的日间血压（12h）的平均值。结果表示为平均值±标准偏差。Wistar-Kyoto（WKY）大鼠的血压低于两个SHRSP组，螺内酯不影响血压(*P（P）≤ 0.05).

MCA肌原性张力

在75和125mm Hg的腔内压力下评估MCA产生音调的能力。与75毫米汞柱下的SHRSP和WKY大鼠相比，SHRSP±spir大鼠大脑中动脉的声调生成（以被动管腔直径的百分比表示）增加(P（P）≤ 0.05). 125mm Hg时的音调没有显著差异(P（P）=0.12），尽管SHRSP+spir的MCAs有增加的趋势(图2).

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图2。

螺内酯增加大脑中动脉张力。用螺内酯（SHRSP+spir；25mg/kg/天；n个=6）从12周龄起持续6周。肌原性张力以被动直径的百分比表示，使用以下公式在75和125mm Hg下测量：%肌原性色调=（1–（ID_A类/ID编号_P（P）))×100，其中ID_A类是有效条件和ID下的内径_P（P）是被动条件下的内径*表明与SHRSP存在显著差异(n个=9）和Wistar Kyoto（WKY）大鼠(n个=9），结果显示为平均值±s.e.m。

MCA被动结构

在研究螺内酯是否能改善高血压形成后的MCA结构之前，有必要表明，我们之前在12周龄SHRSP中观察到的重塑在18周龄SHRS中是存在的，并且没有改变。我们已经表明，12周龄男性SHRSP的MCA表现出富营养化重塑，表现为较小的外径和管腔直径，与管腔内压力为80mm Hg的WKY大鼠相比，壁厚没有差异(表1). 中的数据表1对于12周龄SHRSP和WKY大鼠，之前已经发表过，并将其纳入比较。⁷在所研究的管腔内压力范围内，12周龄和18周龄对照组SHRSP的MCA结构没有显著差异。

表1

比较12周龄和18周龄男性对照SHRSP的大脑中动脉结构，以建立12周龄SHRSP预先存在的血管重塑

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螺内酯增加MCA管腔(图3a)和外部(图3b)与对照SHRSP相比，SHRSP+spir的管腔直径增加了约26%，但管腔直径没有达到WKY大鼠的水平。螺内酯将MCA的外径增加到与WKY MCA外径相同的水平(图3b). 与SHRSP组相比，SHRSP+spir组MCA的壁腔比降低，但仍大于WKY组大鼠(图3c). 螺内酯治疗不会改变MCA壁厚(图3d). 根据单个应力/应变曲线计算得出的β系数被用作容器刚度的测量值。两组之间的β系数没有显著差异（SHRSP+spir:4.32±0.27，SHRSP:5.08±0.28，WKY:5.00±0.48），尽管螺内酯治疗的SHRSP的MCA有降低β系数的趋势。

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图3。

螺内酯对脑血管结构的影响。从12周龄开始，用螺内酯（25mg/kg/天）治疗雄性自发性高血压大鼠（SHRSP）6周，收集18周龄大鼠的血管。的测量(一)被动大脑中动脉（MCA）管腔和(b条)在无钙生理盐溶液中，通过加压动脉造影仪获得管腔内压力范围内的外径。(c（c）)计算MCA壁腔比(d日)测量壁厚*P（P）<0.05，括号表示组间差异，方差分析。WKY，Wistar京都大鼠。

胶原蛋白和基质金属蛋白酶的表达

逆转录聚合酶链反应分析显示SHRSP大鼠胶原蛋白1和4的mRNA表达增加。螺内酯将SHRSP和WKY大鼠的胶原蛋白1 mRNA表达降低到一定水平，因此SHRSP+螺内酯的表达与两组无差异(表2). 然而，胶原蛋白表达的slot-blot分析显示，三组大鼠之间的胶原蛋白1或4均无显著差异(图4a、b). 各组间MMP-2或MMP-9的mRNA表达无差异。SHRSP和SHRSP+spir中MMP-13的mRNA表达有增加的趋势，但没有达到统计学意义(表2). MMP-13蛋白表达的Western blot分析显示，前MMP-13的表达没有差异，但SHRSP+螺旋体中活性MMP-13水平显著增加(图4c). MMP-2组织抑制剂的mRNA表达在各组之间也没有变化(表2).

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图4。

螺内酯（spir）对(一)胶原蛋白1(b条)胶原蛋白4，以及(c（c）)基质金属蛋白酶（MMP）-13的表达。12至18周龄的雄性自发性卒中高血压大鼠（SHRSP）接受螺内酯（25mg/kg/天）治疗，从18周龄大鼠收集血管。*表明与SHRSP存在显著差异(n个=每组6人）。

表2

18周龄WKY、SHRSP和SHRSP±螺旋脑血管mRNA表达的折叠变化

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讨论

本研究表明，MR拮抗改变SHRSP的脑血管，使其管腔和外径与WKY大鼠更相似。以前，我们已经证明，螺内酯治疗可以在不降低血压的情况下防止幼年大鼠富营养化MCA重塑。⁷目前的研究旨在测试螺内酯对已经经历显著重塑的血管具有有益作用的可能性，因此可能对慢性高血压患者有益。因此，一旦MCA重塑建立，我们就开始接受螺内酯治疗。^7,30螺内酯对MCA的影响表明，与WKY大鼠相比，醛固酮或MR激活可维持成年SHRSP的结构变化。在MR拮抗剂存在的情况下，血管重塑的维持信号被关闭，MCA的结构发生改变。

对当前研究的一个警告是，我们使用螺内酯来阻断MR，螺内酯具有抗雄激素和促孕激素的作用。螺内酯对雄激素和孕酮受体的结合亲和力显著低于对MR的亲和力。³¹然而，我们不能确定所观察到的影响是否仅仅是由于MR阻断所致。我们认为在这里使用它是有理由的，以便在我们之前的研究中对重塑的发展进行比较⁷这里研究了重塑的维持。我们使用更特异的MR拮抗剂依普利酮对年轻SHRSP进行了研究，我们发现所得结果与螺内酯的结果相似；这使我们相信，所观察到的效果与MR有关。此外，我们还进行了使用醋酸脱氧皮质酮激活MR的研究²⁰我们观察到与MR拮抗剂观察到的效果基本相反的效果。重要的是，使用SHRSP喂食中风预防性高盐饮食的研究表明，螺内酯和依普利酮在这些条件下对脑血管有极其相似的影响。^18,19综上所述，这些研究使我们确信，此处观察到的螺内酯的作用发生在MR水平。同样重要的是，螺内酯仍在积极使用，研究正在提倡将其用于难治性高血压患者。³²因此，研究螺内酯的作用仍然具有临床意义。

据我们所知，这是首次研究表明MR拮抗剂可促进持续高血压大鼠血管系统的有益结构改变。对血压正常的Sprague-Dawley大鼠的研究表明，MR拮抗剂可以逆转颈动脉胶原随年龄增长而增加的趋势，而不会改变血管壁厚度。³³其他使用肾素-血管紧张素-醛固酮系统其他成分抑制剂的研究表明，对患有高血压的人类和动物的血管结构具有有益的影响。³⁴如前所述，血管紧张素转换酶抑制剂和血管紧张素II受体阻滞剂可改善高血压大鼠的脑血管结构。^22–24虽然在这些研究中血压降低，但似乎仅仅降低血压并不是观察到的有益作用的机制，因为不影响肾素-血管紧张素-醛固酮系统的降压药不会改变血管结构。^23,35在目前的研究中，通过遥测评估，螺内酯对血压没有影响。这为肾素-血管紧张素-醛固酮系统的中断以血压无关的方式影响脑血管系统的论点增添了力量。有趣的是，12至18周龄的SHRSP患者的血压仍在缓慢升高。然而，我们的研究强烈表明，在此期间SHRSP的血管结构没有改变(表1). 这表明了一种有趣的可能性，即MCA结构只对血压升高到一定水平作出反应，而任何进一步的压力变化都没有影响。这再次表明血压和血管重塑至少在某种程度上是相互独立的。

我们观察到，螺内酯治疗的SHRSP使MCA的肌生成张力增加。肌生成张力在维持脑血管自动调节中起着重要作用²⁶并且受到包括代谢和神经输入在内的各种因素的影响。³⁶脑血管自动调节在血压波动期间维持适当的脑灌注并保护微血管。血压对声调产生的影响似乎颇具争议；音调增强，³⁷音调不变，³⁸和降低音调³⁹在高血压大鼠中均有报道。重要的是，本研究中观察到的色调变化模式与我们小组之前在年轻SHRSP中观察到的非常相似。⁷在75mm Hg的安体舒通治疗的SHRSP中观察到MCA肌源性张力增加，这可能表明安体舒酮治疗后MCA的自身调节行为有所改善。血管生成张力的能力提高，将更好地保护下游小动脉免受血压波动的影响。以前的研究表明，螺内酯可以保护SHRSP免受自发性出血性卒中的影响；¹⁸增强的肌源性张力可能是导致这一现象的原因。螺内酯增加色调的机制尚不清楚。螺内酯不会增加血管壁物质，因此增强的张力不仅仅是肌肉质量增加的一个功能。这表明张力调节的变化可能发生在分子水平上。Rho激酶本质上参与了MCA音调的控制。⁴⁰然而，Rho激酶不太可能参与螺内酯治疗观察到的音调增加，因为MR激活而不是拮抗作用会增加Rho激酶的激活。⁴¹

SHRSP的MCA重塑被归类为真正的重塑，因为在0毫米汞柱腔内压力下的管腔直径与WKY管腔直径不同。⁶有趣的是，螺内酯完全校正了MCA的外径，但仅部分校正了管腔直径和壁腔比。这一变化似乎使螺内酯治疗的SHRSP的生长有必要略微增加。这两组SHRSP都表现出增加细胞增殖标记物MKI67表达的趋势。⁴²两组间促凋亡和抗凋亡标记物没有变化。这表明SHRSP+spir中可能有更多的平滑肌细胞增殖，这可能有利于在不改变血压的情况下补偿增加的血管尺寸。尽管生长可能增加，但来自SHRSP+spir的MCA的壁面积没有增加。这与之前的研究一致，研究表明螺内酯可以阻止SHRSP引起的MCA中的富营养化重塑。⁷有趣的是，我们观察到18周龄SHRSP大鼠和WKY大鼠之间的血管壁厚度差异，这在我们研究年轻大鼠时并不明显。⁷这一发现并非没有优先权，伊扎德等。结果表明，5-6周龄大鼠的SHRSP和WKY MCA壁厚之间没有差异，但20-24周龄的大鼠SHRSP壁厚更厚。⁴³

螺内酯治疗不会改变MCA硬度。胶原蛋白表达的变化会导致血管壁硬度的变化。有趣的是，SHRSP中胶原蛋白1和4的mRNA表达增加。在螺内酯存在下，胶原蛋白1的表达与对照SHRSP或WKY大鼠没有显著差异，表明螺内酯部分降低了SHRSP和WKY大鼠胶原蛋白1 mRNA的表达，使其达到中间水平。螺内酯对胶原蛋白4 mRNA的表达没有影响。然而，尽管SHRSP+螺旋体中活性MMP-13蛋白表达增加，但我们无法通过缝隙印迹检测到两种胶原蛋白表达的差异。MMP-13是一种胶原酶，可降解纤维胶原；因此，人们原本预计SHRSP+螺旋中的胶原蛋白表达会减少。胶原蛋白和mRNA表达的不同结果可能反映了各组间mRNA的周转或降解的变化。这也可能是用于测量胶原蛋白表达的方法的功能。对于胶原蛋白1和4的表达，SHRSP中的表达水平高于SHRSP+spir或WKY大鼠有一种趋势，使用免疫染色检测和量化胶原蛋白表达可能会产生显著不同的结果。令人惊讶的是，人们对胶原蛋白，尤其是脑血管中胶原蛋白4的调节知之甚少。SHRSP中缺乏螺内酯介导的胶原蛋白水平降低，这有点令人惊讶，与许多外周血管系统的研究相矛盾。例如，Bentos等。表明螺内酯治疗年轻SHR大鼠可阻止主动脉胶原沉积。⁴⁴如前所述，螺内酯可减少颈动脉中与衰老相关的胶原沉积。³³颈动脉和主动脉的血压都高于MCA，可以看出为什么这些血管中的结构蛋白（如胶原蛋白）比压力较低的较小血管中的调节更高。

我们认识到，这项研究的一个警告是缺乏MMP活性的直接测量。在脑血管系统的小样本中很难测量MMP-13的活性。因此，使用蛋白质印迹来评估促MMP-13和活性MMP-13的这种表达作为活性的替代物。我们还认识到MMP-2和-9是血管重塑的重要因素。在所研究的任何组中，其mRNA表达都没有变化。我们也未能观察到幼稚脑血管中的MMP-9活性。因此，我们选择将研究重点放在MMP-13上。值得注意的是，我们不认为MMP-13导致WKY和SHRSP之间的差异，但MMP-13可能导致SHRSP和SHRSP+spir之间的差异。

慢性炎症在心血管疾病的发病机制中起着关键作用。^45,46最近几项研究将醛固酮与心血管系统炎症联系起来。⁴⁷值得注意的是，醛固酮增加了人脐静脉、主动脉和冠状动脉内皮细胞中ICAM-1的表达。^7,12,48在当前研究中，我们评估了ICAM-1、骨桥蛋白和肿瘤坏死因子-α的mRNA表达，以提供血管炎症的指示。SHRSP使血管中的骨桥蛋白和ICAM-1增加，螺内酯使ICAM-1表达降低，表明MR调节脑血管中ICAM-1的表达。令人惊讶的是，在18周龄SHRSP中，肿瘤坏死因子-α的表达没有受到影响。应该注意，这只是血管炎症特征的快照，血管炎症的时间调控可能有很大不同。

总之，我们已经证明螺内酯以一种与血压无关的方式逆转SHRSP中的富营养化MCA重塑。血管重塑增加了脑缺血的风险和损伤，研究表明，在检测到高血压之前，存在小血管重塑。⁴⁹因此，谨慎地确定可以改善高血压患者重塑的机制，以降低中风和其他高血压相关疾病的风险。MR阻断可以改善高血压患者的血管变化并防止终末器官损伤，这一观点很有吸引力。MR拮抗剂目前在临床上使用，总体上耐受性良好。因此，磁共振阻滞作为一种附加疗法来降低脑血管病风险的可能性值得进一步研究。

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