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单元格代表。作者手稿；PMC 2013年7月3日提供。
以最终编辑形式发布为：
Cell Rep.2013年6月27日；3(6): 1777–1784.
2013年5月30日在线发布。 数字对象标识：2016年10月10日/j.celrep.2013.04.032
预防性维修识别码：PMC3700580型
NIHMSID公司：NIHMS475487标准
PMID：23727241

小鼠胚胎生殖系体内发育调控基因的双价染色质标记

萨克斯,1中，2,三 科特尼·奥诺德拉,2,4 凯瑟琳·布拉斯克,1中，2,三 凯文·埃巴塔,2,三 宋骏,2,4,5和米盖尔·拉马霍·桑托斯2,三，*
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

介绍

多能性依赖于表观遗传景观的维持(Gaspar-Maia等人，2011年；Orkin和Hochedlinger，2011年). 双价结构域由允许组蛋白标记（H3K4me3）和抑制标记（H3G27me3）的矛盾共存定义，被认为通过保持发育基因处于沉默状态以备分化时激活而在多能性中发挥重要作用(Azuara等人，2006年；Bernstein等人，2006年). 为了支持这一模型，双价结构域已被证明优先存在于未分化胚胎干细胞（ESCs）和几个成人组织的发育调节基因中体内包括精子、睾丸、小脑和造血室(Mikkelsen等人，2007年；Cui等人，2009年,2012；Hammoud等人，2009年)。发育调节剂在电子设备突变体ESCs降低了H3K27me3的水平，进一步支持了这种模型(Azuara等人，2006年；Boyer等人，2006年). 然而，最近有人提出，胚胎干细胞发育基因中H3K4me3和H3K27me3的伴随存在是一种在体外次优培养条件产生的伪影(Hong等人，2011年；Marks等人，2012年). 此外，由于可用材料数量少，技术困难，发育中哺乳动物胚胎中二价性的直接证据有限且相互矛盾(Alder等人，2010年；Dahl等人，2010年；Rugg-Gunn等人，2010年). 由于来自非哺乳动物物种的相互矛盾的报告，二价性的普遍性受到了进一步的质疑，斑马鱼体内存在二价结构域(Vastenhouw等人，2010年)但在爪蟾或果蝇胚胎中未检测到(Akkers等人，2009年；Schuettengruber等人，2009年). 因此，我们对胚胎细胞中是否存在二价性缺乏明确的认识体内以及它与多能性的关系。

对多能性特别感兴趣的是原始生殖细胞（PGC），即生殖系的胚胎前体。PGCs具有与ESCs相似的转录谱(秦等，2012)包括发育调节因子的沉默，并且在培养时可以产生多能干细胞在体外然而，与ESCs不同，PGCs是单能的，并且不能对嵌合体作出贡献。此外，PGC被认为经历了一段“表观遗传擦除”或通过DNA甲基化和组蛋白修饰的整体去除而重新编程的时期，这可能会阻止表观突变的传播(Greer和Shi，2012年；Seisenberger等人，2013年). 由于在发育过程中存在的PGC数量较少，因此该模型的几乎所有证据都来自基于免疫荧光（IF）的方法学，这些方法缺乏基因水平的分辨率，并且显示了相互矛盾的结果(Seki等人，2007年；Hajkova等人，2008年；Kagiwada等人，2012年). 为了表征PGC的染色质状态，我们开发了一种低细胞数染色质免疫沉淀法（ChIP），用于分析组蛋白标记，每IP使用不到10000个细胞，无需载体染色质或预扩增。利用这项技术，我们进行了ChIP-Seq和ChIP-qPCR，以表明在PGC发育的多个阶段，发育调控基因中存在二价结构域。

结果

低小区数ChIP协议

我们使用基于磁珠的捕获技术开发了一种低信元数的ChIP协议，并对现有方法进行了关键改进(O'Neill等人，2006年；Acevedo等人，2007年；Dahl和Collas，2008年；Adli和Bernstein，2011年；Shankaranarayanan等人，2011年)包括减少交联材料的处理，提高超声波的再现性，不需要载体DNA或DNA预扩增（见方法）。由于技术的简单性和全基因组数据的可用性，我们使用表达N末端myc标记的H3.3组蛋白的转基因小鼠ESC系验证了该方案(Goldberg等人，2010年). 对myc-H3.3和对照IgG进行ChIP，染色质数量从每IP 250万个细胞减少到12500个细胞(图S1A). 用qPCR技术检测了代表6类基因组区域的15个不同位点的富集状态。重要的是，12个基因座中有11个有望与H3.3结合(Goldberg等人，2010年)与IgG相比，myc-H3.3的富集度至少高出10倍，证明了该检测的特异性和低背景。此外，位点之间的相对富集度保持稳定，与起始细胞数无关，证明了该分析的稳健性和敏感性(图S1B). 我们设想该协议将广泛用于描述罕见干细胞和前体细胞群体的染色质状态体内。

PGCs中H3K4me3和H3K27me3的全基因组分析

为了研究PGC中二价结构域的存在，我们使用了一种转基因10月4日以下为：GFP公司如前所述，利用FACS在不同发育阶段分离PGCs（GFP+）和周围体细胞（GFP-）的小鼠系(Yoshimizu等人，1999年). 使用我们的低细胞ChIP协议，我们在E11.5 PGC的两个生物复制中对H3K4me3和H3K27me3执行了ChIP-Seq，每个ChIP库的总读取数约为3.86亿次，可唯一映射的读取数在1500万到3200万次之间(表S1). 我们的ChIP-Seq文库中的两个生物复制表现出很强的相关性，H3K4me3的Pearson相关系数为0.978，H3K27me3为0.996(图1A,S2A公司,表S1)，表明该方案具有较高的再现性。此外，根据使用CHANCE评估的信号过输入，所有IP都得到了丰富(表S1)(Diaz等人，2012年)。

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E11.5 PGC中的双价基因富含发育调节因子

（A） E11.5 PGCs和ESCs的2个生物复制的ChIP-Seq信号的样本UCSC基因组浏览器视图。（B） E11.5 PGC和ESC的基因数量相似，只有H3K4me3、H3K27me3或两者都标记。（C） E11.5 PGC和ESCs中H3K4me3和H3K27me3标记的基因重叠，p<2.2×10−16使用费希尔精确测试。（D） 使用DAVID确定PGC和ESC中标记为二价基因的前5个生物过程基因本体术语。（E） 使用ChIP-qPCR在E11.5 PGC中富集H3K4me3和H3K27me3，以验证代表三个胚层调节器的二价基因子集的ChIP-Seq。数据为输入平均百分比±浓缩标准偏差。虚线表示背景丰富程度。（F） 热图显示标记为二价的基因子集在指定细胞类型的PGC和ESC中的表达。EB：胚胎体；MEFs：小鼠胚胎成纤维细胞；L.V.脑：成人大脑的侧脑室。蓝色表示下调，红色表示上调。另请参见图S2,表S1。

我们在E11.5 PGC（本研究）和ESCs中鉴定了H3K4me3纯区、H3K27me3纯区域和二价结构域(Mikkelsen等人，2007年)使用ChromHMM(安永会计师事务所（Ernst and Kellis），2012年). 这些组蛋白标记在PGCs和ESCs之间的总体分布相似，只是PGCs中H3K27me3标记的DNA增加(图S2B)，与IF数据一致(Seki等人，2005年,2007；Kagiwada等人，2012年). PGC中仅标记有H3K27me3的基因(补充文件2)参与细胞运动(图S2C)这可能是由于PGC在E11.5时刚刚完成向性腺的迁移。

PGC中的双价基因富含发育调节因子

接下来，我们关注二价区域。与它们与基因启动子的关联一致，二价结构域主要出现在E11.5 PGC和ESCs的转录起始位点（TSS）(图S2D). E11.5 PGCs和ESCs具有相似的分布，并且标记为二价的基因有高度显著的重叠（p＜2.2X10−16,图1B、1C,S2E公司). 与ESC的描述类似(Bernstein等人，2006年)，在PGC和ESC中标记为二价的2715个基因强烈富集，用于早期发育的调节(图1D). 我们注意到，在审查这份手稿时，Ng等人报告了一个用于PGC中几个组蛋白标记的ChIP-Seq数据集，包括H3K4me3和H3K27me3(Ng等人，2013年). 然而，作者没有详细分析二价性，该研究中E11.5 PGCs中H3K4me3的低信号排除了与我们的工作的直接比较(图S2A). 因此，我们试图使用ChIP-qPCR在PGC的独立生物样品中验证我们的数据。对代表8条发育途径的12个基因进行的ChIP-qPCR证实，所有基因在PGC中都有二价标记，二价定义为背景浓度高于10%(补充文件1)对于H3K4me3和H3K27me3，以及两个标记之间的最大2倍富集差异(图1E). 这些二价调节因子包括对3个体细胞胚层的规范化很重要的转录因子，例如Pax6、Nkx2.2、MyoD、brachyury（T）、Gata6和FoxA1以及Hox基因，如霍克斯A3和霍克斯B9这是值得注意的，因为ESC是多功能的，并有望在分化时将这些基因保持在稳定的转录状态以激活，但PGC是单功能的，在下一代受精后才表达任何这些发育调节因子。事实上霍克斯在E7.25，作为PGC前体的早期规范的一部分，簇被证明是沉默的(Saitou等人，2002年). 对PGCs和ESCs中二价基因表达模式的比较表明，这些基因在ESCs和PGCs中转录受到抑制，但在MEF、骨髓或脑组织等特定谱系限制性细胞类型中亚群活跃(图1F). 综上所述，我们的全基因组分析显示，小鼠胚胎生殖系体内在沉默的发育调节基因中存在双价染色质方面，与培养的ESC非常相似。

与周围的体细胞相比，PGC在发育基因中富含二价性

接下来，我们将PGC的染色质景观与周围的胞体进行了比较。使用ChIP-qPCR，我们检测了12个先前测试的发育调节因子+Pou5f1/10.4年10月ESCs和E11.5体细胞(图2A、2B). 这些发育调节因子中的12/12在E11.5 PGC和ESC中都是二价的。然而，在体细胞中，大多数基因对H3K4me3或H3K27me3都有较强的富集作用，只有四个基因是二价的(图2B、2C). 这些数据表明，所有体细胞谱系的发育调节因子在ESCs和PGC中均以二价状态存在，但在体细胞中不存在体内(图2D)表明二价结构域的这种分布是多潜能相关细胞的一个显著特征在体外和体内试验。

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与E11.5处的周围体细胞相比，PGC富含二价发育调节剂

（A） 指示基因处ESCs中H3K4me3和H3K27me3的ChIP富集。数据为输入的平均百分比±富集度的标准偏差。虚线表示背景丰富程度。（B） 如（A）所述，在E11.5体细胞中，ChIP在所示基因处富集H3K4me3和H3K27me3。（C） H3K4me3与H3K27me3对数之比2转化ESCs、E11.5 PGC和E11.5体细胞的指示基因。灰色区域表示比率小于2且大于0.5。H3K4me3或H3K27me3富集不高于背景的基因颜色较浅。（D） 日志2H3K4me3/H3K27me3比值的计算如（C）所示（log2R（右）电池类型)所有基因的检测均与背景富集无关。细胞类型比率之间的差异计算如下：ΔPGC公司=| log2R（右）PGC公司−日志2R（右）电子稳定控制系统|和Δ躯体=| log2R（右）躯体−日志2R（右）电子稳定控制系统|针对每个基因。方框图表示差异的分布。使用Wilcoxon配对符号秩检验（单侧）评估统计显著性，**p=0.001。ND=未确定。

在性分化开始期间，发育调节因子在PGC中保持二价

E11.5 PGC对性无反应，培养时能够产生多能干细胞在体外在E11.5后，PGC启动性别分化过程，并通过E13.5表达性别特异性基因。此外，E13.5 PGC不能再产生多能干细胞(Labosky等人，1994年). 因此，我们试图研究性分化过程和产生多能干细胞能力的伴随丧失是否影响PGC的二价染色质状态。我们使用低细胞ChIP-qPCR，通过从E11.5到E13.5的PGC发育过程，检测了8个具有代表性的发育基因。与之前公布的数据一致(秦等，2012)，体细胞发育基因，包括霍克斯A11,霍克斯B9,Pax6、Nkx2.2、T、MyoD、Gata6、，和福克斯A1在E11.5到E13.5中以极低到无法检测的水平表示(图3). 有趣的是，在这段时间内，这些发育调节因子在PGC中仍然是二价的(图3). 相反，种系特异性基因，如Dazl，Dppa3，和瓦萨仅富含H3K4me3，与其转录激活相一致(图S3). 综上所述，这些数据表明，从E11.5到E13.5开始性分化，体细胞发育调节因子在小鼠胚胎生殖系中仍然是二价的。

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在生殖系的性别分化过程中，发育调节因子仍然是二价的，并且转录受到抑制

在雄性和雌性生殖系中，发育基因在E11.5到E13.5之间保持二价和转录沉默。E11.5-13.5 PGC中H3K4me3和H3K27me3在指示基因处的ChIP富集表示为至少2个生物复制的输入平均百分比±标准偏差。用qRT-PCR测量所示基因的转录，并用看家基因的百分比表示L7级±标准偏差。在所分析的PGC发育的所有阶段，体细胞发育基因对H3K4me3和H3K27me3的富集程度相似，且表达量很低。另请参见图S3。

孤二价结构域在PGC中沉默，并以组织特异性方式转录

令人惊讶的是，我们发现了大量“孤儿”二价结构域，这些结构域不能与RefSeq数据库中的任何注释启动子或基因相关联，并且与注释基因相距13kb的中位距离(图4A). E11.5 PGC中共有9132个二价结构域，其中2886个是孤儿，许多在ESC中也是二价(表S2). 已知二价结构域与非甲基化CpG岛（CGI）有很强的关联(Ku等人，2008年). 我们发现1413（49.0%，p值<1×10−5)PGC中的孤儿二价结构域映射到实验定义的非甲基化CGI(Illingworth等人，2010年). 接下来我们研究了含有孤儿二价结构域的区域的表达状态。如果孤儿二价结构域与二价基因相似(图1F)，它们在PGC中沉默，在体细胞组织中表达。事实上，E11.5 PGC的RNA-Seq数据集中只有23个（0.80%）孤儿二价结构域显示转录迹象(Seisenberger等人，2012年). CAGE标签聚类分析表明，1413个标签中有927个（65.6%，p值=5.78×10−168)具有CGI的孤儿二价结构域在22种组织类型中的至少1种中表达(图4B,表S3)(Kawaji等人，2009年). 同样，1473个样本中的461个（31.3%，p值=3.61×10−35)无CGI的孤儿二价结构域在22种组织类型中的至少1种中表达(图4B,表S3). 此外，两类孤儿二价结构域（有或无CGI）均显示出高度组织特异性表达(图4C)，高于二价发育调节因子（p值=1.1×10−141, 2.3×10−72分别），大脑区域优先激活(图4E). 有趣的是，我们在300个非编码RefSeq基因和从染色质状态推断的179个假定非编码RNA的PGC中发现了二价结构域(Guttman等人，2009年)和表达式数据(Carninci等人，2005年)(图4D,S2F（平方英尺）). 这些数据表明，与蛋白质编码的发育调节因子类似，一些非编码RNA在生殖系中是二价的，并在谱系承诺时处于激活状态。

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孤儿二价结构域重叠于CpG岛并显示组织特异性表达

（A） 基因（分配给基因，深灰色条）和孤立PGC二价结构域（白色条）到最近基因的距离，具有透明覆盖。距离以碱基对中基因组长度的对数基数10表示，从二价结构域到其最近基因的任意一个，其最近基因上游的二价结构区在对数后分配负距离。基因中出现的双价结构域被指定为基因组长度为1。TSSs被定义为RefSeq基因的起始位置（B）E11.5 PGCs中具有转录起始位点活性特征的孤儿二价结构域的数量：发生在使用CAP-Seq鉴定的非甲基化CpG岛（CGI）中(Illingworth等人，2010年)，在22种组织类型中的1种或多种组织中带有CAGE表达标签(Kawaji等人，2009年)或两者兼而有之。（C） CAGE标签簇表达的组织特异性分数在PGC中CGI的孤儿二价结构域、PGC中不含CGI的孤二价结构区、二价RefSeq基因和所有RefSeq基因组中的分布。p值来自Wilcoxon秩和检验。（D） UCSC基因组浏览器查看PGC和ESC中的孤儿二价结构域(Mikkelsen等人，2007年)与CGI重叠(Illingworth等人，2010年)和假定的非编码RNA(Guttman等人，2009年). RNA-Seq数据表明该区域在PGC中转录沉默(Seisenberger等人，2012年)和ESC(Marks等人，2012年)而CAGE标签数据表明海马体中有表达。（E） 基于在PGC中标记为孤儿二价结构域的区域中CAGE标记簇的二进制（开或关）表达状态的组织层次聚类。黄色表示表情，蓝色表示没有表情。另请参见表S2、S3。

讨论

在这项工作中，我们描述了一种适用于低数量细胞的优化ChIP协议，并将其用于检测小鼠PGC中H3K4me3和H3K27me3的全基因组和基因特异性分布。我们报告称发育调控基因仍然是二价的，并且转录沉默体内在整个E11.5-E13.5中，在PGC中，但不在相邻体细胞中，以与培养的ESC高度相似的方式。除了发育基因外，我们还发现了约3000个孤儿二价结构域，这些结构域富含CGI并以组织特异性方式表达。这里确定的一些二价结构域与我们推测可能具有发育功能的非编码RNA相对应，类似于二价基因，尽管这仍有待确定。这里的发现为胚胎生殖系中存在二价结构域提供了有力证据，并提出了一些重要问题。

二价启动子是否逃脱了E8.5–E13.5中PGC发生的表观遗传重编程？我们的数据支持H3K27me3可能作为一种潜在机制来补偿妊娠中期PGC中DNA甲基化或H3K9me2/3的缺失(佐佐木和松井，2008年). IF观察到的某些组蛋白标记的丢失也可能主要发生在基因组的丰富重复序列中，并且大多数是多余的独特基因，例如发育调节因子。本文报道的低细胞ChIP协议的应用应该有助于回答其他组蛋白标记和时间点的这个问题。

生殖系是否持续将体细胞程序保持在二价状态，直到下一代激活？目前尚不清楚为什么这么多重要的发育调节因子在发育中的生殖系中仍然是二价的，但在体细胞中却不是。双价性维持发育基因处于转录平衡状态的假设对于分化后激活这些基因的多能干细胞来说是直观的，例如ESCs(Azuara等人，2006年；Bernstein等人，2006年)或外胚层(Rugg-Gunn等人，2010年). PGCs中二价结构域的存在可能有助于阻止种系中体细胞程序的表达。我们的观察结果表明，发育调节因子可能在生殖系中处于被抑制但可获得的状态，以便在下一代受精后激活。二价性通过生殖系的传递可以为表观遗传提供基础。令人惊讶的是，最近的研究表明，精子基因组保持着核小体的残留水平，并且这些核小体在发育调节剂中富集了H3K4me3/H3K27me3二价标记(Hammoud等人，2009年). 确定在生殖系发育的其他阶段和卵母细胞中是否检测到二价性将是一件有趣的事情。对PGC中二价调节器的功能研究应该为这些问题提供重要的见解。

实验程序

PGC的隔离

转基因Oct4ΔPE:GFP报告子的雄性B6小鼠纯合子与瑞士韦伯斯特雌性小鼠杂交。在酶解用于FACS之前，分离并汇集多个胚胎的性腺区域。

低细胞ChIP-qPCR

将细胞合并成约50000个细胞的批次，并在室温下在PBS中的1%甲醛（Sigma F8775-25ml）中交联5分钟，然后用125mM甘氨酸淬火。对于每个IP，将11µl蛋白A Dynabeads（Life Technologies 1001D）与2.4µg抗H3K4me3（Diagenode pAb003-050）、H3K27me3（Millipore 07-449）或IgG（Abcam ab46540）在ChIP裂解缓冲液中预培养。在Lo-Bind微型离心管（Eppendorf 022431021）中溶解交联细胞，然后在BioRuptor声波仪（Diagenode UCD-200）中进行40分钟的超声处理，将其设置为高功率、7“开、15”关，每10分钟更换一次冰/水泥浆。

将裂解液在裂解缓冲液中稀释并清除碎片。将约50000个细胞中清除的裂解液分为四等分，一等分用于输入。剩下的三份等分样品（每个相当于约12500个细胞）用于H3K4me3、H3K27me3和IgG的IP。将裂解液与预制珠/抗体在4C温度下孵育过夜并混合。依次用裂解缓冲液清洗染色质/珠/抗体复合物三次，DOC缓冲液清洗一次，TE缓冲液清洗一遍，然后转移到新鲜的PCR管中。使用洗脱缓冲液（1%SDS，0.1M NaHCO3）洗脱染色质。IP和输入样本用RNaseA处理，然后用蛋白酶K处理。通过在65℃下摇晃过夜来逆转交叉链接。使用QiaQuick PCR纯化试剂盒（Qiagen 28104）进行DNA纯化。E11.5 ChIP数据代表了技术上复制的Dnmt3b以外的3-7个生物复制。额外的PGC数据表示除雄性E12.5外，至少有2个生物重复，这些雄性E12.5是技术上重复的。所有引物均列于补充文件1。完整协议位于补充实验程序。

低单元ChIP-Seq

ChIP材料的获得和处理如上文所述，并进行了以下修改。细胞在室温下用0.25%甲醛（Thermo Scientific 28906）在PBS中交联10分钟，然后用125mM甘氨酸淬火。使用Covaris声波仪对交联材料进行12’的声波处理，工作强度为5%，强度为3，脉冲强度为200。将由104000个和97000个细胞组成的E11.5 PGC的两份等分试样分别等分，以对H3K4me3、H3K27me3和输入控制进行ChIP。使用MinElute PCR纯化试剂盒（Qiagen 28004）纯化IP-DNA和输入，并使用ThruPLEX-FDPrep试剂盒（Rubicon Genomics）生成文库R40048号)IP-DNA扩增20个周期，输入DNA扩增15个周期。

ChIP-Seq分析

对每个ChIP-Seq库的读取进行过滤，以仅保留唯一序列(表S1). 使用领结将读数与mm9/NCBI构建37小鼠基因组对齐，并且仅保留一次读数映射。ESCs的数据以同样的方式处理，从GEO加入中获得GSE12241标准(Mikkelsen等人，2007年). 为了调用和比较PGC和ESC数据集之间的二价结构域，使用ChromHMM（v1.06）生成了基因组的13态分割(安永会计师事务所（Ernst and Kellis），2012年). 将四个样本（PGC H3K4me3、PGC H3G27me3、ESC H3K4me3、ESC H3K27me3）作为单个细胞类型的不同标记进行处理，以便对PGC和ESC的基因组分段进行直接和无偏见的比较。使用K-means聚类将每个样品的状态发射参数分为2组（“开”或“关”），并将13个ChromHMM分段状态中的每一个分类为每个细胞类型的“二价”、“仅H3K4me3”、“只H3K27me3”或“无”。将来自复制PGC库的数据汇集在一起进行此分析。来自Mikkelsen数据集的H3 ChIP-Seq数据被用作ESC样本的对照。

所有基因集分析都基于mm9 RefSeq基因集。为了确保与孤儿二价结构域的注释基因调控相关的二价结构区的保守分离，如果H3K4me3/H3K27me3富集区通过基因任何亚型的转录末端位点（TES）位于转录起始位点（TSS）上游0.2kb范围内，则认为基因是二价的。H3K4me3/H3K27me3富集区出现在TSS上游0.2kb范围外，通过基因任何亚型的TES，被称为孤儿。只有当没有亚型是二价的，并且任何亚型在TSS上游-0.2 kb到下游0.2 kb的窗口中只有H3K4me3区域时，基因才被视为H3K4me3。类似地，只有当基因既不是二价基因也不是H3K4me3时，以及如果任何亚型的H3K27me3区域仅出现在+/-0.2kb窗口中，才被认为是H3K17me3。使用DAVID对基因本体术语进行富集分析(Huang等人，2009年). 本文报告的ChIIP-Seq数据的基因表达综合登录号为GSE46396标准。

CAGE分析

从FANTOM 4中获得22种组织类型的CAGE标签簇位置（单位：mm9）和百万分位标签（tpm）值(Kawaji等人，2009年). 为了评估CAGE标签累积的统计意义，概率p我首先根据X区的CAGE标签表示估计每个孤儿二价结构域200bp内观察到的CAGE标记我含有二价结构域的蛋白质在各个方向延伸了10kb。让Y我是指示随机变量，指示X中观察到的二价结构域我在200 bp内有一个可检测的CAGE标记簇。假设Y我是概率为p的独立伯努利随机变量我，Y的总和我与平均∑近似正态我第页我和方差∑我第页我（1−p我)，通过Lyapunov中心极限定理（参见补充实验程序)。

组织特异性计算

对于每个CAGE标签簇，组织特异性得分是根据跨组织类型的tpm值相对丰度与仅在标签簇具有最大表达值的一种组织类型中表达的极限分布之间的Jensen-Shannon差异计算的(Cabili等人，2011年)。

​

集锦

  • 使用<10000个细胞分析组蛋白标记的ChIP-Seq/qPCR协议
  • E11.5 PGCs在发育调节因子上具有二价结构域，与ESCs非常相似
  • PGC中发育基因在E11.5至E13.5期间保持二价和沉默
  • 已知基因远端的双价结构域标记组织特异性、非注释性启动子

补充材料

01

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02

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03

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04

单击此处查看。（1019K，xlsx）

05

单击此处查看。（187K，pdf）

鸣谢

MS构思了该项目。MRS和MS在JSS的参与下指导项目。MS和MRS在KB和KTE的参与下制定了研究设计。MS开发了低细胞ChIP协议，进行了ChIP和表达实验，并对其进行了分析。MS、KB和KTE分离的PGC。KTE进行了所有FACS。MS生成的ChIP-Seq库。在UC DAVIS表达分析核心进行测序。CO在JSS的帮助和监督下分析了大多数全基因组数据。MS和MRS撰写了手稿。所有作者都阅读、帮助撰写和编辑手稿。我们感谢Jehnna Ronan为开发ChIP分析提供的建议，感谢Santos实验室成员的讨论，感谢Robert Blelloch、Diana Laird、Marco Conti和Barbara Panning对手稿的批判性阅读。K.B.是美国国家科学基金会（NSF）博士前奖学金的获得者。K.T.E.是CIRM博士后培训补助金（TG2-01153）的接受者。这项工作由J.S.S.的U54HD055764和M.R.-S的NIH新创新者奖（DP2OD004698）资助。

脚注

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