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分子细胞生物学。2013年7月；33(13): 2574–2585.
数字对象标识：10.1128/立方米.01677-12
PMCID公司：PMC3700113型
PMID：23608533

p90 RSK2通过转录依赖和独立机制介导抗失巢信号

金灵涛,一 李丹（Dan Li）,一 李钟硕,一 香农精灵,一 吉娜·N·阿莱西,一 范军（Jun Fan）,一 喜邦康,一 王东生,一 海安福,b条 杰克·汤顿,c（c） 提图斯·博根,d日 梅根·塔克,e（电子） 丁磊谷,e（电子） 卓国晨,一 董明信（Dong M.Shin）,一 法德洛·R·库里,一和苏敏康通讯作者一
作者信息 文章注释 版权和许可证信息 PMC免责声明

摘要

侵袭性和转移性肿瘤细胞如何逃避失巢诱导尚不清楚。我们发现，敲低RSK2可使多种癌细胞对失巢凋亡诱导敏感，失巢凋亡是通过磷酸化靶点介导的，包括凋亡信号调节激酶1（ASK1）和环腺苷酸（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）。我们提供证据表明，RSK2通过磷酸化S83、T1109和T1326来抑制ASK1，其机制是磷酸化-T1109/T1326抑制ATP与ASK1的结合，而磷酸化-S83减弱ASK1底物MKK6的结合。此外，RSK2→CREB信号通路通过调节参与细胞死亡调节的蛋白效应器的基因表达，包括抗凋亡因子蛋白酪氨酸激酶6（PTK6）和促凋亡因子生长抑制蛋白3（ING3），提供抗噪声保护。PTK6过度表达或ING3敲除以及ASK1敲除进一步挽救了RSK2敲除细胞对失巢诱导敏感性的增加。这些数据共同表明，RSK2作为一个信号整合子，以转录依赖和依赖的方式向癌细胞提供抗噪声保护，部分通过ASK1和CREB发出信号，并促进癌细胞侵袭和肿瘤转移。

简介

转移是肿瘤进展过程中最危险的转变，涉及一系列复杂的事件。由于失去与细胞外基质的接触，上皮细胞通常会经历“失巢”，这是一种凋亡过程，为转移的发展提供了强大的生理屏障。抗失巢症是转移性癌症的一个特征，在转移性癌症中，细胞需要在依赖凤尾鱼的环境中生存，并在苦行僧的体液中生存，然后才能侵入远处的器官。然而，转移性肿瘤细胞对失巢凋亡过程产生耐药性的信号机制尚不清楚(1,2).

我们最近报道，RSK2的持续表达有助于维持头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）细胞的侵袭和转移潜能在体外和体内分别为(三). 丝氨酸/苏氨酸激酶RSK2是细胞外信号调节激酶（ERK）的底物，属于包含RSK1到RSK4的家族。RSK家族成员包含两个不同的激酶结构域，这两个结构域都具有催化功能（参考文献综述4和5). C端激酶结构域负责Ser386的自磷酸化，这对RSK的激活至关重要，而N端激酶结构域磷酸化RSK的下游底物(6). RSK2参与各种细胞过程，包括基因表达、细胞周期、细胞存活和增殖。RSK2磷酸化多个信号效应器以调节多种细胞功能，包括通过磷酸化转录因子如环腺苷酸（cAMP）反应元件结合蛋白（CREB）的基因表达(7)组蛋白H3(8)在有丝分裂和转录激活过程中重塑染色质；通过磷酸化和抑制Myt1来调节细胞周期(9)p34cdc2抑制激酶；通过磷酸化BAD和细胞存活(10)，比姆(11)和死亡相关蛋白激酶（DAPK）保护细胞免受凋亡。

CREB是一种转录因子，其信号传导与促进肿瘤进展、刺激生长、赋予细胞凋亡抗性和支持血管生成有关。CREB与雄激素依赖性进展相关并促进前列腺癌骨转移(12). 此外，CREB显性阴性形式的表达使黑色素瘤细胞凋亡敏感，并抑制其生长和转移(13–16). RSK2通过磷酸化Ser133激活CREB(17). 然而，没有文献报道RSK2→CREB途径在失巢凋亡调控中的作用。

在这里，我们证明RSK2信号对保护多种转移性人类癌细胞（包括肺癌、乳腺癌和头颈癌细胞）免受失巢凋亡通常很重要。我们使用磷酸抗体微阵列进行的基于磷蛋白组学的研究确定了两个RSK2磷酸化靶点，这两个靶点对于介导癌症细胞中RSK2依赖性抗噪声信号非常重要，包括CREB和一种新确定的RSK2底物，凋亡信号调节激酶1（ASK1）。ASK1是一种有丝分裂原活化蛋白激酶（MAPK）激酶激酶，可被多种应激相关刺激激活，包括氧化应激、血清撤退、内质网应激和钙内流。活化的ASK1磷酸化并激活两种不同的下游激酶，MAPK激酶激酶4（MKK4）/MKK7和MKK3/MKK6，它们分别激活c-Jun N末端激酶（JNK）和p38 MAPK，从而诱导细胞凋亡。ASK1激酶活性以多种方式调节，包括磷酸化。例如，AKT和PIM1通过磷酸化ASK1 S83抑制ASK1，使ASK1在非应激条件下保持非活性。相反，应激信号诱导ASK1 S83去磷酸化并恢复ASK1活性(18–20). 然而，S83的磷酸化如何抑制ASK1尚不清楚。

在这里，我们报告了RSK2通过在两个新发现的位点T1109和T1326以及S83的磷酸化抑制ASK1，从而促进抗失巢凋亡。我们提供的证据表明，T1109/T1326处的磷酸化减弱了ATP与ASK1的结合，而S83磷酸化通过阻断底物MKK6的结合来抑制ASK1。此外，我们发现RSK2通过分别抑制ASK1和激活CREB，以转录依赖和依赖的方式保护转移癌细胞免受失巢凋亡诱导，其中CREB协调促凋亡效应物如蛋白酪氨酸激酶6（PTK6）的基因表达和抗凋亡效应物，如生长抑制蛋白3（ING3）。

材料和方法

试剂。

靶向RSK2、ASK1、CREB、PTK6、ING3和增强型绿色荧光蛋白（eGFP）的慢病毒短发夹RNA（shRNA）载体购自Open Biosystems。ASK1、CREB和ING3小干扰RNA（siRNAs）购自Qiagen。RSK特异性抑制剂fmk如前所述(21). SL0101从多伦多研究化学品公司购买，Wortmann和PIM1抑制剂quercetagetin从圣克鲁斯购买。之前描述过RSK2构造(22–24). shRNA-靶向区域的沉默突变产生了人RSK2的shRNA-resistant形式。从Invitrogen中获得重组活性人RSK2。重组非活性人MKK6是从Millipore获得的。髓磷脂碱性蛋白（MBP）是从Sigma中获得的。血凝素（HA）-ASK1的构建物（由Haian Fu提供）通过PCR进行myc标记，并亚克隆到pDEST27和pLHCX衍生的Gateway目的载体中，如前所述，用于在人类细胞系中表达(25). 产生pET60-ASK1变体用于细菌重组蛋白纯化。pCMV6-flag-PTK6来自Origene。ING3的图像克隆是从Open Biosystems购买的。将Flag-ING3变体亚克隆到逆转录病毒载体pLHCX中。使用QuikChange-XL定点突变试剂盒（Stratagene）生成了各种突变体。

细胞培养。

293T和SKBR3细胞在含有10%胎牛血清（FBS）的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM）中培养。212LN和A549细胞分别在DMEM和Ham’s F-12培养基以及含有10%FBS的RPMI 1640的1:1混合液中培养。为了产生表达ASK1和ING3的细胞系，通过使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将携带ASK1及ING3基因的逆转录病毒载体pLHCX转染到212LN细胞中。为了击倒内源性人类RSK2、CREB、ASK1、PTK6和ING3，用编码shRNA、pHRCMV8.2ΔR和巨细胞病毒-水泡性口炎病毒G蛋白（CMV-VSVG）的慢病毒载体转染293T细胞，产生携带shRNA的慢病毒。用收获的慢病毒感染细胞48小时进行短暂感染，或用2μg/ml嘌呤霉素选择细胞1周进行稳定选择。

抗体。

抗RSK2、糖原合成酶激酶3α/β（GSK3α/？）、ASK1、MBP、PIM1和PTK6的抗体来自圣克鲁斯生物技术公司。抗myc、HA、磷酸化-RSK（Ser380）、磷酸化-GSK3α/β（Ser21/9）、磷酸盐-ASK1（Ser83、Ser967和Thr845）、磷酸盐-p38（Thr180/Tyr182）、p38、磷酸化-压力活化蛋白激酶（phospho-SAPK）/JNK（Thr183/Tyr185）、ASK1、SAPK/JNK、MK6、CREB、AKT和甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）的抗体是从细胞信号技术（CST）获得的。抗Flag抗体，谷胱甘肽秒-转移酶（GST）和β-肌动蛋白来自Sigma。从Abcam中获得磷酸-丝氨酸/苏氨酸抗体。抗ING3抗体来自Proteintech。

重组人ASK1蛋白的纯化。

GST融合的人ASK1蛋白通过超声波纯化大肠杆菌从250 ml含有0.5 mM异丙基-β的培养物中获得的BL21（DE3）/pLysS细胞-d日-在25°C下诱导硫代吡喃半乳糖苷（IPTG）。将细胞裂解物装入磷酸盐缓冲液（PBS）中的谷胱甘肽-脑葡萄糖4B柱上，并用洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl，10 mM还原谷胱甘苷[pH8.0]）洗脱。蛋白质在PD-10柱上脱盐，通过考马斯染色和Western blotting检测纯化效率。

体外激酶分析。

进行RSK2激酶分析以确定RSK2是否磷酸化ASK1。纯化的重组GST融合ASK1野生型（WT）和K709M激酶缺失突变体与重组活性RSK2在含有20 mM吗啉丙基磺酸（MOPS）、5 mM EGTA、1 mM二硫苏糖醇（DTT）、25 mMβ-磷酸甘油、1 mM-Na的溶液中孵育三沃4和15 mM氯化镁2以及10 mM醋酸镁（MgAc）和0.1 mM ATP，在30°C下保持30分钟。ASK1的Ser83、Ser967或Thr845的磷酸化由相应的特异性磷酸化抗体检测。为了测定ASK1的激酶活性，采用MKK6或MBP作为底物进行激酶测定。在存在或不存在组成活性RSK2 Y707A突变体的情况下，用GST-ASK1变体转染293T细胞24小时。用谷胱甘肽-脑葡萄糖4B柱拉下细胞裂解液中的GST-ASK1变体。清洗小球，然后通过添加底物和含有40 mM MOPS（pH 7.2）、10 mM MgCl的激酶缓冲液启动激酶反应2和200μM ATP在30°C下保持30分钟。通过添加载蛋白6×SDS缓冲液停止反应。对样品进行SDS-PAGE，通过Western blotting分析ASK1对MKK6或MBP的磷酸化状态。

ATP结合分析。

GST-ASK1变异体从没有或与组成活性RSK2 Y707A突变体共表达的293T细胞中提取。将具有结合的GST-ASK1变体的珠粒用PBS洗涤，然后用4μCi[α-32P] 在30°C的ASK1激酶缓冲液中ATP作用5分钟。然后用PBS洗涤珠子两次。用30μl洗脱缓冲液（50 mM Tris-HCl和10 mM还原谷胱甘肽[pH8.0]）洗脱珠子结合的ASK1蛋白30 min，然后通过液体闪烁计数检测放射性。

Anoikis分析。

电池（5×105在37°C、5%CO的条件下，在1%琼脂处理的6孔组织培养板上培养48至72小时2大气。培养后，在完全培养基中收集悬浮细胞，并以1200 rpm离心5 min。用PBS清洗颗粒，并根据制造商的协议（BD Pharmingen）用碘化丙啶（PI）溶液和异硫氰酸荧光素（FITC）结合的膜联蛋白V进行染色。染色细胞通过荧光激活细胞分选仪（FACS）分析凋亡人群。

微阵列数据收集和分析。

使用TRIzol和Promega SV RNA分离试剂盒分离RNA。基因剖析前对RNA进行质量控制分析。对RNA样品进行处理并将其杂交到Affymetrix人类基因组U133Plus2.0芯片上。使用DNA-Chip Analyzer软件分析原始表达值(26). 原始强度值根据秩不变探针集进行归一化，然后通过基于模型的表达式计算表达值(26). 为了确认再现性，我们从三倍数据中进行了层次聚类，这些数据大多聚集在一起。选择了一组高度可变的基因，变异系数在0.2到10之间，并且在所有样本中至少有20%的样本存在。得到的6060个探针集用于分层聚类。

定量RNA分析。

从1×10提取总RNA6细胞使用RNeasy（Qiagen）。使用第一链cDNA合成试剂盒（Amersham）对细胞总RNA进行逆转录。使用SYBR green（Bio-Rad Laboratories）实时检测PTK6、ING3和GAPDH mRNA水平。用以下寡核苷酸作为引物，测定PTK6、ING3和GAPDH的mRNA水平：PTK6阳性引物5′-TGTGGAGTCTGCCCAATAC-3′和反义引物5’-AGGCCAAGCTCTCAAGACAAGAGAA-3′，ING3阳性引物5'-CAGCCTCTTAACAATGCTA-3′和反义引物5′-CTTCATCAAAAAGACCACACC-3′，GAPDH阳性引物5′-GACATCAAGAGGTGGTGAA-3′和反义引物5’-TGTCATACCAGAAATGAGC-3′。

结果

RSK2促进转移性人类癌细胞的抗失巢凋亡。

为了确定RSK2在人类癌症细胞的抗噪声信号传导中是否重要，我们使用几个人类转移癌细胞，包括头颈癌212LN、乳腺癌SKBR3和肺癌A549细胞，生成了RSK2敲除稳定的细胞系。我们发现，与含有空载体或eGFP shRNA的对照细胞相比，使用两种不同的shRNAs稳定地敲除RSK2可使212LN、SKBR3和A549细胞敏化，以分离诱导的失巢凋亡，如annexin V染色和caspase 3/7活性测定所评估的(图1B)然而，我们发现由蛋白合成抑制剂环己酰亚胺（CHX）诱导的细胞凋亡没有显著影响(图1A). 此外，RSK2的敲除使212LN、SKBR3和A549细胞对失巢凋亡诱导敏感，而这种表型通过小鼠组成活性形式（RSK2 CA）（Y707A）的RSK2表达或对靶向人类RSK2 shRNA的shRNA具有抗性的人类RSK2CA的shRNA抗性形式的表达得以挽救(图1C). 相反，RNA干扰（RNAi）介导的RSK2敲除对非肿瘤原性人类上皮细胞系HaCaT和BEAS-2B中分离诱导的失巢凋亡没有显著影响（数据可根据要求提供）。然后我们检查了RSK特异性抑制剂fmk(21)抑制RSK2激酶活性，也能使212LN、SKBR3和A549细胞对失巢凋亡敏感。我们观察到，通过S386磷酸化（RSK2活化指数）评估，fmk治疗有效降低了RSK2激酶活性(图1D，顶部）。与RSK2敲除一致，fmk处理显著提高了细胞对失巢诱导的敏感性(图1D，顶部）。使用另一种RSK抑制剂SL0101也获得了类似的结果(图1D，底部）(27). 这些数据共同表明，RSK2在多种转移癌细胞中介导抗噪声信号。

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RSK2的缺失使多种癌细胞对失巢凋亡诱导敏感。（A） 与携带空载体的对照细胞相比，shRNA对RSK2的稳定敲除不影响对照剂环己酰亚胺（CHX）诱导的细胞凋亡。（B） 与含有空载体或含有靶向eGFP的shRNA载体的对照细胞相比，两个不同shRNA克隆对RSK2的稳定敲除可使转移性HNSCC 212LN（左）、乳腺癌SKBR3（中）和肺癌A549（右）细胞敏化为分离诱导的失巢凋亡。细胞培养在1%琼脂处理的培养皿上以实现分离，对照细胞用抗癌剂环己酰亚胺（蛋白质生物合成抑制剂）处理以诱导凋亡。通过FACS分析FITC-结合膜联蛋白V和碘化丙啶（顶部）染色的细胞，或使用caspase-Glo 3/7分析（底部）通过caspase 3/7活性评估细胞凋亡。（C） 小鼠RSK2（顶部）或shRNA-resistant人类RSK2的过度表达（底部）挽救了RSK2击倒诱导的失巢凋亡，并赋予细胞抗失巢凋亡的能力。在失巢诱导之前，用小鼠RSK2 Y707A cDNA或抗shRNA-人RSK2 Y707A基因瞬时转染稳定的RSK2敲除细胞。（D） 用小分子RSK抑制剂、fmk（10μM）（顶部）或SL0101（100μM）（底部）有效降低RSK2激酶活性，并使212LN、SKBR3和A549细胞敏化以诱导失巢凋亡。对于fmk治疗，RSK2活性通过RSK2免疫沉淀（IP）和Western blotting（WB）进行评估，使用识别磷酸-S380（S386表示RSK2编号）的特定磷酸-RSK抗体。针对SL0101评估RSK2底物GSK3α/β的磷酸化。P（P）值由Student的t吨测试。图中所示的所有误差条表示三个独立实验的平均值±标准偏差（*，0.01<P（P）< 0.05; ∗∗,P（P）< 0.01; ns，不显著）。

RSK2通过抑制促凋亡ASK1保护癌细胞免受失巢凋亡诱导。

为了破解RSK2介导的抗noikis信号传导的分子机制，我们使用MAPK途径磷酸化抗体微阵列（Full Moon BioSystems，Inc.）进行了一项磷蛋白组学研究，以分析有或没有稳定的RSK2敲低的细胞中蛋白质的磷酸化状态。我们在RSK2稳定敲除的转移性212LN和886LN细胞系中鉴定了几种磷酸化水平下降和升高超过15%的抗凋亡和促凋亡蛋白因子。特别是，我们发现与含有空载体的相应对照细胞相比，RSK2敲除显著降低转移性HNSCC细胞中ASK1 S83磷酸化和CREB S133磷酸化(图2A). 由于ASK1和CREB在细胞生存和凋亡调节中的关键作用，我们决定在剩下的研究中重点关注它们在RSK2介导的抗噪声信号传导中的作用。

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RSK2抑制ASK1以保护转移癌细胞免受脱落诱导的失巢凋亡。（A） 磷酸抗体微阵列分析确定了RSK2的新磷酸化靶点，当RSK2被shRNA稳定敲除时，其磷酸化状态在HNSCC细胞中降低。测定了磷酸化蛋白的信号强度和总蛋白水平。每种蛋白质的比率被确定为HNSCC-pLKO.1-RSK2 shRNA和HNSCC-pLKO.1细胞中磷酸化蛋白质在总蛋白质中的百分比之比。在RSK2敲除的转移性HNSCC中，磷酸化状态的抗凋亡或促凋亡蛋白因子减少或增加超过15%。与对照细胞相比，抑制ASK1的S83磷酸化在886LN细胞中降低了31%，RSK2被稳定击倒。（B和C）敲低或过度表达促凋亡ASK1导致212LN细胞对失巢凋亡诱导的敏感性降低（B）或增加（C）。（D） RNAi介导的ASK1敲低减弱了212LN（左）和SKBR3（右）细胞对失巢凋亡诱导增加的敏感性，RSK2稳定敲低。（E） 特异性RSK抑制剂fmk（6μM）对RSK2的抑制导致212LN细胞对失巢凋亡诱导的敏感性增加，而ASK1的敲除可挽救fmk治疗的细胞的表型。（F） 组成活性形式RSK2（Y707A突变体）的过度表达导致ASK1激酶活性降低。GST标记的ASK1在293T细胞中与RSK2 Y707A突变体共表达或不表达。GST-ASK1被GST珠拉下，用于在体外使用重组、非活性人类MKK6蛋白作为外源底物进行ASK1激酶检测。ASK1活性通过特定磷酸化-Ser/Thr抗体检测到的MKK6磷酸化水平进行评估。（G） Western blot结果显示，组成活性形式的RSK2（Y707A突变体）的表达导致212LN细胞中p38（左）和JNK（右）的激活水平降低。分别通过识别磷酸化p38和磷酸化SAPK/JNK的特异性抗体评估p38和JNK激活。（H） RSK2的稳定敲除导致212LN细胞中p38和JNK的磷酸化和激活水平增加。

我们发现，在212LN细胞中使用两个不同的shRNA克隆稳定地敲除ASK1可显著降低脱落诱导的失巢凋亡(图2B)myc-ASK1的稳定过表达使212LN细胞对失巢凋亡诱导敏感(图2C). 与我们上述观察结果一致(图1A和​和B），B类)在212LN和SKBR3细胞中，RSK2的敲除显著提高了细胞对失巢凋亡的敏感性。然而，与RSK2敲除细胞相比，在稳定敲除RSK2的细胞中敲除ASK1后，由于缺乏RSK2，部分挽救了表型，导致对失巢凋亡诱导的抵抗增加(图2D). 此外，fmk对RSK2的抑制使212LN细胞对失巢凋亡的诱导敏感(图2E，左），而ASK1的敲除对fmk敏化的失巢凋亡诱导产生抵抗(图2E，右侧）。此外，组分活性形式RSK2（Y707A）的过度表达显著降低了ASK1激酶活性在体外以MAPK激酶激酶6（MKK6）为底物的ASK1激酶检测(图2F). 此外，组成活性RSK2 Y707A突变体的过度表达降低了p38和JNK通路的激活，这是ASK1的下游信号级联(图2G、左侧和右侧）。RSK2的敲除导致转移性212LN细胞中p38和JNK的磷酸化增加(图2H). 这些结果共同表明，RSK2抑制ASK1在癌细胞中介导RSK2依赖性抗噪声信号。

RSK2通过磷酸化抑制ASK1。

我们接下来证实，转移性212LN细胞中shRNA对RSK2的抑制使ASK1的S83磷酸化水平降低了63%(图3A). 相反，敲低AKT1仅导致ASK1的S83磷酸化水平下降12%，而敲低PIM1并没有减弱ASK1中S83磷酸化的状态（可根据要求获得数据）。此外，用RSK抑制剂fmk治疗可使ASK1的S83磷酸化水平降低50%，而用AKT抑制剂沃特曼（wortmannin）治疗可使S83磷酸化水平降低25%。相反，使用PIM1抑制剂槲皮素治疗不会影响ASK1的S83磷酸化水平（可根据要求提供数据）。这些数据表明，RSK2是负责转移性212LN细胞中ASK1 S83磷酸化的主要上游激酶之一。

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RSK2通过磷酸化S83抑制ASK1。（A） 敲除RSK2导致212LN细胞中ASK1磷酸化-S83水平降低。通过特异性磷酸化-ASK1抗体（p-S83）评估磷酸化-S83水平。（B） 强化RSK2表达导致S83磷酸化水平增加，但ASK1的S967或T845磷酸化水平没有增加。用HA标记的组成活性RSK2 Y707A突变体瞬时转染293T细胞。内源性ASK1的S83、S967和T845磷酸化水平是通过使用识别单个磷酸化位点的特异性磷酸化-ASK1抗体来测定的。（C） RSK2在S83直接磷酸化ASK1，但在S967或T845不磷酸化。安在体外使用重组活性RSK2（rRSK2）与WT重组ASK1（rASK1）或激酶缺失突变形式K709M孵育，从大肠杆菌.（D）RSK2在S83直接磷酸化WT ASK1，但无法磷酸化S83A突变体。纯化的重组WT ASK1和S83A突变蛋白用于在体外RSK2激酶测定。（E） 安在体外使用GST标记的ASK1 K709M突变体进行RSK2激酶分析，该突变体通过GST下拉富集293T细胞。

此外，293T细胞中RSK2组成活性形式HA-RSK2 Y707A的过度表达增加了内源性ASK1的S83磷酸化，但不影响S967或T845的ASK1磷酸化水平(图3B). 此外，在在体外以重组活性RSK2（rRSK2）和纯化野生型（WT）、重组ASK1（rASK1(图3C和​和D）。D类). 与此观察一致，从细胞中富集的ASK1激酶缺失突变体也在S83被rRSK2直接磷酸化(图3E). 此外，RSK2与细胞质中的ASK1以磷酸化诱导依赖的方式相互作用和共定位（数据可根据要求提供）。这些数据表明ASK1是RSK2的新底物。

RSK2磷酸化ASK1的两个新位点T1109和T1326，这两个位点对ASK1起抑制作用。

接下来，我们想知道RSK2是否在S83之外的多个位点磷酸化ASK1。因此，我们执行了在体外使用纯化的GST-ASK1蛋白进行激酶分析，该蛋白来自与重组活性RSK2孵育的细胞。将样品应用于SDS-PAGE凝胶上，并切除含有磷酸化ASK1蛋白的条带，用于液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）。基于质谱的分析确定了另外两个新的ASK1残基，它们被RSK2、T1109和T1326磷酸化(图4A). 为了研究T1109/T1326磷酸化在ASK1激活中的作用，我们对ASK1中的T1109、T1326或两者进行了突变分析。然后我们进行了免疫沉淀偶联在体外在293T细胞中，以髓磷脂碱性蛋白（MBP）作为外源性底物，使用不同的ASK1变异体与组成活性RSK2 Y707A突变体共存进行ASK1激酶检测。有趣的是，尽管RSK2同样抑制ASK1 T1109A和T1326A单突变体以及WT ASK1(图4B)同时替换T1109和T1326显著减弱了RSK2对ASK1激酶活性的抑制作用(图4C). 这些结果表明，RSK2在T1109和T1326的磷酸化是介导对ASK1的抑制作用所必需的，而在这两个位点中的任何一个的磷酸化都是不足的。此外，RSK2的稳定敲除使细胞对失巢凋亡诱导敏感，而ASK1磷酸拟态T1109D/T1326D突变体的表达，而非WT的表达，部分挽救了这些细胞对失腺凋亡诱导敏感性的增加(图4D).

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T1109和T1326被鉴定为新的RSK2磷酸化位点，当磷酸化时，抑制ASK1。（A） 含有T1109和T1326的ASK1的磷酸苏氨酸肽片段的质谱光谱。从293T细胞纯化的GST-ASK1 K709M蛋白与重组活性RSK2孵育。摘除SDS-PAGE凝胶条带并用于LC-MS/MS。（B和C）T1109、T1326或S83的替换并不影响ASK1激酶活性的RSK2依赖性衰减（B），而T1109A/T1326A双突变体对RSK2依存性抑制（C）表现出抗性。在293T细胞中存在或不存在组成活性形式的RSK2（Y707A突变体）时，不同GST标记的ASK1变异体共存。在转染后24小时，收集细胞，并用GST珠拉下GST-ASK1蛋白。安在体外以髓磷脂碱性蛋白为底物进行ASK1激酶检测。（D） ASK1 T1109D/T1326D突变以显性阴性形式表达，导致RSK2敲除细胞中WT ASK1的促凋亡活性低于WT ASK1。用ASK1变异体瞬时转染RSK2敲除细胞。在转染后48小时进行失巢分析。

T1109/T1326和S83处的磷酸化分别通过减弱ATP和底物MKK6结合来抑制ASK1。

接下来，我们探讨了S83和T1109/T1326磷酸化介导的ASK1抑制的分子机制。我们发现RSK2的共表达导致[α-32P] ATP与WT ASK1和S83A突变体结合，而T1109/T1326的替代消除了ATP与ASK1结合的RSK2依赖性衰减(图5A). 相反，RSK2的共表达显著减弱了ASK1底物MKK6与WT ASK1和T1109A/T1326A突变体的结合，而S83的替代则在RSK2过度表达的情况下逆转了减弱的MK6与ASK1的结合(图5B). 这些结果表明RSK2介导的S83和T1109/T1326磷酸化抑制ASK1的新分子机制。

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T1109/T1326和S83处的磷酸化分别通过减弱ATP和底物结合抑制ASK1。（A，左）替换T1109/T1326，而不是S83，逆转了在RSK2 CA（组成活性Y707A突变形式）存在下与ASK1的ATP结合减少。在有或无RSK2 CA的情况下表达的GST-ASK1变体通过GST下拉从293T细胞裂解物中富集，然后用[α-32P] ATP。未绑定[α-32P] ATP被冲走，并结合[α-32P] 用闪烁计数器测量ASK1上的ATP。（右）Western blot结果显示293T细胞中GST-ASK1和RSK2的表达水平。（B） 在S83而不是T1109/T1326突变，导致在RSK2 CA存在的情况下MKK6与ASK1的结合增加。GST-ASK1变异体从与RSK2 CA共存或不存在的细胞中被拉下。免疫印迹检测到结合的内源性MK6。（左）代表性免疫印迹结果。（右）来自三个不同实验的MKK6谱带的相对强度，归一化为没有RSK2表达的对照样品的值。

RSK2→CREB途径部分通过上调抗凋亡因子PTK6的基因表达和下调促凋亡因子ING3的基因表达来保护癌细胞免受失巢凋亡。

RSK2通过磷酸化S133激活转录因子CREB(17). 我们之前表明，RSK2至少部分通过下游底物CREB的磷酸化和活化促进HNSCC细胞侵袭(三). 为了探索RSK2-CREB介导的抗噪声信号的分子机制，我们使用稳定敲除RSK2或CREB的转移性212LN细胞进行了DNA微阵列分析。我们在212LN细胞中鉴定出115个和45个通常下调和上调的基因，分别是稳定敲除单个RSK2敲除和CREB敲除的细胞的1.5倍以上(图6A，顶部）。在这些基因中，我们发现一些抗凋亡蛋白因子，包括蛋白酪氨酸激酶6（PTK6）、PTEN诱导的假定激酶1（PINK1）和间皮素（MSLN），转录下调。相反，我们发现一些促凋亡效应物，包括生长抑制蛋白3（ING3）、细胞骨架相关蛋白2（CKAP2）和转录因子AP-2α（TFAP2A），转录上调。它们都是RSK2→CREB信号转导的新转录靶点(图6A，底部）。

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RSK2通过CREB信号转导上调抗凋亡因子PTK6和下调促凋亡因子ING3，保护细胞免受失巢凋亡诱导。（A） DNA微阵列分析确定RSK2→CREB信号通路的新转录靶点。（上图）显示与携带空慢病毒载体的对照细胞相比，来自具有RSK2 shRNA和CREB shRNA个体表达的212LN细胞的下调（115个基因）（左）或上调（45个基因）（右）的重叠转录靶点的图。（中）在RSK2和CREB击倒细胞中下调的代表性新RSK2→CREB转录靶点，包括抗凋亡因子PTK6、PINK1和MSLN。（下图）在RSK2和CREB敲除细胞中上调的代表性新RSK2→CREB转录靶点，包括促凋亡因子ING3、CKAP2和TFAP2A。与含有空载体的对照细胞相比，RSK2和CREB敲除细胞的mRNA水平变化（折叠）显示在中间和底部面板的底部行。（B） 实时逆转录-PCR结果显示，与空载体对照细胞相比，RSK2或CREB稳定敲除的212LN细胞中抗凋亡因子PTK6（左）的mRNA水平降低，促凋亡因子ING3（右）的mRNA水平升高。（C） Western blot结果显示，在RSK2（顶部）或CREB（底部）稳定敲除的212LN细胞中，PTK6和ING3的蛋白水平分别降低和升高。（D） 实时逆转录-PCR结果显示，在用增加浓度的RSK抑制剂fmk处理24小时的212LN细胞中，PTK6（左）和ING3（右）的mRNA水平分别降低和增加结果增加了癌细胞对anoikis诱导的敏感性。（F） 在稳定敲除RSK2的212LN和SKBR3细胞中，Flag-tagged PTK6的表达显著减弱了对失巢凋亡诱导增加的敏感性。（G） 在RSK2基因敲除的212LN和SKBR3细胞中，ING3基因敲除导致对失巢凋亡诱导增加的敏感性显著减弱。annexin V染色评估凋亡细胞死亡。

我们决定关注PTK6和ING3在RSK2→CREB抗噪声信号传导中的作用，因为它们在调节细胞生存和凋亡方面具有重要作用。PTK6（也称为Brk）属于Src家族，在多种肿瘤类型中经常过度表达。PTK6的表达可能通过调节IGF-1R的表达和磷酸化来提高失去基质附着的乳腺癌和卵巢癌细胞的生存率，而PTK6基因的敲除则诱导这些细胞的凋亡(28–31). ING3是ING肿瘤抑制家族蛋白的成员，参与细胞凋亡、细胞生长和癌症进展，包括侵袭和转移的调节(32,33). ING3在HNSCC和黑色素瘤中的表达显著降低(34–36)可能通过Fas/caspase-8途径促进紫外线诱导的黑色素瘤细胞凋亡。阻断ING3降解促进癌细胞凋亡(37). 我们进行了实时定量PCR和Western blotting，并证实212LN细胞中RSK2或CREB的稳定敲除降低了抗凋亡因子PTK6的基因和蛋白表达水平(图6B和增加促凋亡因子ING3的表达水平(图6B、右侧和C）。此外，RSK特异性抑制剂fmk对RSK2激酶活性的抑制也降低了抗凋亡因子PTK6的mRNA水平，增加了促凋亡因子ING3的mRNA含量(图6D).

我们发现，CREB或PTK6的敲除，或WT ING3或K96R组成活性突变体的过度表达，会使癌细胞对分离诱导的失巢凋亡敏感(图6E). 此外，由于RSK2缺失，PTK6在RSK2敲除细胞中的过度表达显著降低了212LN和SKBR3细胞对失巢凋亡诱导的敏感性(图6F)，而在RSK2敲除212LN和SKBR3细胞中敲除ING3部分挽救了由于RSK2缺乏而增加的对分离诱导的失巢凋亡的敏感性(图6G). 这些数据共同表明，除了RSK2-ASK1抗噪声信号外，RSK2还通过激活CREB来调节PTK6和ING3的基因表达，以转录依赖的方式为转移性癌细胞提供抗噪声保护。

RSK2通过ASK1和CREB分别以转录依赖和依赖方式提供抗噪声信号。

接下来，我们确定RSK2是否协调ASK1和PTK6/ING3，以对转移癌细胞提供抗噪声优势。事实上，与只有ASK1敲除的细胞相比，PTK6的过度表达或ING3的敲除以及ASK1的敲除增强了RSK2稳定敲除细胞中减弱的anoikis诱导(图7A和​和B，B类）。这些数据共同表明，RSK2作为信号集成商，以转录依赖和依赖方式向癌细胞提供抗噪声保护，部分通过ASK1和CREB分别发出信号，赋予人类癌症生存和转移优势(图7C).

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RSK2通过ASK1和CREB转录靶点介导抗噪声信号。（A和B）敲除RSK2导致对失巢凋亡诱导的敏感性增加，敲除ASK1可显著挽救该表型，而同时敲除ASK1和过度表达PTK6（A）或敲除ING3（B）可进一步起到挽救作用。将稳定的RSK2敲低细胞与ASK1 siRNA和Flag-PTK6或ING3 siRNA瞬时共转染24小时，然后转移到琼脂处理的平板上并培养48小时。通过膜联蛋白V染色评估凋亡细胞死亡。（C） 转移癌细胞中RSK2介导抗噪声信号传导的拟议模型。RSK2是转移细胞中的信号整合子，以急性和慢性方式磷酸化和调节多种蛋白因子，以提供抗噪声信号。

讨论

我们发现RSK2通常提供抗噪声信号以保护多种转移性癌细胞，这为理解RSK2的促侵袭和促转移作用提供了新的见解。RSK2起信号整合器的作用，它调节信号效应物网络，以转录无关和依赖的方式介导抗黑信号。我们确定促凋亡因子ASK1是RSK2的一个新的磷酸化靶点。虽然S83被鉴定为AKT和PIM1磷酸化位点，但RSK2似乎是212LN细胞中在S83磷酸化ASK1的主要上游激酶之一。除了抑制性S83位点的磷酸化外，RSK2还通过磷酸化两个新识别的位点T1109和T1326来抑制ASK1。这一点得到了以下观察结果的支持：磷酸拟态T1109D/T1326D突变体作为ASK1的显性阴性形式发挥作用，当其过度表达时，会导致RSK2稳定敲除的细胞对失巢诱导的敏感性降低。

我们的研究还首次揭示了Ser/Thr磷酸化依赖性抑制ASK1的新分子机制，其中T1109和T1326的磷酸化都会专门减弱ASK1与ATP结合的能力，而S83的磷酸化会阻止底物MKK6与ASK1结合。对这些磷酸化事件影响的一种解释是，它们可能与ASK1的特定调节状态兼容，可能影响ATP结合；或者，磷酸化可以影响蛋白质相互作用位点，并可能以此方式调节ASK1。总之，这些结果表明RSK2通过多个位点的磷酸化抑制ASK1，至少部分地介导抗噪声信号。这可能为癌细胞迅速响应失巢凋亡诱导提供了一个调节窗口，至少部分是通过RSK2依赖性磷酸化和抑制促凋亡ASK1，从而为癌细胞提供抗失巢保护。根据这一概念，我们观察到ASK1的敲除导致了RSK2稳定敲除后细胞对失巢诱导敏感性增加的部分缓解。这一发现表明，除ASK1外，还有其他RSK2靶点参与RSK2依赖性抗噪声信号传导。这些靶点应包括其他类似于ASK1的蛋白因子，其磷酸化水平由RSK2调节，以转录依赖的方式提供抗噪保护。

此外，RSK2通过改变参与细胞存活和凋亡调节的蛋白效应器的基因表达来调节抗噪信号。特别是，我们基于DNA微阵列的研究确定了一系列RSK2→CREB转录靶点，这些靶点负责RSK2依赖性抗噪声保护。这些靶点包括抗凋亡因子PTK6和促凋亡因子ING3，它们是新近确定的RSK2和CREB的转录靶点。敲除RSK2或CREB可降低PTK6基因表达水平，这与转移癌细胞对失巢诱导的细胞敏感性增加有关。PTK6的过度表达部分地挽救了肿瘤细胞中对失巢凋亡诱导敏感性的增加，同时RSK2被击倒。我们的发现与最近的观察结果相一致，其中PTK6被认为可以促进IGF-1R转化的乳腺癌细胞中的凤尾鱼非依赖性增殖(31). 这保证了未来的研究，以检查RSK2信号是否参与IGF-1R依赖性激活PTK6，从而在癌细胞中提供抗噪声信号。除PTK6外，我们还确定促凋亡因子ING3是另一个新的RSK2→CREB转录靶点。我们的功能获得和功能丧失研究表明，RSK2也在一定程度上通过CREB发出信号，下调ING3，以保护癌细胞免受失巢。

我们的研究表明，同时改变RSK2磷酸化靶点ASK1和RSK2-CREB转录靶点PTK6或ING3，可以增强对RSK2敲除细胞中失巢凋亡敏感性增加的修复作用。我们的研究表明，癌细胞中存在复杂的RSK2抗噪声信号网络，有助于细胞对失巢凋亡的反应。这样的网络由RSK2的磷酸化和转录靶点组成，其可以分别在转移癌细胞中提供RSK2依赖性抗黑信号的急性和慢性介导。因此，本研究显示了细胞过程的复杂性，表明对失巢凋亡诱导和调节的反应可能涉及不同信号通路中的不同蛋白因子，例如相互作用、串扰、，各种RSK2下游效应器的协调可能发挥调节功能，以控制细胞对分离诱导的失巢凋亡的敏感性。这种机制可以用于抗癌治疗。

致谢

这项工作得到了美国癌症协会拨款的部分支持RSG-11-081-01号文件（S.K.），NIH/NCI头颈癌SPORE（赠款第50CA128613页)职业发展计划奖（S.K.），罗宾斯学者奖（S.K）。T.J.B.由美国国立卫生研究院资助。J.T.承认NIH的支持（拨款GM071434号).

S.K.是美国癌症学会基础研究学者和罗宾斯学者。Z.G.C、S.K.、F.R.K.、H.F.和D.M.S.是乔治亚癌症联盟的学者。

脚注

提前出版2013年4月22日

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文章来自分子和细胞生物学由以下人员提供泰勒和弗朗西斯