临床癌症研究。作者手稿；PMC 2014年2月1日提供。
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NIHMSID公司：尼姆斯426622
SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运
,1 ,1 ,2 ,1 ,1 ,三 ,4 ,4 ,5和1,6,7
穆罕默德·哈萨内因
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系过敏、肺和危重病护理医学部
梅根·D·霍克塞马
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系过敏、肺和危重病护理医学部
佐田正男（Masakazu Shiota）
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院分子生理学和生物物理系
钱军
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系过敏、肺和危重病护理医学部
布拉德福德·K·哈里斯
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系过敏、肺和危重病护理医学部
陈海蒂（Heidi Chen）
三田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院生物统计学系
乔纳森·克拉克
4田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院Jim Ayers癌前病变、检测和诊断研究所
威廉·E·阿尔伯恩
4田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院吉姆·艾尔斯癌症预防、检测和诊断研究所
罗莎娜·艾森伯格
5田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院病理学系
皮埃尔·马西恩
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系过敏、肺和危重病护理医学部
6田纳西州纳什维尔市纳什维尔校区范德比尔特-英格拉姆癌症中心癌症生物学系
7田纳西州纳什维尔市纳什维尔校区田纳西河谷医疗系统退伍军人事务部
1田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院医学系过敏、肺和危重病护理医学部
2田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院分子生理学和生物物理系
三田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院生物统计学系
4田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院吉姆·艾尔斯癌症预防、检测和诊断研究所
5田纳西州纳什维尔范德比尔特大学医学院病理学系
6田纳西州纳什维尔市纳什维尔校区范德比尔特-英格拉姆癌症中心癌症生物学系
7田纳西州纳什维尔市纳什维尔校区田纳西河谷医疗系统退伍军人事务部
*通信对象：医学博士Pierre P.Massion。ude.tlibrednav@noissam.erreip作者地址：Pierre P.Massion，MD Vanderbilt Ingram Cancer Center，PRB 640，2220 Pierce Avenue，Nashville TN 37232 - 补充材料
1
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2
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三。
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4
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5.
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6
指南：176EAE3D-6298-4A16-8132-7040A89DABAE
摘要
目的
我们之前在I期非小细胞肺癌（NSCLC）的鸟枪蛋白质组分析中，与匹配的对照组相比，已确定溶质结合载体家族A1成员5（SLC1A5）是一种过度表达的蛋白质。我们假设SLC1A5的过度表达是为了满足肺癌细胞生长和生存的代谢需求。
实验设计
为了验证我们的假设，我们首先通过免疫组织化学（IHC）和免疫印迹（N=98）以及细胞系（N=36）分析了存档肺癌组织中SLC1A5的蛋白表达。为了检测SLC1A5参与a.a转运，我们对存在和不存在SLC1A5-γ-L-谷氨酰胺基-p-硝基苯胺（GPNA）药物抑制剂的肺癌细胞株中谷氨酰胺的摄取进行了动力学分析。最后，我们研究了谷氨酰胺剥夺和摄取抑制对5种肺癌细胞株的细胞生长、细胞周期进程和生长信号通路的影响。
结果
我们的结果表明：1）SLC1A5蛋白在95%的鳞状细胞癌（SCC）、74%的腺癌（ADC）和50%的神经内分泌肿瘤中表达，2）SLC1A5位于细胞质膜上，与SCC组织学和男性显著相关，3）68%的Gln通过Na转运+-依赖性方式，其中50%归因于SLC1A5活性，4）SLC1A5的药理学和遗传靶向降低了肺癌细胞的细胞生长和生存能力，这种作用部分由mTOR信号介导。
结论
这些结果表明，SLC1A5在控制肺癌细胞代谢、生长和生存的谷氨酰胺转运中起着关键作用。
关键词：生物标记物、谷氨酰胺、转运蛋白、肺癌
A.简介
肺癌是美国癌症相关死亡的主要原因(1). 非小细胞肺癌约占所有肺癌的80%。尽管过去十年来在诊断和治疗策略方面取得了进展，但非小细胞肺癌患者的预后仍然很差，5年总生存率为15-20%(2). 已经发现，一小部分肿瘤是由突变癌基因驱动的，对这些突变癌基因有活性但仍然无法治愈的治疗方法。然而，绝大多数肿瘤都有复杂的发病机制，目前尚不清楚(三). 因此，迫切需要新的分子诊断和治疗靶点来提高肺癌患者的护理质量和生存率。尽管基因组分析为癌症发生机制提供了重要的新见解，但治疗靶点和大多数具有临床实用价值的生物标记物都是蛋白质产品。近年来蛋白质组学技术的进展使我们能够深入分析与肺癌相关的蛋白质表达变化和翻译后修饰(4,5). 这些研究产生了大量的蛋白质，这些蛋白质可能被转化为肺癌的分子靶点或生物标记物，但这些候选蛋白很少被证实或与疾病过程的功能相关性相关。
鉴于迫切需要一种可靠的非侵入性肺癌诊断测试，我们之前已经比较了新鲜冷冻I期非小细胞肺癌与匹配的对照肺标本的鸟枪蛋白组学特征，并确定了几个在NSCLC中显著过度表达的候选基因(6). Solute连锁运营商家族1成员A5（SLC1A5）成为首选。SLC1A5在培养的快速生长的上皮细胞和肿瘤细胞中充当L-谷氨酰胺（Gln）的高亲和力转运体(7). 中性氨基酸，包括谷氨酰胺，可以通过四个主要的氨基酸转运系统家族进行转运，包括钠依赖系统A、ASC、N和钠依赖系统L(8–11). 这些转运蛋白根据组织分布和不同氨基酸的亲和力进行分类。系统ASC是人类肿瘤衍生细胞中最常见的氨基酸转运体，这表明它可能在细胞转化和调节Gln依赖性生长中起主要作用(10,12,13). 因为SLC1A5属于Na+-依赖性氨基酸转运体ASC家族，我们检测了谷氨酰胺是否在肺癌细胞中被转运+-依赖的方式。在肺癌中，生长、存活和细胞周期进展对谷氨酰胺的依赖性已被充分证明(14–16). 最近，研究表明，谷氨酰胺酶将谷氨酰胺转化为三羧酸循环中间产物α-酮戊二酸对Kras诱导A549细胞的锚定非依赖性生长至关重要(17). 其他研究表明，谷氨酰胺的还原羧基化是代谢重编程的关键，而代谢重编程可以使癌细胞在缺氧条件下存活并在包括肺癌在内的几种癌细胞模型中增殖(18–20). 总之，这些研究为谷氨酰胺代谢在支持肺癌细胞生长和生存中的主要作用提供了有力证据。然而，在肺癌细胞中捕获Gln的转运体的身份以及Gln转运如何与细胞生长和存活联系尚不清楚。因此，本研究的三个主要目标是首先评估SLC1A5蛋白在不同肺癌病理亚型中的表达模式，其次评估其与肺癌临床结局的相关性，最后，研究SLC1A5对谷氨酰胺摄取的功能贡献及其在支持肺癌细胞生长和生存中的作用。
B.材料和方法
患者选择和组织微阵列
用石蜡包埋福尔马林固定（FFPE）块制备了98例肺癌肿瘤组织的组织芯片（TMA）。TMA由46种腺癌、37种鳞状细胞癌、4种支气管肺泡癌、4种大细胞癌、2种非小细胞肺癌（NSCLC）、5种类癌和腺鳞状、肉瘤和小细胞肺癌（SCLC）各1种组成。这些阵列是根据前面描述的协议构造的(21). 1989年至2002年间连续解剖切除的存档组织块取自范德比尔特大学医学中心和纳什维尔退伍军人管理局医学中心病理科的档案。这两个TMA中98名患者的人口统计学和临床特征总结如下，有关IHC分析的详细信息，请参阅补充资料.
表1
根据癌症状态和SLC1A5表达的TMA队列患者特征
| 患者人口统计 | 总计
N=98个
否（%） | SLC1A5型
(−)
否（%） | SLC1A5型
(+)
否（%） |
|---|
| 平均年龄（SD） | 56.4±11.5 | | |
| 比赛 | | | |
| 非裔美国人 | 7(7) | 0 | 7(100) |
| 高加索人 | 91(93) | 17 (17) | 81 (83) |
| 性别 | | | |
| 男人 | 56(57) | 6 (11) | 50 (98) |
| 女人 | 42(43) | 13(31) | 29 (69) |
| 吸烟状况 | | | |
| 例如从不吸烟 | 71(72) | 13(18) | 56(82) |
| 电流吸尘器 | 27(28) | 3 (11) | 24(88) |
| 包装年平均值（SD） | 55.78 ±33 | | |
| 组织学 | | | |
| 模数转换器 | 46(47) | 12(26) | 34 (74%) |
| 合同专用条款 | 37(38) | 2 (5) | 35 (95%) |
| 其他非小细胞肺癌 | 9 (9) | 0 | 9 (100%) |
| 神经内分泌肿瘤 | 6 (6) | 3 (50) | 3 (50%) |
细胞培养
人类肺癌细胞系A549（ADC）、H1819（ADC®由美国纽约州格兰德岛生命科技公司生产），含10%热灭活胎牛血清（FBS）（Gibco®由美国纽约州格兰德岛生命科技公司提供），温度为37°C，湿度为100%，CO为5%2细胞每2-3天传代一次，以保持指数增长。
谷氨酰胺摄取测定
通过最初由Gazzola等人(22). 简单地说，细胞在10岁时被电镀5细胞/孔置于24孔培养板中（Costar，Cambridge，MA，USA），并允许过夜粘附。在转运分析之前，用温钠冲洗细胞两次+-游离Krebs-Ringer磷酸盐缓冲液（cholKFtP），其中氯化胆碱和磷酸胆碱等渗取代相应的Na'盐，以去除细胞外Na'和氨基酸。使用的放射性示踪剂是L-[3,4Gln-三H] 比活性为500000 dpm/µmol（5µCi/ml）的谷氨酰胺（伊利诺伊州阿灵顿高地阿默沙姆）。对于动力学研究，转运缓冲液中未标记的谷氨酰胺的量从400µM到6.4 mM不等。使用cholKRP在缺乏细胞外Na+（扩散和钠依赖性摄取）的情况下或在存在Na+（总摄取）的条件下，使用NaKRP缓冲液测定钠依赖性速率，获得转运值，以微微摩尔/毫克蛋白质/min为单位报告。所有运输测量均在37°C下进行，并在3分钟（min）后终止，方法是添加冰镇磷酸盐缓冲盐水（PBS），然后用冰镇PBS快速清洗三次。细胞内谷氨酰胺用0.2ml/孔0.2%十二烷基硫酸钠在0.2N NaOH中萃取；室温下1小时后，用2N HCl中和0.1 mL裂解液，并进行液体闪烁分光光度测定。剩余的裂解液用于Pierce测定细胞蛋白®BCA蛋白质测定。谷氨酰胺转运速率根据每个样品每分钟计数（cpm）和摄取混合物的比活性（cpm/nmol）计算。然后使用Microsoft Excel将这些结果归一化为细胞蛋白质含量。对于GPNA的药理靶向性，在NaKRP缓冲液中存在0、100和300µM GPNA的情况下进行Gln摄取分析。根据放射性计数和蛋白质浓度计算转运速度，然后表示为每分钟每毫克蛋白质转运的谷氨酰胺pmol。每个数据点代表至少三次单独测定的平均±SEM。
谷氨酰胺依赖性增殖试验
为了测试细胞对谷氨酰胺的生长依赖性，将细胞以2×10的密度放置在12孔组织培养板中4细胞/孔。第二天，用无血清L-谷氨酰胺培养基冲洗细胞一次，并用RPMI-1640（Gibco®由美国纽约州格兰德岛生命科技公司（Life Technologies，Grand Island，NY，USA）提供，其变化如下：补充EGF（25 ng/ml）和1×生长因子鸡尾酒（Invitrogen，Carlsbad，USA，不含L-谷氨酰胺，但含补充剂（−Gln+Sup）或既不含L-谷酰胺也不含补充品（−Gln-Sup）。使培养物生长3天，每48小时（h）更换一次培养基。为了测试SLC1A5活性是否介导Gln耗竭效应，将A549和H520培养在含有（+Gln+Sup）+1 mM GPNA的培养基中，并静置培养2天。为了进一步验证GPNA阻断SLC1A5的抗生长作用，将A549和H1819细胞培养在最佳生长介质（+Gln+Sup）中，并增加GPNA（0，1，10 1001000µM）的剂量，培养2天。通过测量OD监测细胞生长490在培养第0天和培养48小时后，采用Cell-Titer 96-水比色法（威斯康星州麦迪逊市普罗米加）。相对生长率表示为从第0天开始的生长百分比，并使用以下方程式进行计算；（Ti-Tz）/（C-Tz）×100，其中Ti是48小时后的细胞数（i=抑制），Tz是时间0时的细胞数，C是在最佳生长条件（+Gln+Sup）下培养的对照细胞的细胞数(23).
短干扰RNA（siRNA）的转染
靶向人类SLC1A5的4个21核苷酸短干扰RNA（siRNAs）的混合物在马萨诸塞州沃尔瑟姆的Thermo Scientific合成，并作为单一试剂提供。siRNA库中靶向人类SLC1A5的4个siRNA序列为：；1） UGAUAGAGUGAGAGUGA，2）GCAAGGAGUGCUCGAUUC，3）GGUCGAUAUCCUUG，4）GCCUUCUCAUACUA。从同一家公司购买了一种非靶向对照siRNA，该siRNA是一种杂乱核苷酸序列，用作非特异性结合的阴性对照（siRNACont）。AllStars Hs Cell Death Control siRNA被用作阳性对照，以验证转染效率和作为细胞活力的阳性对照（马萨诸塞州剑桥市齐根市）。使用DhrmaFECT1试剂（0.2µL/孔）在1.0和2.5 nM siRNAs下转染A549和H520细胞72小时，然后按照补充材料.
统计分析
使用Kruskal–Wallis或Wilcoxon秩和检验分析SLC1A5表达与临床变量之间的相关性。动力学数据适用于Michaelis–Menten动力学，数据点等于n个实验的平均值±SEM减去非特异性结合。使用GraphPad Prism（GraphPad-Software，San Diego，CA，USA）对谷氨酰胺摄取动力学和细胞生长分析进行统计分析。采用双尾学生t检验对两种实验条件下的数据进行统计分析，只有P<0.05的结果才被认为具有统计学意义。所有实验数据均表示为n个独立测量的平均值（SEM）的平均值±标准误差（如各图图例所示）。每个实验中的所有处理均在三个孔中进行，并在3个独立日重复。为了评估GPNA剂量反应治疗的程度，采用普通回归分析评估对数和对数之间的线性趋势（生长抑制百分比）。
C.结果
SLC1A5在细胞质膜过度表达，与鳞状肺癌组织学和男性相关
我们的鸟枪蛋白质组分析表明，与来自新鲜冷冻组织和福尔马林固定石蜡包埋FFPE组织的对照肺样品（N=20）相比，SLC1A5蛋白在肺的I期ADC（N=200）和SCC（Nx20）组织提取物中过度表达（每种组织类型N=5）(补充图1。A、 B类). 我们在从3个正常肺组织和3个非小细胞肺癌肿瘤中收集的一组单独的组织裂解物中证实了这些结果(补充图1C). 为了评估SLC1A5蛋白在肺肿瘤中的表达模式，我们使用两个组织微阵列（TMA）对从诊断为不同组织学亚型肺癌的患者中收集的存档原发性肺癌组织进行了免疫组织化学（IHC）分析，使用经验证的人抗SLC1A5 IgG(网址：http://www.proteinalas.org/). 35/38（95%）的鳞状细胞癌和34/46（74%）的ADC亚型中可见SLC1A5信号。其他非小细胞肺癌，包括大细胞癌（LCC）、腺鳞癌和非小细胞癌，未另行说明，均为阳性（9/9）（100%）。神经内分泌肿瘤，包括非典型和典型类癌和小细胞肺癌（SCLC），也出现在我们的TMA中，但只有50%（3/6）的SLC1A5染色阳性(). 腺癌和鳞状细胞癌中SLC1A5的染色模式均沿细胞质膜，细胞质染色较少。在正常细胞成分中，我们发现纤毛呼吸上皮细胞的零至1+细胞质膜染色，基底支气管/支气管细胞的2+至3+细胞质膜着色，支气管粘膜下腺细胞的2+细胞质膜染，反应性2型肺细胞的1+2+细胞质膜染色（1型肺细胞无染色），肺泡巨噬细胞的2+细胞质染色，浆细胞的1~2+细胞质和细胞质膜着色。基质成纤维细胞、平滑肌、软骨、内皮细胞或淋巴细胞未染色(). SCC中SLC1A5表达的发生率明显高于ADC(第页<0.001), (). SLC1A5和临床变量之间最显著的相关性与性别有关，男性高于女性(第页<0.001), ()组织学类型SCC高于ADC(第页<0.001), (和). SLC1A5表达与总生存率、吸烟史或年龄无显著相关性。
SLC1A5在NSCLC肿瘤中差异表达，位于细胞质膜水平（A） SLC1A5蛋白在组织微阵列（TMA）中的IHC染色的代表性图像，该组织微阵列由从代表主要肺癌组织学亚型的98名肺癌患者收集的存档肺组织切片构建。左面板由3张代表性的显微照片组成，放大100倍，取自SLC1A5染色阴性的肺癌患者的正常肺组织切片。右侧面板由IIA期ADC和IIB期SCC患者肺癌切片的代表性放大100倍显微照片组成。将右上角相同部分的小区域放大200倍，可以看到癌细胞的膜染色模式。这里也显示了一段没有SLC1A5染色的ADC。（B） SLCA15蛋白IHC指数（强度×肿瘤细胞百分比）的方框图显示染色指数显著升高(p<0.001)男性肿瘤发病率（N=56）高于女性（N=42）。（C） SLCA15蛋白IHC指数的方框图显示，与ADC相比，SCC中的IHC染色指数显著增加(p<0.001). 我们的IHC分析的详细摘要见.
来自肺癌细胞系的IHC结果显示，除一个腺癌细胞系（H2009）外，其余所有细胞系(补充表1和一个SLC1A5染色阳性的SCLC细胞系（H345）(补充表1和补充图2A). 与肺原发性肿瘤相似，我们发现SLC1A5的亚细胞位置主要是膜性的(补充图2A)在所有肺癌细胞系中。兔抗SLC1A5多克隆抗体的Western blot分析(24,25)证实该蛋白在恶性肺癌细胞系A549（ADC）、HCC15（SCC）、H520（SC）和H460（LCC）中的表达较高(补充图2B、C). 使用3种不同的抗体验证了该抗体的特异性以及SLC1A5在A549和H1819细胞系中表达的确认(补充图3A). 一个ADC细胞系（H1819）对SLC1A5呈阴性。类癌细胞系H727的蛋白质水平较低。肺癌细胞系的Western blot结果与鸟枪蛋白组学中SLC1A5的表达模式一致(补充图1A–C)和来自肿瘤TMA的IHC().这些结果表明，SLC1A5在大多数肺癌中具有较强的细胞膜免疫染色，在鳞癌和男性中更为明显。
肺癌细胞摄取谷氨酰胺部分由SLC1A5介导
我们测试了Na+使用L-[G对A549细胞摄取L-谷氨酰胺的依赖性-三H] 在Krebs-Ringer溶液中()(26). 我们的结果如所示和补充表2表明68%的细胞Gln摄取发生在钠+-依赖方式。为了测试SLC1A5在肺癌细胞摄取Gln中的作用，我们在没有或存在谷氨酰胺类似物、γ-L-谷氨酰胺基对硝基苯胺盐酸盐（GPNA）的情况下对A549细胞进行了Gln摄取测定，谷氨酰胺类似品是一种竞争性的Gln摄取抑制剂，与SLC1A51特异结合(27,28). A549细胞的Gln摄取动力学表明，Gln摄取受15%的剂量依赖性抑制(第页<0.05）和32%(第页<0.005），分别在100和300µM GPNA下培养3分钟(). 在相同条件下，当GPNA浓度增加到900µM时，未观察到对谷氨酰胺摄取的进一步抑制（数据未显示）。这些结果表明，A549细胞摄取的大部分Gln发生在Na+-依赖性方式，约50%由SLC1A5介导。为了测试药物阻断SLC1A5介导的Gln摄取对肺癌细胞生长的影响，我们在GPNA浓度增加的情况下培养A549细胞48小时。观察到生长抑制的剂量反应()与不含L-谷氨酰胺和补充相同时间的细胞生长相比。这些结果首次证明肺癌细胞中靶向SLC1A5活性可以直接影响细胞生长。
Gln摄取为Na+-依赖并部分由SLC1A5介导为了检查Gln的细胞内转运，将人ADC A549细胞以指定的细胞密度接种到24孔培养板（0.5 mL/孔）中。（A） Na人+-在37℃下监测1.6mM L-谷氨酰胺的依赖性摄取3分钟。每个点代表四次测定的平均±SEM。该图还说明了cholKRP（-Na）中谷氨酰胺速率的Michaelis–Menten动力学+)或NaKRP（+Na+)（A，右上），（+Na+)>（−钠+). （**p<0.005[n=3]）。（B） 五最大值在存在0、100和300µM GPNA的情况下，A549细胞的Gln摄取动力学值以及右上角的面板显示了谷氨酰胺速率的米氏动力学。（C） 在含有增加剂量GPNA的全生长培养基（+Gln+supp）中培养后，对A549生长%的剂量反应抑制。（D） 通过测量H2DCFDA（防爆488纳米/埃米斯525纳米)在增加GPNA剂量培养24小时后使用微量滴定板阅读器。这些数据代表了至少三个独立观察结果，结果为平均值±SEM。
SLC1A5表达调节非小细胞肺癌细胞对谷氨酰胺的生长依赖性
SLC1A5表达在调节谷氨酰胺代谢依赖性肺癌细胞生长中的作用尚未得到研究。因此，我们培养了五种不同SLC1A5蛋白表达水平的肺癌细胞株(和补充图3)，并将其培养在Gln和生长因子浓度不同的培养基中72小时，如方法部分所述。在缺乏谷氨酰胺的条件下，SLC1A5高表达细胞系（A549、HCC15和H520(). 有趣的是，与A549、H520和HCC15相比，即使在最佳生长条件下（+Gln+Sup），H1819（SLC1A5 null）的生长速度也要慢得多，所有这些都过度表达SLC1A5。增加谷氨酰胺拮抗剂6-重氮氧基-L-去甲亮氨酸（DON）剂量对A549细胞（过度表达SLC1A5）的药物治疗(29)连续4天，这些细胞的生长受到显著抑制，而H1819（SLC1A5 null）未受影响(). 这些结果表明，SLC1A5的表达至少部分调节了肺癌细胞对谷氨酰胺的生长依赖性。为了研究SLC1A5在肺癌细胞对谷氨酰胺依赖性中的特殊作用，我们用1 mM GPNA处理A549和H520细胞（过度表达SLC1A5）48小时。我们的结果如所示在A549和H520细胞系中，细胞生长显著下降，而生存能力受到的影响较小。
谷氨酰胺是肺癌细胞生长所必需的在体外为了测试SLC1A5的表达是否与体外肺癌细胞的Gln依赖性生长相关，在添加EGF、胰岛素、硒和转铁蛋白以及2mM L-谷氨酰胺（+Gln+Sup）的培养基中培养了5株表达水平不同的肺癌细胞系，或L-谷氨酰胺，但不含补充剂（+Gln-Sup），或不含L-谷氨酰胺但含补充品（−Gln+Supp），或既不含谷氨酰胺，也不含非补充剂。（B）细胞生长的倍数变化在第3天通过cell-Titer 96-水比色分析法分析为490时OD的变化纳米第0天的信号。生长抑制对Gln剥夺的敏感性在过度表达SLC1A5、A549、H520和HCC15的细胞系中显著，但在蛋白H1819和H727水平低或检测不到的细胞系则不显著。（C） 采用台盼蓝排斥染色法，在补充或去除Gln的培养基中培养48 h后，测定了Gln去除对SLC1A5表达细胞系A549和H520细胞活力的影响。（D） 使用以下方程式（Ti−Tz）/（C−Tz）×100，通过计算在补充或剥夺Gln或完全补充的培养基+1mM GPNA的培养基下培养48小时后细胞生长的净增加或减少来衡量Gln剥夺的抗生长效果。其中，Ti是生长刺激物或抑制剂处理48小时后的细胞数（i=抑制），Tz是时间零点的细胞数，C是在最佳生长条件（+Gln+Sup）下培养的对照细胞的细胞数。（E） 随着DON浓度的增加，A549和H1819治疗48小时后，细胞生长的剂量反应下降。通过学生t检验评估统计显著性，表示为*=p≤0.05，**=p≤0。005来自3个独立分析。
肺癌细胞中SLC1A5相关Gln摄取的阻断增加了细胞内ROS的释放
我们从I期肺癌新鲜冷冻组织中获得的鸟枪蛋白组学数据显示，丙氨酸氨基肽酶（ANPEP）和谷胱甘肽合成酶（GSS）的表达增加，这是谷胱甘苷合成途径中的两种关键酶（数据未显示）。因为谷氨酰胺是谷胱甘肽生物合成的前体(30)因为谷胱甘肽是细胞内活性氧过剩（ROS）的清除剂(31,32)，我们测试了抑制SLC1A5介导的A549细胞Gln摄取是否会增加细胞内ROS水平。当用增加剂量的GPNA处理24小时后，A549细胞的细胞内ROS水平升高，这是通过H氧化形式的相对荧光信号来测量的2DCFDA公司(). 为了测试SLC1A5-Gln活性是否介导抗生长作用和细胞内ROS释放的增加，我们测量了与H1819相比表达高水平SLC1A5的A549细胞的Gln摄取、细胞生长和细胞内ROS释放(补充图2B). H1819的Gln摄取量显著降低（40%）(第页<0.005），并且当用300µM的SLC1A5抑制剂GPNA处理时，与A549细胞的相同摄取水平相当(第页<0.05). 与A549细胞相比，GPNA对H1819细胞的Gln摄取没有影响，而A549细胞在300µM时被抑制了33%。随着GPNA剂量的增加，对SLC1A5的药物阻断48小时，导致A549细胞内ROS释放量呈剂量依赖性增加，而H1819细胞内则无此现象(补充图3C). 类似地，当细胞在含有增加浓度的SLC1A5抑制剂GPNA的培养基中培养时，在A549（过度表达SLC1A5）中观察到细胞生长的剂量依赖性下降，而在H1819（SLC1A5null）中观察不到细胞生长(补充图3D). 总之，这些结果表明，肺癌细胞中的SLC1A5转运活性在一定程度上介导了Gln的摄取，阻断这种活性会降低细胞生长并增加细胞内ROS的释放。
靶向SLC1A5通过抑制mTOR信号传导导致G1期阻滞
为了评估谷氨酰胺耗竭和SLC1A5对谷氨酰胺依赖性摄取对细胞周期进程的影响，A549细胞被添加生长介质（+Gln+Sup）、生长补充耗竭介质（+Gln-Sup）和谷氨酰胺耗损介质（−Gln+Sub）、，缺乏谷氨酰胺和生长补充剂（−Gln-Sup）或（+Gln+Sup）培养基+5 mM GPNA的培养基。仅谷氨酰胺耗竭（−Gln+Sup）导致生长完全抑制，G1期阻滞细胞百分比增加，S期和G2/M期细胞百分比降低，但细胞活力不受影响(). 在用GPNA处理的细胞中也观察到类似的效果。为了测试Gln缺失的抗增殖作用是否可归因于SLC1A5活性，我们通过使用一种特定的短干扰RNA寡核苷酸（siRNA）从基因上靶向SLC1A5。在与两种不同浓度的抗SLC1A5 siRNA孵育72小时后，通过Western blotting证实SLC1A5-蛋白被显著敲除(). 与谷氨酰胺耗竭和GPNA处理类似，当小干扰RNA下调SLC1A5时，观察到生存能力和生长显著降低(). siRNA下调SLC1A5也导致细胞周期阻滞在G1。
谷氨酰胺耗竭和SLC1A5抑制对细胞周期进程的影响（A） A549细胞在如下所述的各种生长条件下培养48小时后的典型亮场（20倍放大）图像。（B） 细胞周期阶段分布的DNA直方图4在添加了EGF、胰岛素、硒和转铁蛋白以及2mM L-谷氨酰胺（+Gln+Sup）、或L-谷氨酰胺但没有补充物（+Gln-Sup其中含有5mM GPNA。
SLC1A5的基因靶向性影响细胞生长和活性（A） Western blot分析验证了转染25 nM干扰siRNA或指示浓度的抗SLC1A5抗体的A549和H520细胞中SLC1A5-蛋白的下调。转染siRNA 72小时后，使用台盼蓝染料排除法通过直接细胞计数分析与第0天（C）相比的细胞活力（B）和细胞生长。（D） 在转染指定siRNA浓度72小时后，对A549细胞进行细胞周期分析。显示为平均值±SD的数据代表三个独立的实验。
虽然文献表明SLC1A5的细胞表面表达增加可以解释为肿瘤对谷氨酰胺代谢的依赖性，以支持其对能量和大分子生物合成的高需求(33–35)最近的研究表明，SLC1A5介导谷氨酰胺转运独立于谷氨酰胺代谢，对于激活某些癌症类型中的关键生存和细胞生长信号级联，包括mTOR和ERK通路是必要的(24,28,36). 为了测试肺癌细胞摄取谷氨酰胺是否会诱导mTOR信号传导，我们首先将L-谷氨酰胺和生长因子饥饿H520细胞24小时。第二天，细胞在培养基中添加谷氨酰胺（+Gln-Sup）或无谷氨酰胺（−Gln+Sup），但添加生长因子（EGF和胰岛素）或全生长培养基+5mM GPNA，持续1小时。然后采集细胞，进行裂解，并通过Western blotting分析mTOR通路的激活状态。如所示与总mTOR蛋白相比，通过Gln缺失或GPNA处理，磷酸化mTOR（p-mTOR）水平降低。与总蛋白水平相比，p-mTOR水平的降低导致其下游靶点p85 S6K和p70 S6K的活化降低。与mTOR激活相比，我们没有检测到磷酸化pAKT和p-ERK水平所指示的Akt或ERK信号级联的显著变化(). 与H520相反，在H1819细胞中，通过mTOR的信号传导不受Gln剥夺和GPNA处理的影响（SLC1A5无效），而生长补充剂的剥夺削弱了该细胞系中mTOR和ERK的激活(). 这些结果与以前的研究一致，这些研究证明了细胞外谷氨酰胺激活生长信号级联的能力，如mTOR信号，并表明Gln作为生长信号刺激物发挥作用(24,28). 这种机制是否在所有表达SLC1A5的肺癌细胞中普遍存在尚不清楚。
SLC1A5介导的Gln摄取激活mTOR信号通过western blot分析H520（SCC）和H1819（ADC）细胞系对谷氨酰胺剥夺或SLC1A5阻断的p-mTOR信号的磷酸化，评估mTOR、AKT和ERK信号的激活。细胞被剥夺生长因子，并用添加了EGF、胰岛素、硒和转铁蛋白的RPMI-1640培养基处理L-谷氨酰胺（饥饿）24小时，以及2mM的L-谷氨酸（+Gln+Sup）、L-谷氨酰胺但没有补充物（+Gln-Sup）或没有L-谷氨酰胺而有补充物（−Gln+Subp）或既不补充L-谷氨酰胺也不补充L-谷氨酰胺或完整生长培养基+5mM的GPNA（+Gln+Sup）60分钟。（A）Gln剥夺或GPNA处理对H1819细胞中的mTOR或ERK信号传导没有影响（SLC1A5无效）。（B） 在H520（SLC1A5过度表达）中，mTOR信号级联的激活被磷酸化的mTOR水平及其p70S6K和p85S6K的磷酸化所减弱。Gln剥夺或GPNA处理对H520细胞的AKT或ERK信号没有影响。
D.讨论
我们首次报道了SLC1A5作为候选诊断生物标志物的临床相关性以及其在肺癌中的生物学功能。我们的结果表明，SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运。具体来说，我们报告的是1。SLC1A5在细胞质膜上过度表达，与鳞状肺癌组织学和男性相关，2。肺癌细胞对谷氨酰胺的摄取部分由SLC1A5，3介导。SLC1A5表达调节非小细胞肺癌细胞对谷氨酰胺的生长依赖性，4。阻断肺癌细胞中SLC1A5相关Gln的摄取会增加细胞内ROS的释放，5。靶向SLC1A5通过抑制mTOR信号导致G1期阻滞。
SLC1A5的表达与鳞癌组织学显著相关，但并不局限于鳞癌组织(和补充图1)并且与男性较高的肿瘤表达水平显著相关(和). 这种性别相关性的生物学原因尚不完全清楚。一种可能的解释是，性激素可能通过调节SLC1A5和其他氨基酸转运蛋白来解释这些发现，值得进一步研究。氨基酸转运体在包括肝脏在内的不同实体瘤中的表达模式(10,12)，胸部(12)和结肠癌(37)正在出现在文献中。在肺癌中，最近对160个非小细胞肺癌患者进行的组织学研究发现，在79.6%（43/54）的非腺癌和15.1%（16/106）的腺癌中，Lat1（一种钠依赖性氨基酸转运蛋白）表达(38). 同一研究还表明，Lat1的表达与糖酵解、血管生成、PI3k/Akt、EGFR和mTOR通路的标记物显著相关。此外，同一组发现Lat1与非小细胞肺癌的化疗耐药性和不良预后相关(39). 由于缺乏功能数据，本报告为氨基酸转运蛋白在肺癌进展中的潜在重要性提供了初步证据。未来的功能研究应旨在确定Lat1对肺癌细胞谷氨酰胺摄取的相对贡献。
SLC1A5在正常细胞和癌细胞中有两种已知功能：作为胎盘发育过程中的逆转录病毒受体和乳腺癌中的癌细胞融合(25,40)，作为一种中性氨基酸转运蛋白，对谷氨酰胺具有高亲和力(11,41). 肺癌模型的早期研究在体外和体内证明谷氨酰胺对细胞的生长和活力都是必不可少的(14–16). 因此，我们致力于研究SLC1A5对肺癌细胞株谷氨酰胺转运的作用。我们假设SLC1A5在肺肿瘤和细胞系中的表达增强可能是一种适应机制，使肺癌细胞能够有效地从细胞外环境中捕获过量的Gln。我们的结果表明，A549细胞对Gln的大多数摄取发生在Na+-依赖性时尚，其中一半由SLC1A5介导。SLC1A5的药理学和基因靶向性通过迫使细胞停滞在G1期显著抑制细胞生长。因为SLC1A5可以运输包括谷氨酰胺在内的脂肪族中性氨基酸(10,41)我们预计，其阻断的生长抑制效应的一部分可归因于减少其他中性氨基酸的摄取。尽管如此，因为SLC1A5与循环中最丰富的氨基酸Gln有很高的亲和力，并且SLC1 A5占Na的50%+-依赖性Gln转运(和补充表2)，SLC1A5活性很可能与观察到的表型效应有关。这些数据还表明，其他Na+-依赖性转运体如SN1（SLC38A3）和/或SN2（SLC39A5）可能有助于癌细胞摄取Gln。未来的研究需要评估其他氨基酸转运蛋白在肺癌中的相对贡献。
我们的结果表明，siRNA下调肺癌细胞中SLC1A5的抗生长作用与之前使用反义方法下调肝癌细胞中SLC1 A5的研究一致(24). SLC1A5下调对肺癌细胞周期进展的直接影响提供了第一个强有力的证据，证明SLC1A5s是Gln可用性和细胞分裂之间的联系。此外，与L-谷氨酰胺在癌症进展中新出现的促生存作用相一致(18,19)我们发现谷胱甘肽合成酶（GSS）的蛋白质水平，GSS是一种催化γ-L-谷氨酰胺-L-半胱氨酸转化为谷胱甘苷的限速酶(42)，A549高于H1819。有趣的是，GSS的表达模式与SLC1A5在这两种细胞系中的表达模式相同。这与我们的鸟枪蛋白质组数据一致，该数据显示GSS与对照组相比在SCC和ADC I期NSCLC组织中过度表达（数据未显示）。为了验证SLC1A5转运的Gln有助于GSH合成的假设，我们用GPNA抑制了转运蛋白活性。随着GPNA剂量的增加，SLC1A5的阻断导致A549细胞内ROS的释放增加（SLC1A5-阳性），而H1819细胞内ROS的释放没有增加（SLC1 A5-阴性）(补充图3C). 这些结果表明，SLC1A5表达可能是更广泛的代谢重编程方案的一个组成部分，该方案被肺癌细胞适应，以对抗其微环境中的氧化应激。
最近的研究表明，SLC1A5活性独立于谷氨酰胺代谢，在某些癌症类型中对激活关键生存和细胞生长信号级联（包括mTOR和ERK通路）具有新的作用(24,28). Gln及其转运蛋白在癌细胞中的作用超出了氨基酸的传统代谢功能。与这些报告一致，我们的结果()表明通过SLC1A5摄取谷氨酰胺可以激活H520 SCC细胞中独立于生长因子的mTOR信号传导。总之，本研究的结果表明，谷氨酰胺的生长依赖性与SLC1A5的表达和活性有关，抑制其谷氨酰胺摄取活性对肺癌细胞具有细胞抑制作用在体外.
总之，我们的结果首次提供了SLC1A5活性与肺癌细胞中观察到的谷氨酰胺生长依赖性之间的功能联系。靶向SLC1A5活性的细胞抑制作用可以部分解释为mTOR信号的失活，以及肺癌细胞内大分子生物合成所需的细胞内谷氨酰胺库的耗竭。SLC1A5的差异表达、其细胞表面位置及其作为氨基酸转运蛋白的功能使其成为肺癌的靶点。
翻译相关性声明
我们首次报道SLC1A5作为肺癌诊断生物标志物的临床相关性及其生物学功能。我们的结果表明，SLC1A5介导肺癌细胞生长和生存所需的谷氨酰胺转运。这些发现确定SLC1A5是肺癌细胞中谷氨酰胺的主要转运蛋白，有助于解释肺癌细胞对谷氨酰胺的生长依赖性。SLC1A5的细胞表面表达增强、其作为氨基酸转运蛋白的活性及其在支持肺癌生长中的重要作用使其成为理想的治疗靶点。
致谢
我们要感谢Snjezana Zaja-Milaovic女士在处理组织和细胞系阵列方面的帮助，感谢Adriana Gonzalez博士在TMA肿瘤病理分类方面的帮助以及Brian Lehmman博士在siRNA实验方面的帮助。
基金
这项工作得到了范德比尔特活体细胞和分子成像中心（ICMIC）职业发展奖（MH）、NCI CA102353（PPM）和范德比特肺癌SPORE（P50CA090949）（PPM项目）的支持。
工具书类
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