TLR4和TGF-β对肿瘤起始干细胞的相互调节

TICs在体内引起肿瘤。

接下来，我们用慢病毒GFP表达载体感染TICs和对照细胞，并将其皮下移植到NOD/Shi中，以测试Tg模型和患者的TICs的致瘤特性-科学情报部/伊利2r^–/–（NOG）小鼠。通过GFP成像监测移植细胞衍生肿瘤的发生和生长，持续80天。所有3组的TIC均发展为生长性肿瘤，而相应的对照组或CD133^–/CD49f型^–细胞未能形成肿瘤（图​（图2A2A和补充图2A）。对于携带对照细胞的小鼠，我们将观察延长至6个月，但没有观察到任何肿瘤形成（数据未显示）。所有3组TICs产生的肿瘤的生长和重量均因感染表达慢病毒的细胞而显著减轻Tlr4号机组移植前的shRNA（图​（图2A2A和补充图2A）。肿瘤的组织学分析Ns5a号或核心Tg小鼠和人类患者TIC主要显示发育不良结节或HCC（补充图2C），偶尔伴有胆管瘤和纤维肉瘤共存。为了测试TIC对NANOG肿瘤发生的依赖性，用纳克移植前shRNA慢病毒载体。这种操作使肿瘤生长减少了60%至75%（图​（图2B2B和补充图2B）。如所见Tlr4号机组shRNA，纳克shRNA没有完全阻止肿瘤生长，很可能是由于shRNA对NANOG表达的不完全沉默，如伴随的免疫印迹所示。其中一个NANOG公司假基因，纳米级P8，有助于肿瘤发生(34). 为了测试NANOGP8与NANOG在TICs启动的肿瘤发生中的作用，用shRNA转导人类肝癌细胞，并用于异种移植生长竞争分析。我们的结果表明，通过沉默NANOG公司但不是纳米级P8（补充图3，A-D），表明后者在TICs引起的肿瘤发生中的作用有限。

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图2

TLR4/NANOG–TIC依赖的肿瘤起始特性。

(A类)GFP转导的TIC，但不是来自Ns5a号根据NOG小鼠皮下移植后的全身成像，Tg小鼠和患者HCC会导致肿瘤生长。这种增长减弱了Tlr4号机组移植前shRNA转导(*P（P）< 0.05). 最终肿瘤重量也随着Tlr4号机组shRNA。(B类)TICs引起的肿瘤生长Ns5a号Tg小鼠或患者肝癌通过转导纳克shRNA。最终肿瘤重量也减少了。移植后10天收集的细胞裂解物的免疫印迹证实NANOG在TIC中的表达，并用特异性shRNA击倒该蛋白*P（P）< 0.05.

为了进一步验证肿瘤起始特性，来自Ns5a号将小鼠连续移植到NOG小鼠中。这些细胞来自3种不同的肝脏样本，并在每组6只NOG小鼠皮下注射3种不同细胞数（500、2500和10000）(n个= 54). 在这些小鼠中，肿瘤仅来源于TIC，随后用于连续移植。事实上，TIC在连续移植实验中反复形成肿瘤（补充表2）。这些结果支持了TIC具有致瘤和自我更新特性的假设。为了解决移植后形成的肿瘤中TICs是如何维持的，从TICs产生的肿瘤中分离出细胞Ns5a号和核心Tg小鼠并分类以评估CD133⁺/CD49f型⁺人口。有趣的是，双阳性TICs占总细胞的1.1%至1.4%（补充图4A），这与从原始肿瘤中观察到的双阳性细胞的百分比相似，表明一旦实体肿瘤形成，TICs就存在于一个小群体中。

最近的一项研究表明CD24⁺肝癌患者的细胞具有启动肿瘤的特性，这种特性依赖于STAT3和NANOG(35). 为了解决这种可能性，我们用CD133检测了凤尾鱼非依赖性生长和肿瘤形成⁺/CD24型^–与CD133相比⁺/CD24型⁺我们发现NOG小鼠的集落形成和肿瘤起始特性没有差异（补充图4，B和C）。这些结果表明，CD24阳性并不反映TIC的肿瘤启动特性。

TLR4通过Nanog诱导Igf2bp3和Yap1。

在确定TICs的致瘤活性后，我们接下来寻求识别由假定TICs表达的致癌基因。这是通过从5个独立的肝癌细胞分离的mRNA逆转录产生慢病毒cDNA文库来实现的Ns5a号Tg小鼠，创建含有cDNA的靶向载体，并通过重组方法将其克隆到慢病毒中。永生化小鼠肝祖细胞第53页-用来自TIC或对照细胞的慢病毒文库感染缺陷细胞系（PIL-4），并在软琼脂中测试菌落形成（图​（图3A）。三A） ●●●●。感染TICs慢病毒文库后2至3周，PIL-4细胞转化并产生大量菌落，但文库从对照细胞中形成的菌落很少（图​（图3A）。三A） ●●●●。感染TIC衍生文库形成的菌落被单独分离，以筛选潜在致癌基因。从138个菌落中分离并测序45个cDNA，已鉴定出9个候选基因，包括免疫球蛋白2bp3（也称为IMP-3型),Yap1号机组,Tnfrsf12a号,修剪16,Tnfaip6型,E2f3型,状态3,百万分之二、和20毫米（表​（表1）。1). 已知这些基因中的大多数在胚胎干细胞转录起始位点上游8kb内富集了NANOG结合基序(36). 在这些基因中，Yap1号机组,E2f3型、和状态3据报道，当过度表达时会致癌(37–39). YAP1是器官大小控制Hippo通路的靶点(40). IGF2BP3的表达至少部分通过促进IGF-II的翻译促进肿瘤生长和侵袭(41)和稳定CD44细胞信使核糖核酸(42)，其表达预测肝癌早期复发和预后不良(43,44). 我们通过qRT-PCR确认Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3在TIC中诱导，并且LPS以至少部分NANOG依赖的方式进一步上调（图​（图3B）。三B） ●●●●。从控制细胞的cDNA文库生成的少数菌落中仅分离出2个基因（补充图4D）。

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图3

TLR4/NANOG依赖癌基因的鉴定，免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组，来自慢病毒cDNA文库的功能筛选。

(A类)体外鉴定肝癌基因的策略，卵圆细胞感染TIC文库，但未感染对照细胞文库形成菌落。(B类)表达增加免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组经qPCR证实的TICs中LPS处理进一步上调。纳克shRNA显著减少这些诱导。(C类)原理图免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组描述NANOG共识结合序列位置（橙色框）和ChIP分析的区域（1–16个黑框免疫球蛋白2bp3和1-9个黑匣子Yap1号机组). 来自Ns5a号Tg模型如下所示，NANOG在NANOG 1和2站点内的11和12区域富集免疫球蛋白2bp3启动子和包含NANOG 1位点的区域5Yap1号机组发起人。

表1

HCV NANOG阳性TICs中的肿瘤驱动基因候选Ns5a号喂食酒精12个月的Tg小鼠

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确定如何免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组诱导由NANOG介导，通过ChIP-qPCR检测其启动子内的NANOG结合共识序列，以在LPS刺激的TIC中招募NANOG。NANOG招募在包含3个NANOG结合位点的区域得到了丰富IGF2BP3型启动子（-869、-746和-147 nt）（图​（图3C）三C） 和2个NANOG结合位点Yap1号机组启动子（-1294和-323 nt）（图​（图3C）。三C） ●●●●。IGF2BP3型Huh7细胞中缺失结构的启动子分析表明含有2个远端NANOG位点（NANOG 1和2，图​图4A）。4A） ●●●●。NANOG对该启动子活性的依赖性通过消除NANOG公司shRNA（图​（图4A）。4A） ●●●●。为了进一步确认–978/+55 nt范围内NANOG位点的功能重要性，我们对3个位点（NANOG 1–NANOG 3）进行了突变。NANOG 1和2位点的突变降低了LPS诱导的IGF2BP3型启动子活性，而NANOG 3位点突变没有影响（图​（图4B），4B） ，表明IGF2BP3型是TLR4信号传递的靶点，主要通过NANOG结合到远端NANOG 1和2位点。对于亚1近端启动子区，具有2个NANOG位点（NANOG 1和2）功能（图​（图4，4、C和D）。这些结果表明TLR4诱导免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组通过NANOG。

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图4

TLR4/NANOG依赖癌基因的鉴定，免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组，来自慢病毒cDNA文库的功能筛选。

(A类)免疫球蛋白2bp3用缺失结构进行启动子分析表明，近端片段（-978/-359nt）在LPS诱导的启动子活性中的重要性TLR4级-转导的Huh7细胞。NANOG对该启动子活性的依赖性也通过以下因素的消除作用来证明NANOG公司shRNA。(B类)-978/+55 nt范围内NANOG共识位点的突变（NANOG结合位点1和2，但不是3）减少LPS/TLR4诱导的IGF2BP3型启动子活性。(C类)亚1用缺失结构进行启动子分析表明，近端片段（-1359/-336nt）在LPS诱导的启动子活性中的重要性TLR4级-转导的Huh7细胞。NANOG shRNA同样会消除启动子活性。(D类)NANOG共识位点之一（NANOG结合位点2）的突变降低LPS/TLR4诱导的亚1启动子活性*P（P）< 0.05.

Yap1和Igf2bp3是TIC癌基因。

验证Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3体外，来自Ns5a号在进行集落形成试验之前，用表达shRNA的慢病毒感染小鼠。菌落形成受到两种药物的适度抑制Yap1号机组shRNA或Igf2bp3型仅shRNA。然而Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3几乎完全消除了菌落形成（图​（图5A）。5A） ●●●●。此外，shRNA对这两种病毒的转导Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3在第一、第二和第三通道中，显著减少了TIC形成的球体数量（图​（图5B）。5B） ●●●●。细胞裂解物的免疫印迹证实了TICs中YAP1或IGF2BP3的表达增强，以及这些蛋白与特定shRNA的有效击倒（图​（图5C）。5C） ●●●●。然后，我们通过在体内移植TIC（沉默或不沉默）来测试这两个基因的致癌活性Yap1号机组和/或免疫球蛋白2bp3在NOG小鼠中。移植了用空载体转导的TIC或打乱的shRNA的小鼠在14至56天的时间内发生了生长肿瘤（图​（图5D）。5D） 。转导免疫球蛋白2bp3shRNA，但不是Yap1号机组shRNA仅在第56天适度降低了肿瘤大小。然而，这两个基因的沉默在随后的所有3个时间点（即第28天、第42天和第56天）都显著降低了肿瘤的生长，证实了这2个基因在肿瘤发生中的协同作用。这些结果表明Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3通过不同的机制发挥作用，并协同作用于致癌效应。

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图5

的验证Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3作为TIC致癌基因。

(A类)shRNA慢病毒转导可适度减少软琼脂中TICs形成的菌落数量Yap1号机组或免疫球蛋白2bp3但在取消这两项时基本上被废除了。状态3沉默没有效果*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (B类)通过球体形成试验评估的自我更新能力在sh中降低-Yap1号机组/第页-免疫球蛋白2bp3–转导的TIC。sh的双重转导也降低了连续球体形成能力-亚1和sh-免疫球蛋白2bp3. *P（P）< 0.05. (C类)免疫印迹分析显示IGF2BP3和YAP1在TICs中的诱导表达以及各自shRNA的有效敲除(D类)转导Ifg2bp3号机组shRNA，但不是Yap1号机组shRNA，适度减少皮下肿瘤生长Ns5a号NOG小鼠中的Tg小鼠，而两种shRNA的转导在后3个时间点明显抑制生长。携带TIC衍生肿瘤的NOG小鼠的代表性照片显示，肿瘤大小明显减小免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组沉默*P（P）< 0.05, **P（P）与扰乱shRNA组相比，P<0.01。

YAP1和IGF2BP3抑制TGF-β途径。

虽然TLR4/NANOG在我们的TICs中被确定为一种新的致癌途径，但由至少一种TGF-β信号传导成分失活引起的TGF-β途径缺陷也是人类HCC的一个众所周知的风险因素(45,46)动物模型中的因果致癌机制(23,47). 因此，我们假设这两条通路可能相互调节，并与TICs的致瘤活性相关。事实上，与对照细胞相比，在LPS或TGF-β刺激下，TICs中PAI-1启动子活性（TGF-？介导的SMAD3/4活性的一个参数）降低（补充图5A），尽管Tgfbr2型或Smad3公司在2个人群中（补充图5B）。YAP1可能与SMAD7相互作用，增强SMAD7对TGF-β/SMAD3信号的抑制活性(48).免疫球蛋白2bp3编码一个mRNA结合蛋白，该蛋白通过结合5′UTR促进IGF-II翻译免疫球蛋白-II信使核糖核酸(41). IGF-II激活AKT，随后激活mTOR，这可能会抑制SMAD3的激活(49). 因此，我们假设通过TLR4/NANOG在TIC中诱导的YAP1和IGF2BP3抑制TGF-β信号传导并促进肿瘤发生。为了验证这个观点，我们沉默了Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3单独或同时与TIC中的shRNA结合，以确定其对TGF-β诱导的PAI-1启动子活性的影响。与对照细胞相比，TICs再次显示TGF-β诱导的启动子活性较低。Yap1号机组或免疫球蛋白2bp3沉默适度地增加了活性，但沉默这两个基因明显上调了TIC中的活性，但没有上调对照细胞中的活性（图​（图6A）。6A） ●●●●。为了专门研究典型的TGF-β途径，我们检测了TGF-α处理的TIC的全细胞和核提取物中的p-SMAD3水平（有或无）亚1和/或免疫球蛋白2bp3沉默。该分析表明TGF-β诱导的p-SMAD3水平通过沉默而增加，并且通过沉默这两个基因而更为显著（图​（图6B），6B） ，证实PAI-1启动子结果。

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图6

由于YAP1和IGF2BP3对SMAD3通路的干扰，TICs在TGF-β信号传导中存在缺陷。

(A类)TICs中TGF-β刺激的PAI-1启动子活性低于对照细胞。此缺陷通过Yap1号机组或免疫球蛋白2bp3shRNA单独和两者协同纠正*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (B类)TGF-β处理的TIC中p-SMAD3或SMAD3的核水平增加Yap1号机组或免疫球蛋白2bp3用各自的shRNA沉默，并通过沉默这两个基因而显著沉默。(C类)SMAD7与YAP1、p-YAP1和SMAD3的相互作用增加免疫球蛋白2bp3表达YAP1的PIL4细胞（PIL4-YAP1细胞）中的转导，并且这些相互作用被Yap1号机组shRNA（左上）。在相同的PIL4-YAP1细胞中免疫球蛋白2bp3转导，增加的SMAD7与p-YAP1和SMAD3的相互作用被阿克特沉默。相反，降低的核p-SMAD3水平增加。MST1和LATS1/2的磷酸化通过IGF2BP3的过度表达而增加，但通过阿克特沉默。(D类)荧光显微镜显示通过沉默TGF-β处理的TIC中SMAD3的核染色增加免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组点圆圈表示细胞核的轮廓。原始放大倍数，×200。(E类)Rapa（200 nM）进一步增加TGF-β诱导的核p-SMAD3水平，该水平已经通过沉默而增强Yap1号机组或免疫球蛋白2bp3. (F类)Igf2bp3/Yap1沉默而非rapa可增强CA-SMAD3诱导的3TP-Luc启动子活性*P（P）< 0.05.

接下来，我们研究了YAP1是否与SMAD7/SMAD3相互作用以抑制TGF-β信号传导和免疫球蛋白2bp3影响这种互动。为了进行此分析，我们使用了转导的PIL-4细胞Yap1号机组cDNA（PIL-4-YAP1）。用SMAD7抗体进行免疫沉淀，然后用抗YAP1、抗p-YAP1（p-Ser127）或抗SMAD3进行免疫印迹，发现SMAD7与YAP1，p-YAP1和SMAD3的相互作用，所有这些都被Yap1号机组沉默，但IGF2BP3表达增加（图​（图6C，6C、 左上面板）。IGF2BP3刺激的YAP1/SMAD7/SMAD3相互作用也随着Yap1号机组shRNA，表明YAP1和IGF2BP3通过增加YAP1/SMAD7/SMAD3相互作用抑制TGF-β信号。我们进一步研究了AKT在调节这些相互作用中的作用，因为已知AKT抑制TGF-β信号传导(50).阿克特用特异性shRNA沉默可减少SMAD7与YAP1、p-YAP1和SMAD3的相互作用，同时增加PIL4-YAP1细胞的核p-SMAD3水平，这些作用在免疫球蛋白2bp3-转导细胞（图​（图6C，6C、 左下角）。AKT磷酸化MST1，MST1反过来磷酸化YAP1的Ser127以促进细胞存活(51)免疫印迹分析检测p-MST1水平。IGF2BP3的表达以依赖于AKT的方式增加了p-AKT和p-MST1（图​（图6C，6C、 右侧），伴随着p-YAP1与SMAD7的相互作用增加（图​（图6C，6C、 左下），支持AKT/MST1/YAP1通路的潜在参与。LATS1和LATS2是其他激酶，也可直接或在MST1下游磷酸化YAP1(52,53). 事实上，p-LATS1和p-LATS2水平均因IGF2BP3表达而增加，并因阿克特消音（图​（图6C，6C、 右侧）。为了获得细胞溶质中YAP1/SMAD7/SMAD3相互作用与还原核p-SMAD3关联的直接证据，对TGF-β处理的TICs进行了免疫荧光显微镜观察，显示SMAD7、YAP1和SMAD3主要在用打乱shRNA转导的TIC的细胞溶质内共定位Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3沉默后，SMAD3核定位变得更加明显（图​（图6D），6D） 支持YAP1/SMAD7/SMAD3相互作用阻止SMAD3激活和TIC核移位的观点。相反，YAP1和IGF2BP3的过度表达抑制了PIL-4细胞中SMAD3的核移位（补充图5C）。

AKT激活的mTOR抑制SMAD3磷酸化(54,55)以及Ser127的YAP1磷酸化阻止YAP1的核移位和有丝分裂活性(56). 因此，我们进一步测试了雷帕霉素（Rapa）、mTOR抑制剂或YAP1 S127A突变体是否减少了组成活性肉豆蔻酰化AKT（AKT）刺激的YAP1/SMAD7相互作用_迈尔). 用转导的PIL-4细胞Yap1号机组和阿克特_Myr公司显示了YAP1和SMAD7之间的强相互作用，这不受Rapa的影响，表明mTOR在YAP1/SMAD7相互作用中不起作用（补充图5D）。相反，当表达YAP1-S127A突变体时，即使在AKT存在的情况下，也会减少YAP1和SMAD7的相互作用_迈尔，表明AKT在YAP1/SMAD7相互作用中Ser127磷酸化的重要性（补充图5D）。

接下来我们研究了mTOR是否调节转化生长因子β诱导的PIL-4细胞SMAD3磷酸化激活。TGF-β诱导的p-SMAD3水平因IGF2BP3过度表达而降低，但因Rapa而增加（补充图5E，车道2 vs.车道4或车道6。在我们的TIC、Rapa或Yap1号机组shRNA增强TGF-β诱导的p-SMAD3水平（图​（图6E，6E、 顶部，第2车道与第4车道或第6车道），这两种处理都会产生协同效应（图​（图6E，6E、 表明YAP1和mTOR在不同水平上抑制SMAD3的激活。使用免疫球蛋白2bp3沉默后，我们还观察到Rapa对核p-SMAD3的增强作用（图​（图6E，6E、 底部）。为了证实mTOR的作用，该激酶被shRNA沉默。该操作还增加了TGF-β诱导的TICs中的p-SMAD3水平（补充图5F），证实了mTOR在SMAD3激活中的负调控作用。接下来，我们测试了Rapa加上两者沉默的效果Yap1号机组和Igf2bp3型事实上，拉帕和Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3沉默对TGF-β诱导的p-SMAD3水平具有协同作用（补充图5G，最后一条车道），表明mTOR对SMAD3的激活具有独立的负调控作用，而YAP1和IGF2BP3的调控作用不同。Rapa还消除了组成活性AKT引起的p-SMAD3抑制水平_迈尔（补充图5G，车道5与车道8）。

然后，我们通过在TICs中TGF-β特异性3TP荧光素酶报告试验中检测这些阴性调节物对组成活性SMAD3（CA-SMAD3）的抑制作用，询问mTOR、YAP1和IGF2BP3是否影响SMAD3激活下游的TGF-？途径（核转位和启动子激活）。Rapa未能增强CA-SMAD3诱导的启动子活性（图​（图6F，6F、 bar 2 vs.bar 3），表明mTOR的抑制作用主要在SMAD3的磷酸化激活水平。相反，CA-SMAD3介导的启动子活性仍然通过沉默Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3（图​（图6F，6F、 bar 2 vs.bar 4），这表明这些分子在SMAD3激活下游也有负面影响，很可能是通过增强p-Yap1、p-SMAD3和SMAD7的相互作用阻断p-SMAD2核转位，如上所示。最后，我们确定了Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3干扰素基因表达的沉默(纳克,CD133型,10月4日、和Sox2系统)和分化相关基因(阿尔布和Krt19). qRT-PCR结果显示所有干细胞基因和Krt19通过这种操作，同时诱导白蛋白表达（补充图5H）。此外，Yap1号机组和免疫球蛋白2bp3沉默被废除纳克TIC中的启动子活性达到与对照细胞中活性相似的水平（补充图5I）。总之，这些结果证明了NANOG诱导的YAP1和IGF2BP3在TICs细胞命运调节中抑制TGF-β典型途径的机制和功能重要性。

抑制TGF-β信号传导激活TLR4/NANOG致癌途径。

我们的结果表明，受抑制的TGF-β肿瘤抑制途径在激活致癌TLR4信号和TIC生成中起着关键作用。接下来，我们提出了一个问题，即TICs中TGF-β途径的直接基因操作是否会影响其致瘤活性。通过腺病毒转导组成性活性TβRI实现TGF-β信号转导的功能获得途径(57)我们测试了其对NOG小鼠皮下肿瘤生长的影响。与感染表达LacZ病毒的细胞作为对照相比，这种操作确实减少了肿瘤的生长（图​（图7A）。7A） ●●●●。相反，抑制性SMAD7的过度表达或针对伴侣蛋白β2谱蛋白的shRNA的表达(自旋蛋白2)，将p-SMAD3/SMAD4募集到细胞核中，促进肿瘤生长（图​（图7A）。7A） ●●●●。这些结果证实了抑制TGF-β肿瘤抑制途径在TIC致癌活性中的重要性。

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图7

TGF-β途径的抑制促进TLR4介导的肿瘤发生。

(A类)TICs引起的皮下肿瘤生长Ns5a号通过腺病毒转导组成活性TβRI（caALK5）的TGF-β信号转导的功能增强方法，NOG小鼠中的Tg小鼠肿瘤被减弱，而其通过过度表达Smad7公司或shRNA对抗自旋2。(B类)SPNB2型敲低诱导Huh7细胞的TLR4和肿瘤起始特性，这不会引起自发的异种移植物生长。这一增长SPNB2型shRNA对TLR4的敲除在很大程度上阻止了敲除。图中显示了88天NOG小鼠荷瘤的典型图片。(C类)杂合性自旋蛋白2诱导TLR4表达和下游信号转导（TAK1/TRAF6关联），这些变化在12个月的酒精喂养中更加明显。(D类)自发性肝癌的发病率自旋蛋白2^+/–老鼠，但不在自旋蛋白2^+/–Tlr4号机组小鼠，通过酒精喂养而增加。(E类)击倒SPNB2型shRNA诱导TLR4，而caSMAD的过度表达降低了Huh7细胞中的TLR4。(F类)击倒SPNB2型在Huh7细胞中同样促进LPS诱导的TLR4级启动子包含3个近端SMAD反应元件（SRE）。(克)CA-SMAD3的表达抑制了Huh7细胞中LPS介导的TLR4启动子（–4121/+180 nt）的活性*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01.

为了在人类身上获得这一发现的相关性，我们推倒了SPNB2型抑制人肝癌细胞株Huh7中的TGF-β途径，并测定其对NOD小鼠肿瘤生长的影响。有趣的是，SPNB2型敲除本身在Huh7细胞中诱导TLR4（图​（图7B）。7B） ●●●●。尽管用干扰shRNA转导的Huh7细胞没有生长，SPNB2型敲低使细胞形成由TLR4免疫反应性增强的细胞组成的快速生长的肿瘤（补充图6）。这种生长被shRNA抑制TLR4级（图​（图77B） ●●●●。

为了在整个动物模型中进一步验证这一概念，我们研究了自旋蛋白2^+/–杂合小鼠。自旋蛋白2^+/–TGF-β信号减弱的小鼠自发发展为HCC(15). 如Huh7单元所示SPNB2型与WT小鼠相比，该基因小鼠模型的肝脏中诱导了TLR4的敲除（图​（图7C）。7C） ●●●●。要激活TLR4信号，自旋蛋白2^+/–给小鼠喂食酒精12个月。根据TAK1/TRAF6相互作用评估，TLR4激活在酒精喂养的肝脏中明显自旋蛋白2^+/–鼠标（图​（图7C）。7C） ●●●●。更重要的是，这种治疗增加了自旋蛋白2^+/–老鼠，但不在自旋蛋白2^+/–Tlr4号机组^–/–复合小鼠（图​（图7D），7D） 表明通过酒精摄入激活TLR4途径可促进肿瘤的发生自旋蛋白2^+/–TGF-β信号转导减少且TLR4双向上调的小鼠。

然后我们询问TLR4是如何被TGF-β负调控的。已知SMAD3和AP1之间的相互作用会抑制SMAD3 DNA结合能力(58). 由于在TLR4级启动子，我们测试SMAD3是否抑制LPS介导的TLR4级Huh7细胞中的启动子活性（图​（图7F）。7F） ●●●●。的静音SPNB2型在Huh7细胞中（图​（图7E）7E） 显著增强LPS诱导的TLR4启动子激活（图​（图7F）。7F） ●●●●。相反，CA-SMAD3过度表达显著降低了TLR4蛋白的表达（图​（图7E）7E） 和启动子活性（图​（图7G）。7G） ●●●●。这些结果表明TGF-β信号传导直接抑制TLR4级启动子和缺陷的TGF-β信号传导促进LPS诱导的TLR4转录。这些结果，以及我们的YAP1/IGF2BP3数据，支持TLR4和TGF-β的相互拮抗调节及其在肝癌发生中的意义。

人类肝癌患者TLR4/NANOG/YAP1/IGF2BP3通路成分的表达增强。

为了获得我们研究结果的临床相关性，我们对人类肝癌标本（补充表3和表4中描述的临床病理特征）进行了分析。免疫印迹显示，与非肿瘤性肝硬化或正常肝组织相比，HCV伴或不伴酒精中毒患者HCC中YAP1、IGF2BP3、TLR4和NANOG的水平显著升高（图​（图8A）。8A） ●●●●。此外，与非肿瘤肝组织相比，HCC切片显示TLR4、NANOG、YAP1和IGF2BP3染色增加（图​（图8B8B和补充图7，A和B）。为了扩大相关性，我们还检测了未感染HCV的非酒精性脂肪性肝炎患者的HCC。同样，与非癌肝组织相比，这种病因的HCC中NANOG、YAP1和IGF2BP3染色增加，而p-SMAD3染色减少（图​（图8C8C和补充图7C）。在34例HCC患者中，18例在诊断之日起5年内死于该病，其余16例存活5年以上。在该患者队列中，IGF2BP3阳性患者5年内死亡的几率显著高于IGF2BP2阴性患者（比值比[OR]=15.2，95%CI=2.8-81；P（P）=0.001）（图​（图8D）。8D） 。同样，与无免疫反应的患者相比，YAP1阳性患者的5年死亡率明显更高（OR=15，95%CI=2.8-80；P（P）=0.002）（图​（图8D）。8D） 。肝肿瘤中IGF2BP3和YAP1阳性的患者在5年内死亡的几率明显高于2个因子中只有1个阳性的患者（图​（图8D，8D、，P（P）< 0.001). 这些结果表明，人类肝癌中TLR4/NANOG/YAP1/IGF2BP3通路被激活，并与患者预后不良相关。

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图8

人肝癌中TLR4/NANOG/YAP1/IGF2BP3通路成分的诱导。

(A类)与肝硬化或健康肝脏相比，无酒精或有酒精中毒的HCV感染患者的HCC标本中TLR4、NANOG、IGF2BP3和YAP1蛋白水平升高。(B类)免疫荧光显微镜显示，与正常肝脏相比，NANOG、TLR4、YAP1和IGF2BP3的表达更高，它们通常在HCC患者标本中共存。原始放大倍数，×200。(C类)免疫荧光显微镜显示，与正常肝脏相比，NANOG、YAP1和IGF2BP3的表达增加，它们通常在非酒精性脂肪性肝炎（NASH）患者的HCC标本中共存。肝癌中p-SMAD3染色则相反减少。原始放大倍数，×200。(D类)与IGF2BP3和YAP1免疫反应阴性（红线）患者相比，IGF2BP3/YAP1阳性的HCC患者在初始诊断后5年内患者死亡的log OR（和95%CI）增加。

TIC的隔离。

CD133型⁺/CD49f型⁺TIC与CD133分离^–/CD49f型⁺或CD133^–/CD49f型^–来自CD45的FACS细胞^–肿瘤组织细胞悬浮液分数(61,73)如补充方法中详细描述的，从动物模型和患者。

老鼠。

丙型肝炎病毒Ns5a号Tg小鼠由Ratna Ray（美国密苏里州圣路易斯市圣路易斯大学）提供。

癌基因的功能性cDNA筛选。

从NANOG中建立了一个慢病毒cDNA文库，表达由EMCV IRES驱动的GFP^你好/TIC和NANOG^洛/CD133/CD49f⁺通过基于网关系统（Invitrogen）的慢病毒RL重组方法使用HEK293T细胞控制细胞。小鼠卵圆细胞系（祖细胞）第53页（永生、非转化PIL-4，1×10⁶单元格）(74)感染了每个慢病毒cDNA文库（约1000万拷贝=10个MOI）。这种病毒cDNA文库技术以前曾被用于体外克隆和测试癌症驱动基因(75–77)和体内(37,78). 感染后7天，通过FACS分选GFP阳性的PIL-4细胞以消除未转染的细胞。然后将GFP阳性细胞接种到软琼脂平板中，进行如前所述的集落形成分析(76,79). 简而言之，将1%的软琼脂与等效的2×培养基混合在6孔板中制成基层。收集转导的PIL-4细胞，将其悬浮在含有0.35%软琼脂的培养基中，并使用24孔板以不同密度接种在基底层上，从每孔5000个细胞开始。平板保持在37°C，每3天喂食0.1 ml完整的Williams E培养基（30 ng/ml IGF2、20 ng/ml EGF、10μg/ml胰岛素和10%胎牛血清）。2周后，对形成的菌落数进行计数，并通过环形克隆分离菌落，并在相同的培养基中繁殖，以便在前面描述的显微镜下进行后续分析(80,81). 作为对照，使用表达干扰shRNA的慢病毒载体。使用24孔板评估致癌参数（菌落大小、增殖和侵袭活性），以确定通过本试验测试的候选基因的优先级，并且我们按照前面的描述剔除了列表中优先级最高的基因(75–77). 感染这些文库的细胞培养物形成了许多明显转化的菌落，具有各种形态和生长速度，而未感染的细胞培养液或感染了CD133衍生病毒的细胞培养^–/CD49f细胞⁺对照细胞的转化集落出现频率较低，相当于这些实验中使用的PIL-4细胞的低自发转化率。用BrdU染色法检测96个平板的细胞增殖率。

体内外致癌活性。

TIC和控制CD133^–/CD49f型^–用软琼脂24孔培养板或超低粘附培养板中的球形培养板检测细胞的集落形成。细胞增殖率通过纳入^三96 well板中的H-尿苷。侵袭活性由Biocoat Matrigel侵袭室（BD Biosciences Labware）测定。载体（pCR2.1-NANOGP8和pPyCAG-NANOGP8）由Dean G.Tang（德克萨斯大学MD Anderson癌症中心）提供。对于异种移植物移植，用表达GFP和shRNA靶向的慢病毒载体感染细胞Yap1号机组或免疫球蛋白2bp3或打乱shRNA。感染细胞（1×10⁴)将Matrigel注射到裸鼠、NOG或免疫竞争性小鼠体内。将肿瘤组织进行快速冷冻，以分析TLR4和TGF-β信号成分和致癌因子的mRNA和蛋白，用3%多聚甲醛固定以随后进行TIC标记物的免疫染色，或H&E染色和肿瘤细胞的组织学评价。

经脾注射肝TIC植入。

测试化疗药物和Igf2bp3/Yap1抑制小鼠TICs、TICs或CD133衍生的肝癌生长^–/CD49f型⁺对照细胞用慢病毒GFP预先标记并用shRNA转导免疫球蛋白2bp3和Yap1号机组然后如前所述，脾内注射C57BL/6小鼠(37). 慢病毒转导效率由GFP阳性的FACS分析监测。95%以上的TIC通过慢病毒转导进行常规标记。手术前用2剂量逆转录酶（70 mg/kg，i.p.）对受体小鼠进行预处理，逆转录酶是一种生物碱，对天然肝细胞增殖具有强烈且持久的阻滞作用，从而提高移植细胞的竞争优势。对于细胞的脾内注射，用氯胺酮和甲苯噻嗪的混合物（Abbott Laboratories）以100mg/ml的强度腹腔注射诱导麻醉，剂量为每20克体重0.1毫升。在直视下，用一根27口径的针头，通过左侧的一个小切口将细胞注入脾脏。脾被缩回，脾的下极被4-0 vicryl结扎环绕。在2分钟内将0.2 ml培养基中的指定细胞数注入脾脏下极。使用4-0 vicryl缝合腹部。移植的细胞被允许迁移到受体肝脏并移植器官。为了进一步促进移植细胞的扩增，受体小鼠接受CCl治疗₄（剂量：0.5 ml/kg i.p.，间隔1周，脾注射后第14、21和28天30天内3个周期），导致肝脏损伤和再生。皮下注射CCl导致急性肝损伤₄移植前2天在橄榄油中溶解。为了确定这些细胞是否定植于受体肝脏，我们在南加州大学放射科动物成像中心通过GFP成像监测了肝脏肿瘤的生长。大约百分之一的宿主肝脏由嵌入正常肝脏结构中的“种子”GFP阳性细胞组成。至少在2个（通常是垂直的）水平上拍摄图像，并进行对比度和亮度处理，随后使用Image Pro Plus 3.1软件（Media Cybernetics）进行分析。图像直接在微型计算机上捕获，或通过高分辨率VCR（SLV-R1000，索尼公司）上的视频输出连续捕获。在一个由蓝光光纤（Lightools Research Inc.）照明的灯箱中，使用热电冷却彩色CCD相机进行低倍成像，以可视化整个动物。

统计。

条形图和折线图中的数据显示为平均值+SD。P（P）小于0.05的值被认为是显著的。使用线性混合效应模型检查不同组小鼠之间的肿瘤生长速度是否存在差异，例如，移植有靶向细胞基因的shRNA转导的TIC的小鼠与打乱的shRNA的小鼠。用方差分析评估不同组小鼠在特定时间点的平均肿瘤大小差异。采用Logistic回归法比较5年内死亡的患者中IGF2BP3或YAP1免疫阳性的概率与存活5年以上的患者中IGF2BP3和YAP1阳性的概率。免疫荧光显微镜下染色细胞百分比为0时，YAP1和IGF2BP3免疫反应为阴性，大于0时为阳性。这些统计计算是使用Stata 11.0（StataCorp，Stata statistical Software：Release 11。2009年，StataCorp LP）。全部P（P）报告的值是双面的。

研究批准。

目前对动物和人类的研究由南加州大学动物护理和使用机构委员会和机构审查委员会审查和批准。

我们感谢动物核心人员Akiko Ueno和Raul Lazaro进行小鼠实验；Rajeshwar Nityanandan、Dinesh Babu Uthaya Kumar和Naomi Anderson（南加州大学）提供技术支持和批判性阅读；Ratna Ray（圣路易斯大学）提供HCVNs5a号Tg小鼠；Dean G.Tang（德克萨斯大学MD Anderson癌症中心）提供载体（pCR2.1-NANOGP8和pPyCAG-NANOGP8）；Michael Karin（UCSD）提供建议和试剂；和Steve Weinman（堪萨斯大学）进行评论和讨论。该项目得到了NIH拨款1R01AA018857、5RC2AA019392、P50AA11999（动物核心、形态学核心和试点项目计划）、5P30DK048522-13（试点项目资金）、R24AA012885（非实质性肝细胞核心）、AI83025U19、CA123328、CA108302、R01 CA042857（给L.Mishra）、P01 CA130821（给L.Mishra的）、P30 CA016672（给R.DePinho的）、，和P30 DK56338（致M.Estes）以及U19AI83025，Zumberge基金会。本研究还得到了美国癌症协会的研究学者拨款（RSG MPC122545（致K.Machida）和试点资金（IRG-58-007-48）以及德国研究基金会的SFB-TRR77“肝癌”（致S.Dooley）的支持。显微镜检查由南加州大学肝病研究中心的细胞和组织成像核心进行（P30 DK048522）。Susan Groshen和Lingyun Ji在诺里斯综合癌症中心生物统计核心（由NIH/NCI P30 CA 014089支持）中进行了统计分析。动物成像由南加州大学分子成像中心进行（由NIH/NVRR S10支持）。组织病理切片由莫里·陈在诺里斯综合癌症中心转化病理中心进行。肝组织取自明尼苏达大学的肝组织细胞分布系统。