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《维罗尔杂志》。2004年2月；78(4): 1800–1816.
doi（操作界面）：10.1128/JVI.78.4.1800-1816.2004
预防性维修识别码：下午269510
PMID：14747545

核因子κB依赖性激活抗凋亡药物高炉煤气-1EB病毒潜伏膜蛋白1和活化CD40受体基因

布伦丹·N.D’Souza,1中，† 伦纳德·C·埃德尔斯坦,2,‡ 帕梅拉·佩格曼,1 西内德·史密斯,1 Sinéad T.Loughran先生,1 安·克拉克,1中，§ 安贾·梅尔,三，∥ 马丁罗威,三 塞琳·盖利纳斯,2和Dermot墙1中，*
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

致癌疱疹病毒EB病毒（EBV）抑制细胞凋亡程序对潜伏感染的形成和EBV相关恶性肿瘤的发展至关重要。我们之前已经证明，EBV潜伏膜蛋白1（LMP1）在Burkitt淋巴瘤细胞系中的表达导致细胞抗凋亡的mRNA水平增加高炉煤气-1基因（也称为A1类). 此外，在表现出潜伏期1型感染的EBV阳性细胞系中异位表达Bfl-1可以保护细胞免受生长因子剥夺诱导的凋亡（B.N.D’Souza，M.Rowe和D.Walls，J.Virol）。74:6652-6658, 2000). 我们现在报告LMP1驱动器高炉煤气-1通过与肿瘤坏死因子受体（TNFR）/CD40信号通路成分的相互作用实现启动子活性。我们提供的证据表明，该过程是NF-κB依赖性的，涉及TNFR-相关因子2的招募，并且在很大程度上由与LMP1的CTAR1结构域相关的羧基末端激活区2（CTAR2）介导。CD40受体的激活也导致高炉煤气-1mRNA水平和NF-κB依赖性增加高炉煤气-1Burkitt淋巴瘤衍生细胞系中的启动子活性。我们已经描绘了启动子的95-bp区域，该区域在细胞环境中作为LMP1依赖的转录增强子发挥作用。该序列包含一个新的NF-κB样结合基序，该基序对高炉煤气-1通过LMP1、CD40和NF-κB亚单位蛋白p65。这些发现突出了LMP1作为EBV-宿主细胞相互作用的介质的作用，并可能表明LMP1发挥其细胞生长转化特性的重要途径。

EB病毒（EBV）是一种普遍存在的人类疱疹病毒，与传染性单核细胞增多症和一系列恶性疾病有关，包括非洲地方性伯基特淋巴瘤（BL）、间变性鼻咽癌、霍奇金病和免疫缺陷患者的淋巴增殖性疾病（有关综述，请参阅参考文献59和102). 在体外，EBV在转化和永生化静止的人类B淋巴细胞方面特别有效，导致转化的和永生的淋巴母细胞系（LCL）的生长，这些细胞系显示出多种细胞活化抗原和粘附分子的水平升高（有关综述，请参阅参考文献74). 在LCL中，病毒基因表达通常仅限于编码六种Epstein-Barr核抗原（EBNA1、2、3A、3B、3C和LP）、三种完整膜蛋白（LMP1、LMP2A和2B）和两种小核RNA的有限数量的潜在基因（有关综述，请参阅参考文献37). 其中五种（EBNA1、EBNA2、EBNA3A、EBNA3C和LMP1）已被证明对B细胞永生化过程至关重要（有关综述，请参阅参考文献62).

许多EBV相关恶性肿瘤中LMP1表达的频繁检测表明，该蛋白有助于肿瘤的发生。一些研究表明LMP1具有致癌特性。LMP1的表达导致啮齿动物成纤维细胞系的转化，并使其在裸鼠体内致瘤(118). 在BL-衍生细胞系中，LMP1诱导了EBV感染中观察到的许多表型变化，包括B细胞活化标记物和细胞粘附分子的上调，以及对诱导凋亡的刺激的抵抗力增加(74). 在上皮细胞中，LMP1的表达阻断了正常的分化过程，这让人想起在鼻咽癌中经常观察到的未分化表型(23). 与这些体外研究结果一致，LMP1在转基因小鼠的皮肤或B细胞室中的靶向表达分别导致上皮细胞过度增殖和淋巴腺病的诱导(77,120). 最近也有研究表明，LMP1对于使SCID小鼠的LCLs具有致瘤性至关重要(27).

抑制凋亡死亡是LMP1的一种功能，有助于其致癌性。LMP1可以通过上调包括Bcl-2、A20和Mcl-1在内的几种抗凋亡蛋白的表达来保护细胞免受凋亡，这一机制已被广泛证实(41,53,78,91,106,119)从而提高了受感染细胞的凋亡阈值，并且还提供了对一系列凋亡诱导刺激的保护。以前的研究表明，增加的mRNA水平bcl公司-2家庭成员，高炉煤气-1是EBV感染的B淋巴细胞表现出3型潜伏期的特征，并且LMP1在EBV阴性BL细胞系中的表达与高炉煤气-1mRNA水平(30). 在该研究中，当Bfl-1在相同的细胞环境中表达时，它可以防止血清耗竭诱导的细胞凋亡。Bfl-1是一种抗凋亡蛋白，其在造血细胞和内皮细胞中的优先表达受肿瘤坏死因子（TNF）和白细胞介素-1（IL-1）等炎症刺激物的控制(17,67,68).高炉煤气-1是一只老鼠A1类同源并编码一个175-氨基酸蛋白质，与其他Bcl-2家族成员共享高度保守的Bcl同源1（BH1）、BH2和BH3结构域。Bfl-1已被证明能抑制p53介导的凋亡，并在体外具有细胞增殖和转化活性(28,29,84). 高架高炉煤气-1据报道，在正常白细胞和几种癌细胞系中均有表达(73,97).

LMP1，TNF受体（TNFR）/CD40超家族成员(5)作为组成活性受体发挥作用(46)和主要来自细胞内隔间的信号(80). 富含鞘糖脂的膜筏内的寡聚和定位对信号的启动至关重要(21,36,56). LMP1的细胞质羧基末端尾部包含两个主要效应域，即C末端激活区1（CTAR1），也称为转化效应位点1（TES1）和CTAR/TES2。CTAR1位于细胞膜附近，结合TNFR-相关因子（TRAFs）(26,61)，对EBV介导的B细胞永生化至关重要(65,69,70). 位于C末端附近的CTAR2/TES2支持永生化B细胞的长期生长(64)并招募TNFR-associated death domain（TRADD）蛋白和受体相互作用蛋白(34,61,63). 因此，LMP1触发了几种导致转录因子激活的信号通路，包括NF-κB、STATs、AP-1和ATF2(8,33,35,45,61,75,101). NF-κB在大多数LMP1刺激的基因表达中起关键作用(25,52,88,95,121). LMP1和活化的CD40受体启动重叠的信号通路，调节主要的细胞命运决定，包括增殖、分化和凋亡(1,5,46,51,72,76,114,122). 尽管有许多相似之处，但它们也存在实质性差异（有关审查，请参阅参考文献79). 在这方面，已经证明，虽然LMP1和CD40可以独立地结合几个相同的TRAF分子（即TRAF2、3和5），但TRAF6与CD40结合但不与LMP1结合，并且据报道TRAF1和TRADD与LMP1-结合但不直接结合CD40(10).

我们现在首次报道LMP1刺激高炉煤气-1EBV阴性BL衍生的细胞系中的启动子活性，并且该过程涉及与TNFR/CD40信号通路的成分的相互作用。我们提供的证据表明，这个过程是NF-κB依赖性的，涉及TRAF2的募集，并且在更大程度上由CTAR2介导，而不是由CTAR1介导。CD40受体的激活也导致高炉煤气-1mRNA水平和NF-κB依赖性增加高炉煤气-1启动子在同一细胞环境中的活性。我们描述了启动子的一个95-bp区域，该区域作为LMP1依赖的转录增强子发挥作用，并且我们提供证据表明该序列包含一个新的NF-κB样结合位点，该位点对转录激活高炉煤气-1通过LMP1、CD40和NF-κB亚单位蛋白p65。

材料和方法

细胞培养。

DG75和BL41是EBV阴性BL细胞系(7,104). BL41-B95-8是感染EBV B95-8株的BL41的衍生物(13). MUTU-I和Rael是从EBV阳性BL活检标本中建立的I组/潜伏期1细胞系(48,87). DG75的DG75tTA-LMP1转染体包含四环素调节的LMP1表达质粒，并且已在前面描述过(38). 所有细胞系均以悬浮培养的形式保存在RPMI 1640（Gibco）中，并在37°C、含5%二氧化碳的湿化空气中补充10%胎牛血清（Gibco-）、2 mM谷氨酰胺、100μg链霉素/ml和100 IU青霉素/ml。DG75-tTA-LMP1细胞保持在800μg潮霉素B（罗氏诊断）/ml和2 mg G418（罗氏检测）/ml以及1μg四环素（西格玛）/ml的选择下，以抑制LMP1的表达。为了诱导LMP1，细胞在磷酸盐缓冲盐水中清洗五次，然后在无四环素培养基中重新培养。其他地方已经描述了稳定转染人CD32/Fc-gRII（CD32-L细胞）或人CD40配体（CD40lig-L细胞）的小鼠成纤维细胞L细胞系的建立和培养(43,98).

质粒。

荧光素酶报告子构建物−1374/+81-Luc、−1374/+81（mκB-833）、−1240/+81-Lug、−367/+81-Luch和−129/+81-Loc是通过亚克隆产生的高炉煤气-1氯霉素乙酰转移酶报告基因序列的启动子序列(123). 因此，高炉煤气-1用氯霉素乙酰转移酶报告载体多克隆位点的正向寡核苷酸引物（5′-TTGCATGCCTGCAGGTCGA-3′）和氯霉素乙酰化酶报告载体的反向引物（5'-gggaagCTAGCTCCTGGTG-3′）通过PCR扩增启动子序列高炉煤气-1发起人，其中包括Hin公司dIII限制位点及其5′端的消化钳（以小写形式显示）。因此，所有PCR产物都包含一个共同的3′末端，相对于转录起始位点为+81 bp。然后用酶消化PCR产物萨尔我和Hin公司dIII和克隆Xho公司我和Hin公司无启动子荧光素酶报告子的dIII位点构建pGL2Basic（Promega）。这个萨尔I位点存在于聚合酶链反应扩增部分的5′端高炉煤气-1启动子序列。为了产生−57/+81-Luc，正向引物5′-ccgctcgagGAAGGATATTATAAAAG-3′（包括Xho公司I位点和消化钳，以小写形式显示）与上述相同的反向引物一起用于扩增高炉煤气-1启动子序列介于−129/+81 Luc的−57 bp和+81 bp之间。PCR产物用Xho公司我和Hin公司dIII并如上文所述亚克隆到pGL2Basic。

为了生成pGa（−129/+1）、pGa（−129/−26）、pGa（−129/−34）、pGa（−129/−34mκB）、pGa（−129/−54）和pGa（−34/−129mκB）高炉煤气-1启动子通过PCR扩增，正向和反向引物包括巴姆HI位点位于其5′端（以小写形式显示）。所用PCR引物如下：−129正向，5′-cgcggatccAAACTTCTCTTTCATAC-3′+1反向，5′-cgcggatccGAGCTTGACTGAGTTATG-3′；−26反面，5′-cgcggatccTGATACATGAGGCTGGT-3′；−34反面，5′-cgcggatccGAGGCTGTGGAATTTTCTG-3′；−34逆转（NF-κB突变），5′-cgcggatccGAGGCTGGAG公司A类C类TTCTGTTTG-3′；−54反面，5′-cgcggatccTTTGCATCACTTATAATAT-3′。在−34reverse（NFκB突变）的情况下，亚克隆到pGa（−129/−34mκB）的序列上NF-κB样位点的碱基变化在引物序列中加了下划线。所有PCR产物用巴姆HI和子克隆到巴姆pGa50-7的聚合剂中的HI位点(81). 使用QuikChange XL定点突变试剂盒（Stratagene）进行定点突变。以下两对互补寡核苷酸被用于产生突变（引入的序列变化被强调）：NF-κB样位点位于−52，5′-GTGCAAAACAGAAG公司T型计算机断层扫描CACCACCTCCATGTCATC-3′和5′-GATGATACATGAGGCTGGTGAG公司A类C类TTCTGTTTGCATCAC-3′；位于−104/−94，5′-CTTTTCTTTCATACAT的类AP1位点自动液位计T型自动变速箱AACACAGCTACCTG-3′和5′-CGTGTCGTAGGCTGGTT自动变速箱A类CCAT公司ATGTATAAAGAAAG-3′；位于−74/−64，5′-GCCTACACGAAAG的类AP1位点AAT公司CTAGGAGGAAGGAGAGATATATATAAAAGTG-3′和5′-CACTTTATAATACTCTAGATT公司CTTTCGTGCGTAGGC-3′。3Enh-Luc报告子结构包含与萤火虫荧光素酶基因连接的最小共白蛋白启动子上游的三个κB元件(2). 以下使用的质粒已在别处发表：pEFCX、pEFCX-LMP1和pEFCX-IκBαDN(83)；pSFFVA20和pcDNA3-TRAF2Δ（6-86）(32,34)；第SG5-LMP1页(61)；pSG5-LMPAAA型(35)；第5页SG5-LMPG(40)；pSG5-LMPAAAG公司(8)；pcDNAp65、pcDNAp50和pcDNAc-Rel(123).

转染和报告分析。

采用DEAE-右旋糖酐法进行转染。简而言之，107用磷酸盐缓冲盐水冲洗细胞一次，然后将其重新悬浮在1.2 ml转染溶液（0.5 mg DEAE-右旋糖酐[Sigma]/ml）中，并将高达16.0μg的DNA悬浮在TBS中（25 mM Tris-HCl[pH7.4]，137 mM NaCl，5 mM KCl，0.7 mM CaCl2，0.5 mM氯化镁2，0.6毫摩尔钠2高性能操作4). 在任何转染实验中，DNA总量保持不变，任何缺陷都用相应的空载体弥补。将转染反应混合物在室温下孵育30分钟。此后，用10 ml RPMI 1640-10%胎牛血清清洗细胞两次，再悬浮在10 ml新鲜生长培养基中，并培养24或48小时。在某些情况下，在制备细胞提取物之前，用抗CD40抗体（G28.5）刺激细胞最后12小时。通过荧光素酶分析系统（Promega Corp.）和光度计（Berthold Analytical Instruments），基本上按照制造商的规范，从细胞提取物中测定荧光素酶活性。在测定pCMVlacZ（1μg）表达的β-半乳糖苷酶活性后，荧光素酶水平正常化，pCMVlacZ包含在所有转染中。如前所述进行β-半乳糖苷酶分析(107)通过使用与测量荧光素酶活性相同的提取物。

Northern印迹分析。

基本上按照制造商的规范，使用RNA隔离器溶液（Genosys）制备总细胞RNA。30微克总RNA样品在1.3%甲醛-淀粉凝胶中进行分级，然后转移到硝化纤维过滤器（BDH）中。反义32按照制造商的说明，通过体外转录（Riboquant Multiprobe RNase protection assay system，Multiprobe hAPO-2 template set；Pharmingen）合成了P标记的核糖探针。在变性聚丙烯酰胺凝胶中对标记的转录物进行大小分级，通过放射自显影术定位探针，切除探针，然后通过压碎和浸泡法在含有0.5 M醋酸铵、10 mM醋酸镁、1 mM EDTA（pH 8.0）和0.1%十二烷基硫酸钠（SDS）的缓冲液中洗脱(107)然后是乙醇沉淀。探针（106将cpm/ml）与6×SSC（1×SSC为0.15 M NaCl加0.015 M柠檬酸钠）、50%甲酰胺、1%十二烷基硫酸钠、0.1%吐温20和100μg大肠杆菌tRNA/ml，在55°C下持续16至24小时。过滤器在室温下在1×SSC-0.1%十二烷基硫酸钠中清洗两次30分钟，然后在暴露于−70°C的X射线胶片之前，在65°C的0.1×SSC-0.1%十二烷基磺酸钠中清洗二次30分钟。

Western Blot分析。

为了检测LMP1，蛋白裂解物在2%SDS、100 mM NaCl、0.01 M Tris-HCl、5%β-巯基乙醇、1 mM EDTA、100μg苯甲基磺酰氟/ml和2μg亮氨酸蛋白酶/ml中煮沸10分钟，并在冰上短暂超声。然后通过在室温下以13000 rpm离心10分钟来澄清裂解产物。5×10蛋白质5细胞通过不连续SDS-5至10%聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，并在硝化纤维过滤器上进行印迹。用抗LMP1 CS 1-4抗体鸡尾酒检测过滤器(105)在4°C下，在Blotto中稀释至1:100（5%脱脂牛奶和0.1%吐温20在Tris缓冲盐水中）过夜。用碱性磷酸酶偶联羊抗鼠免疫球蛋白G（Promega）检测免疫复合物，用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸（BCIP）-硝基蓝四氮唑液体底物（Sigma）观察免疫复合物。

结果

LMP1激活高炉煤气-1EBV-阴性BL-衍生细胞系中的启动子，其机制依赖于转录因子NF-κB。

为了确定LMP1是否可以交易私有化高炉煤气-1启动子，首先生成一个合适的启动子-报告子结构。为此目的，我们从高炉煤气-1基因（相对于转录起始位点从−1374到+81）(123)位于无启动子载体pGL2Basic（Promega）中萤光素酶基因的上游，以产生报告构建体−1374/+81Luc。最初，来自质粒pEFCX的表达载体用于瞬时转染中LMP1和其他效应蛋白的表达。pEFCX表达的重组基因由多肽链延伸因子1α的启动子以NF-κB非依赖的方式驱动(83). 因此，pEFCX-LMP1表达的LMP1水平在调节该转录因子激活的分子存在时预计不会波动。EBV-阴性BL-衍生细胞系DG75和BL41的瞬时转染表明，当使用−1374/+81-Luc作为报告载体时，随着共转染pEFCX-LMP1数量的增加，转染后24小时的荧光素酶活性呈剂量依赖性增加。在本实验和随后的实验中使用的两种细胞系都获得了类似的结果，并且只给出了DG75的结果（图。​（图1A）。1安培). 使用2.5μg pEFCX-LMP1检测到荧光素酶值最大增加8.5倍（BL41为7.8倍）。通过Western blotting评估转染细胞提取物中LMP1的表达水平，正如预期的那样，当使用pEFCX作为共转染质粒时，随着pEFCX-LMP1数量的增加而未检测到LMP1，LMP1表达水平会升高（图。​（图1A）。1安培). LMP1的作用由高炉煤气-1启动子序列，因为LMP1的表达不会影响相应的无启动子载体pGL2Basic（未显示）。这些结果表明LMP1上调高炉煤气-1这些EBV-阴性BL-衍生细胞系中的启动子活性。

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LMP1和PMA交易私有化高炉煤气-1依赖于转录因子NFκB的机制在DG75细胞中启动子；反式激活不需要先前确定的NF-κB结合位点位于相对于转录起始位点的位置−833/−823。（A） 药物的剂量依赖性转录激活高炉煤气-1LMP1启动子。DG75细胞与越来越多的pEFCX或pEFCX-LMP1（效应质粒）和2.5μg−1374/+81-Luc共同转染。在转染后24小时收集细胞并分析荧光素酶活性，然后对其转染效率进行归一化（基于共转染pCMVlacZ报告子测得的β-半乳糖苷酶活性，该报告子包含在所有转染中）。通过与pEFCX共转染获得的荧光素酶值被任意赋值为1.0，激活表示与效应质粒共转染后获得的相对标准化荧光素酶活性，并显示数量。通过Western blotting（如下所示）分析这些转染的选定提取物的LMP1表达。（B） 抑制LMP1介导的高炉煤气-1通过超阻遏物突变型IκBα（IκB-αDN）的过度表达启动子。用2.5μg pEFCX-LMP1或空载体pEFCX和2.5μg−1374/+81-Luc以及不同数量（0、2.5、5.0或10.0μg）的pEFCX-IκBαDN共同转染DG75细胞。在转染后24小时收集细胞，测量荧光素酶值，如上所述进行标准化，并显示为激活(n个-折叠）超过对照组（IκBαDN等于1时为空载体）。通过Western blotting（如下所示）分析这些转染的选定提取物的LMP1表达。（C） PMA激活高炉煤气-1启动子以NF-κB依赖的方式。在存在或不存在10.0μg pEFCX-IκBαDN的情况下，用2.5μg−1374/+81-Luc或3Enh-Luc转染DG75细胞，然后用10−7M PMA或载体对照（0.062%乙醇）。在处理后24小时采集细胞，获得的标准化荧光素酶值以增加的形式呈现(n个-折叠）超过控制值。转染细胞经载体对照处理后获得的值被任意指定为1。（D） LMP1和PMA均未介导高炉煤气-1启动子需要已知的NF-κB结合位点位于高炉煤气-1发起人。用2.5μg pEFCX-LMP1或空载体pEFCX和2.5μg−1374/+81-Luc或其NF-κB突变衍生物−1374/+81（mκB-833）-Luc共同转染DG75细胞。在PMA研究中，用2.5μg−1374/+81-Luc或1374/+81（mκB-833）转染DG75细胞，然后用10−7M PMA或载体对照（0.062%乙醇）转染后18小时。在转染后24小时或处理后24小时（分别为PMA或载体）收集细胞，并检测荧光素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-折叠）控制空载矢量或车辆。

以前的实验中，人类高炉煤气-1该启动子通过NF-κB依赖途径对TNF-α产生反应(123)提示LMP1的反式激活也可能由该转录因子介导。为了直接验证这一假设，将DG75细胞与−1374/+81-Luc和pEFCX-LMP1以及pEFCX-IκBαDN共同转染，后者表达IκB的超阻遏突变形式，其中该蛋白上32和36位的丝氨酸残基被丙氨酸取代。IκBαDN不能再被磷酸化，因此在用NF-κB诱导剂处理细胞时不能被蛋白水解(9). 这种突变体有效地将NF-κB保留在细胞质中，从而通过阻止其转移到细胞核来阻断其作为转录调节器的功能(83). 从这个实验可以看出，IκBαDN的表达有效地抑制了LMP1诱导的高炉煤气-1DG75细胞中的启动子反式激活呈剂量依赖性（图。​（图1B）。1B年). 如转染细胞蛋白提取物中LMP1水平的Western blot分析所示，IκBαDN的抑制作用不是pEFCX-LMP1抑制LMP1表达的结果（图。​（图1B）。1B年). 在BL41细胞中也进行了类似的观察；然而，要实现LMP1对反式激活的完全抑制，需要较低量（5μg）的pEFCXIκBαDN（数据未显示）。这些结果强烈表明高炉煤气-1LMP1的启动子依赖于NF-κB。在DG75中，IκBαDN的过度表达也抑制了高炉煤气-1启动子活性（10.0μg pEFCX-IκBαDN存在时降低30%），表明在该细胞系中，后者可能至少部分依赖NF-κB。在对照转染实验中，使用已知的NF-κB依赖性报告基因结构（3Enh-Luc）监测NF-κ的B激活。在这些情况下，使用DG75和BL41细胞，当该载体与pEFCX-LMP1共转染时，荧光素酶值分别增加4倍和8倍，并且在存在pEFCX-IκBαDN的两种细胞系中观察到有效的剂量依赖性激活抑制（数据未显示）。

用化学试剂佛波醇-12-吡啶酸盐13-醋酸盐（PMA）（一种著名的NF-κB激活剂）处理多种细胞系已被证明上调高炉煤气-1BL细胞系中的mRNA水平(93). 因此，我们研究了当以相同浓度（10−7M） 如前所述，还可以激活高炉煤气-1发起人。用PMA处理转染3Enh-Luc或−1374/+81-Luc的DG75细胞，然后像以前一样从转染细胞提取物中测定荧光素酶活性。在该实验中，PMA处理可使NF-κB活化约3.5倍（图。​（图1C）。1摄氏度). 在高炉煤气-1启动子，PMA处理导致高炉煤气-1启动子活性（图。​（图1C）。1摄氏度). 在这两种情况下，启动子激活被证明是NF-κB依赖性的，因为与pEFCX-IκBαDN共同转染导致荧光素酶值显著降低（图。​（图1C）。1摄氏度). 核因子-κB结合位点高炉煤气-1启动子（相对于转录起始位点位于−833到−823位置的5′-GGGGATTACC-3′）先前已通过定点突变证明对HeLa细胞系中c-Rel的激活至关重要(123). 为了研究NF-κB结合基序是否在LMP1相关的转录激活中发挥作用高炉煤气-1生成的报告结构不同于−1374/+81-Luc，因为它在这个特定的基序[1374/+81（mκB-833）]中携带相同的失活突变。然而，在瞬时转染分析中，可以看出LMP1在DG75细胞中以相似的程度激活了这两种结构上的启动子片段，并且在−833/−823处NF-κB结合基序的消除并没有显著影响启动子活性的基础水平（图。​（图1D），一维)BL41也获得了相同的结果（数据未显示）。此外，PMA处理也激活了突变启动子，激活程度与两种细胞系中未突变启动子的激活程度相同（图。​（图1D）。一维). 这些结果的综合清楚地表明高炉煤气-1在使用的EBV-阴性BL细胞系中，启动子被LMP1反式激活，反式激活是NF-κB依赖性的，并且位于−833/−823位置的NF-kb B结合基序对于LMP1或PMA在该细胞环境中激活启动子不是必需的。

LMP1相关高炉煤气-1启动子激活被A20的过度表达所阻断，并通过涉及TRAF2的机制发生。

A20是一种抗凋亡环指蛋白，与TRAF相互作用，通过取代LMP1-TRAF和LMP1-TRADD复合物中的TRAF和TRADD分子，有效抑制LMP1对NF-κB和JNK的激活(32,34,42). 研究A20的过度表达是否可以抑制高炉煤气-1通过LMP1启动子，与之前一样进行共转染，包括不同数量的A20表达载体（pSFFVA20）。可以看出，A20的表达被有效抑制高炉煤气-1LMP1在DG75细胞中激活启动子，转染5.0和10.0μg pSFFVA20分别导致约80%和94%的抑制（图。​（图2A）。2安培). 当使用3Enh-Luc报告器时，观察到NF-κB活化受到类似程度的抑制（数据未显示）。A20的表达没有改变高炉煤气-1启动子活性或内源性激活NF-κB，表明A20只影响LMP1诱导的信号传导。此外，A20表达不干扰由共转染载体产生的LMP1水平，如通过从转染的细胞群制备的裂解物的蛋白质印迹所评估的（图。​（图2A2安培).

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LMP1相关高炉煤气-1启动子激活被A20的过表达阻断，并通过涉及TRAF2的机制发生。用2.5μg pEFCX-LMP1或pEFCX和2.5μg−1374/+81-Luc与表达A20（0、2.5、5.0或10.0μg pSFFVA20）（A）或TRAF2显性阴性突变体[0、5.0或10.μg pcDNA3-TRAF2Δ（6-86）]（B）的不同数量质粒共同转染DG75细胞。在每种情况下，如前所述，在转染后24小时采集细胞并分析荧光素酶活性和LMP1表达（如下图所示）。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-折叠）。

TRAF2已被证明与LMP1的细胞质尾部结合，是LMP1激活NF-κB的重要介质。TRAF2直接与LMP1的CTAR1结构域结合，并通过适配器蛋白TRADD与CTAR2结合(58,71,103). TRAF2的羧基末端结构域介导TRAF2与LMP1 CTAR1结构域和TRADD结合，而氨基末端环指状结构域参与TRAF家族成员的同源和异源二聚体化，并与细胞凋亡抑制剂（c-IAP）结合，对TRAF2介导NF-κB和JNK的活化至关重要(58,71,103). TRAF2的显性负突变体[TRAF2Δ（6-86）]在N末端区域缺失6到86个氨基酸，已被证明通过LMP1抑制NF-κB和JNK的激活(32). 确定TRAF2是否在调节LMP1相关高炉煤气-1启动子激活，我们在瞬时共转染分析中使用表达TRAF2Δ（6-86）的载体。发现TRAF2Δ（6-86）的共表达显著降低高炉煤气-1在5.0和10μg pcDNA3-TRAF2Δ（6-86）中，LMP1以剂量依赖的方式激活启动子，使LMP1相关的反式激活分别减少了25%和48%（图。​（图2B）。2B型). Western blotting再次表明TRAF2Δ（6-86）的抑制作用不是由于LMP1表达的抑制（图。​（图2B）。2B型). 用3Enh-Luc构建物研究TRAF2Δ（6-86）表达对LMP1介导的NF-κB活化的影响。在本实验中，5μg和10μg pcDNA3-TRAF2Δ（6-86）的共转染分别导致LMP1介导的NF-κB活化降低40%和65%（数据未显示）。在LMP1激活和高炉煤气-1在BL41细胞系转染中，NF-κB的启动子和活化与A20和TRAF2Δ（6-86）（数据未显示）。综上所述，这些结果表明TRAF2参与LMP1介导的高炉煤气-1这些细胞中的启动子。

诱导所需的LMP1信号域的识别高炉煤气-1启动子活性。

识别对介导重要的LMP1信号域高炉煤气-1启动子反式激活，在启动子荧光素酶分析中，使用在CTAR1和CTAR2的关键残基上具有氨基酸取代的表达LMP1分子的质粒与野生型LMP1进行比较分析。因此，LMPAAA在CTAR1-TRAF相互作用域（P204x季度206x吨208→ AxAxA），其已被证明通过该结构域阻断NF-κB的激活(26,32,34)；LMPG在CTAR2中包含一个单点突变，使得384位的酪氨酸残基被甘氨酸取代，这种修饰通过抑制TRADD结合有效抑制NF-κB和AP-1的激活(34,40)；LMPAAAG含有LMPAAA和LMPG的修饰，不能激活NF-κB或AP-1(8,39). Both transactivation of the高炉煤气-1通过分别用−1374/+81-Luc和3Enh-Luc构建体共转染相应的基于pSG5的效应质粒，研究野生型和信号缺陷LMP1蛋白对启动子和NF-κB的激活。可以看出，野生型LMP1的表达激活了高炉煤气-1并将DG75细胞中的NF-κB应答启动子分别控制约6.4倍和3.6倍（图。​（图3A）。3A级). 相比之下，与野生型LMP1获得的值相比，LMPAAA和LMPG对这两个启动子的激活分别达到约75%和20%的水平。LMPAAAG有效地不能激活任一启动子（图。​（图3A）。3A级). 观察到的效果不是由于转染期间表达的野生型和突变型LMP1蛋白水平的差异所致（图。​（图3B）。3B公司). 这些结果表明，LMP1的CTAR1和CTAR2结构域可以独立地促进高炉煤气-1启动子激活，CTAR2是这方面的主要贡献者。此外，这两个域都需要最大限度地激活高炉煤气-1NF-κB的启动子和活化。LMP1各结构域对诱导的相对贡献高炉煤气-1启动子活性与NF-κB活化密切相关，再次表明后者是介导LMP1对高炉煤气-1.

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野生型和功能突变的LMP1分子对高炉煤气-1启动子活性。（A） 用2.5μg的pSG5、pSG5-LMP1（表达野生型LMP1）、pSG5-LMPAAA（表达含有非功能CTAR1结构域的LMP1和2.5μg−1374/+81-Luc或3Enh-Luc。在转染后24小时收集细胞并分析荧光素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-折叠），如前所述。（B） DG75细胞瞬时转染实验中野生型和突变LMP1分子表达水平的Western blot分析；从面板A中所示的转染制备蛋白裂解物，并按照与该图中所示相应表达载体相同的顺序加载（通道1至5）（仅显示与−1374/+81-Luc共转染的细胞提取物）。LMP1蛋白及其信号缺失衍生物的示意图如下所示。细胞质信号结构域CTAR1/TES-1和CTAR2/TES-2中的突变以X表示，分别标记为1和2。

CD40受体激活导致高炉煤气-1mRNA水平和NF-κB依赖性增加高炉煤气-1BL-衍生细胞系中的启动子活性。

CD40与BL衍生细胞系的结合先前已被证明可导致高炉煤气-1mRNA水平(82)，但所涉及的机制尚未得到调查。在这里，Northern blot分析显示，用激动性抗CD40抗体G28.5治疗Mutu I（EBV阳性潜伏期1型）和BL41-B95.8（EBV正潜伏期3型）细胞系(20)导致增加高炉煤气-1mRNA水平（图。​（图4A）。4A级). 这两种细胞株都表达CD40（数据未显示），在这两种情况下，这种效应都是短暂的，在8小时内可检测到显著上调，然后在24小时内恢复到未经处理的细胞中的水平。这种效应的短暂性与其他地方的观察结果一致(82). 相反，用G28.5处理BL细胞系Rael并没有导致可检测到的高炉煤气-1mRNA（图。​（图4A）。4A级). 尽管Rael表达CD40，但其他研究表明，它对CD40介导的几种基因表达效应没有反应(54). 更详细的上调动力学分析高炉煤气-1用DG75细胞进行CD40连接的mRNA（图。​（图4B）。4B类). 在这个实验中，可以看出高炉煤气-1抗CD40抗体治疗后4h检测mRNA。该水平维持至少12小时，然后在24小时内降至接近基础水平。

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CD40受体激活导致高炉煤气-1mRNA水平和NF-κB依赖性增加高炉煤气-1BL-衍生细胞系中的启动子活性。Rael、Mutu I、BL41-B95.8（A）和DG75（B）细胞未经处理，或用CD40激动性抗体G28.5处理，作为1:4000的腹水稀释液（Rael、Mutu I和BL41-B195.8）或1μg纯化抗体（DG75）/ml的浓度。在0、8和24小时从细胞中制备总RNA样品或在处理后0、4、8、12和24小时（DG75），用反义蛋白进行Northern blot分析高炉煤气-1核糖探针（面板A和B的上部面板）。然后依次剥离印迹，并用反义核糖探针将其与甘油醛-3-磷酸脱氢酶（GAPDH）mRNA（面板A和B的下面板）重新杂交。（C） LMP1和CD40协同上调高炉煤气-1DG75tTA-LMP1细胞中的mRNA。未诱导的DG75tTA-LMP1细胞或诱导表达LMP1的DG75t TA-LMP2细胞（去除四环素后36小时）未经处理或用1μg抗CD40抗体G28.5/ml刺激。用G28.5刺激后0、4和8小时从细胞中提取的总RNA用于Northern blot分析，并用反义高炉煤气-1核糖探针（上图）。依次剥离印迹，并用GAPDH核糖探针（下面板）重制。（D） 超阻遏物IκBα突变体的表达抑制高炉煤气-1在LMP1存在（+）或不存在（-）的情况下激活CD40后，启动子上调。在不存在或存在10.0μg pEFCX-IκBαDN的情况下，用2.5μg pEFCX-LMP1或pEFCX和2.5μg−1374/+81 Luc共转染DG75细胞。在转染后36 h，细胞要么未经处理，要么在采集前用1μg G28.5/ml处理12 h，以测量荧光素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-折叠）超过对照组（IκBαDN不表达或G28.5不治疗的空载体等于1）。

分析LMP1和CD40双信号转导对高炉煤气-1mRNA水平，我们使用稳定的DG75转染剂，其中LMP1的表达可由四环素（DG75tTA-LMP1）调节(38). Northern印迹法用于监测高炉煤气-1在G28.5存在或不存在的情况下，诱导前和诱导后36小时DG75tTA-LMP1细胞中的mRNA水平（图。​（图4C）。4摄氏度). 正如预期的那样，LMP1的诱导导致高炉煤气-1mRNA。小幅但持续的进一步增长高炉煤气-1在CD40刺激LMP1表达细胞后4和8小时可检测到mRNA水平。CD40结扎对高炉煤气-1在没有LMP1的情况下，mRNA水平可能反映了这些细胞中CD40表达水平较低（甚至低于未转染的DG75细胞），在LMP1诱导后CD40表达显著升高(38; 数据也未显示）。为了确定结扎CD40是否导致高炉煤气-1启动子活性，转染−1374/+81-Luc的DG75细胞在转染后36 h用G28.5处理12 h，荧光素酶值与未转染细胞的值进行比较。在这个实验中，可以看出（i）CD40的刺激导致高炉煤气-1启动子活性，（ii）LMP1的反式激活是3.4倍，（iii）在LMP1存在下CD40的激活导致整体4.8倍的增加，（iv）IκBαDN的表达可以抑制CD40介导的启动子激活，表明该途径是NF-κB依赖的（图。​（图4D）。4D（四维）). 在这种情况下，来自CD40和LMP1的双重信号导致的激活程度大于每个单独信号提供的激活程度，但小于两个信号的叠加效应的预期激活程度。这些发现表明，从CD40和LMP1启动的信号通路在驱动高炉煤气-1发起人。然而，CD40活化的部分作用可能是由于LMP1转染细胞中CD40的表面表达增加。此外，不能排除LMP1和CD40的双重作用（也被认为是NF-κB依赖性的）可能是NF-kb B介导的上调CD40水平的过程中的间接作用的结果(25). 本实验中LMP1激活启动子的程度较低，可能是由于报告人检测用转染细胞的采集时间不同所致(106,119).

210亿英镑高炉煤气-1启动子片段（−129/+81）介导LMP1介导NF-κB依赖性反式激活。

为了鉴定介导LMP1反式激活的DNA序列元件，我们生成了一系列报告结构，其中从LMP1的5′端引入了渐进缺失高炉煤气-1−1374/+81-Luc中的启动子序列（图。​（图5A）。5A级). 与之前一样，通过与pEFCX-LMP1和DG75和BL41细胞系的共转染来研究LMP1对这些截短启动子片段的反式作用。可以看出，在DG75细胞中，LMP1以8.2倍的因子反式激活−1374/+81 Luc，并且启动子片段−1240/+81、−367/+81 Luc和−129/+81 Luc保留了相当大的反式激活（分别为6.5倍、6.2倍和5.6倍），当仅保留−57/+81启动子序列时，进一步降低到3.3倍（图。​（图5B）。5亿). 在−1240/+81-Luc和−367/+81-Lug中观察到类似的反式激活值，这再次表明先前确定的位于−833/−823位置的NF-κB结合基序在该细胞环境中LMP1相关启动子的激活中没有发挥重要作用。观察到，−57/+81-Luc仍对LMP1保持相当程度的反应性（但显著低于−129/+81-Lug），这表明启动子的−129至−57区域可能包含有助于LMP1激活但对其不是必需的DNA序列元素。也可以看出，IκBαDN的共表达以剂量依赖的方式有效地抑制了LMP1诱导的−129/+81-Luc的反式激活（图。​（图5C）5摄氏度)（与之前一样，在每次转染中，pEFCX-LMP1表达的LMP1水平保持不变）（数据未显示）。使用−129/+81-Luc结构的PMA也可以观察到显著的NF-κB依赖性反应（使用−1374/+81-Lug观察到的活性的68%），并且在所有情况下，使用BL41细胞时都可以观察到类似的结果（数据未显示）。因此可以得出结论，来自高炉煤气-1转录调控区包含DNA序列元件，在这些BL-衍生细胞系中，通过LMP1介导该基因的高比例NF-κB依赖性激活。

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210-bp片段（−129/+81）高炉煤气-1启动子被LMP1以NF-κB依赖的方式反式激活。（A） 的示意图高炉煤气-1启动子-报告子结构，其中启动子序列从5′端逐渐删除（5′端的坐标在每个结构的左侧给出）。它们在转录起始位点（由弯曲箭头指定）下游共有一个共同的3′末端81 bp，在那里它们与荧光素酶基因（LUC）结合。先前确定的NF-κB位点在位置−833的位置在质粒−1374/+81-Luc上显示为黑盒。（B） DG75细胞转染2.5μg的pEFCX-LMP1或pEFCX以及2.5μg个体高炉煤气面板A中显示的启动子荧光素酶报告子结构。在转染后24小时采集细胞，并按照前面所述检测荧光素素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-fold）相对于与对照pEFCX共转染时每个报告构建体获得的相应值。（C） LMP1介导的高炉煤气-1在DG75细胞中，启动子被一个超阻遏物IκBα突变体的表达所抑制。将DG75细胞与2.5μg pEFCX-LMP1或pEFCX和2.5μg−129/+81-Luc以及指示量的pEFCX-IκBαDN共同转染。在转染后24小时收集细胞并分析荧光素酶活性。正常化荧光素酶值作为激活值给出(n个-折叠）（在IκBαDN不表达的情况下为空载体）。

NF-κB样和AP-1-样结合位点的鉴定高炉煤气-1通过LMP1介导反式激活的启动子。

使用转录元件搜索软件，我们分析了高炉煤气-1候选序列元件的启动子，可以结合已知在LMP1介导的基因表达调控中发挥作用的转录因子。在转录起始位点的5′区鉴定出一个NF-κB样结合位点（−52至−43处的5′-AGAATTCCA-3′）和两个AP-1样结合位点（−104至−94处的5′-CATGACATGAA-3′和−74至−64处的5′-AGTGAACTAGGAA-3′）（图。​（图6A）。6A级). 然后通过定点突变将碱基替换引入报告质粒−129/+81-Luc中每个基序的核心，以消除相应转录因子的潜在结合（图。​（图6A）。6A级). 然后用DG75细胞对这些构建物进行pSG5或pSG5-LMP1的瞬时转染。可以看出，NF-κB样结合位点的突变导致LMP1几乎完全失去反式激活（图。​（图6B），6亿)，当将相同的突变引入−1374/+81-Luc的启动子序列时，再现了这种效应（图。​（图6C）。6摄氏度). 在−104/−94处AP-1样结合位点的突变不会损害反式激活（实际上可以看到略有增加），而在−74/−64处位点的消除导致在LMP1存在下启动子活性显著降低（降低34%）（图。​（图6B）。6亿). 后一结果与删除−129至−57区域后LMP1相关的反式激活类似减少的观察结果相关（图。​（图5B，5亿，比较−57/+81-Luc和−129/+81-Lug）。

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NF-κB样和AP1-样结合位点的鉴定高炉煤气-1通过LMP1介导反式激活的启动子。（A） 的−129到+1区域的示意图高炉煤气-1启动子显示相关转录因子候选结合位点的相对位置和序列。通过向定点突变显示的每个序列引入碱基变化（下划线），进一步构建了三个报告结构，从而依次消除每个候选位点。下面给出了携带个体突变的相应载体的名称。在B组和C组中，将1μg pSG-LMP1或pSG5与1μg个体转染DG75细胞高炉煤气启动子-荧光素酶报告子结构显示在每个图下方。报告结构中的NF-κB样基序（−52/−43）发生了与面板A中所示相同的序列变化，其中最长的基序为高炉煤气-1启动子序列可用，因此产生−1374/+81mκB（−52）。在转染后24小时收集细胞，并按前述方法检测荧光素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-fold）相对于与对照pEFCX共转染时每个报告构建体获得的相应值。

要确定高炉煤气-1启动子可以赋予异源启动子LMP1响应性，−129/+1序列的部分在荧光素酶报告子结构pGa50.7中最小β-珠蛋白启动子的上游亚克隆（图。​（图7A）第7页) (81). 将这些报告质粒与pSG5或pSG5-LMP1瞬时共转染DG75细胞，实验结果如图所示。​图7B。7亿可以看出，当基础载体（pGa50.7）与pSG5-LMP1共转染时，荧光素酶值持续增加五倍，但当−129/+1序列与最小启动子连接时，该值增加了8倍[图。​[图7B，7亿，比较pGa50-7和pGa（−129/+1）]。从3′端最多删除35个bp高炉煤气-1该序列仍然保留NF-κB样和AP-1样结合位点，并没有导致LMP1相关反式激活的任何减少[图。​[图7B，7亿，pGa（−129/−26）和pGa。还可以看出，其中−129/−34序列以相反方向插入的结构[pGa（−34/−129）]被LMP1反式激活的效率至少与pGa的反式激活效率一样。然而，在−52/−43处NF-κB样结合位点的缺失或突变导致LMP1相关反式激活的完全丧失[pGa（−129/−54）、pGa和pGa）]。我们得出结论高炉煤气-1启动子作为LMP1依赖的转录增强子发挥作用，位于−52到−43的NF-κB样结合位点对这种作用至关重要。

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位于−52/−43的NF-κB样结合位点对于在异源最小启动子上赋予LMP1应答至关重要。（A） 的示意图卢克在子克隆了高炉煤气-1pGa50.7中β-珠蛋白最小启动子上游的启动子（带弯曲箭头的棋盘格）。每个报告结构的名称包括高炉煤气-1序列。引入NF-κB样位点的突变用X表示。（B）DG75细胞转染1μg pSG-LMP1或pSG5以及1μg荧光素酶报告子结构，如每个图下方所示。在转染后24小时收集细胞，并按前述方法检测荧光素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-fold）相对于与对照pSG5共转染时每个报告构建物获得的相应值。

在−52/−43处NF-κB样结合位点的突变减少高炉煤气-1启动子转录激活与CD40受体结合。

然后，我们研究了NF-κB样结合位点是否位于高炉煤气-1启动子在介导CD40的反式激活中起作用。在这些实验中，瞬时转染的DG75细胞与稳定表达重组人CD40配体（CD40lig-L细胞）的小鼠成纤维细胞L细胞系共培养，以激活CD40信号(43)或人类CD32/Fc-gRII（CD32-L细胞）表达细胞系作为对照(98). 可以看出，当3Enh-Luc、pGa（−129/−34）和−129/+81-Luc载体用作报告者时，CD40受体与转染DG75细胞的结合导致荧光素酶值分别增加约3.4-、2.7-和2.0倍（图。​（图8）。8). pGa（−129/−34）和−129/+81-Luc中NF-κB样结合位点的突变导致CD40受体与CD40配体结合时记录的启动子活性水平分别降低66%±18%和46%±5%（图。​（图8）。8). 这项实验表明，NF-κB样结合位点在−52/−43在CD40介导的细胞活化中起关键作用高炉煤气-1发起人。这也证实了图中的发现。​图4D，4D（四维），其中显示高炉煤气-1启动子上调由激动性抗CD40抗体触发。

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在−52/−43处NF-κB样结合位点的突变减少高炉煤气-1启动子转录激活与CD40受体结合。用2μg报告体转染DG75细胞（如图所示），然后分别在表达人CD40配体和人CD32/Fc-gRII的CD40lig-L细胞或CD32-L细胞上培养24小时。然后采集DG75细胞并分析荧光素酶活性，并将其归一化为转染效率（基于共转染pCMVlacZ报告子测得的β-半乳糖苷酶活性，该报告子包含在所有转染中）。与CD40lig-L细胞转染和共培养后，3Enh-Luc、pGa（−129/−34）和−129/+81-Luc的绝对荧光素酶值设置为100%。分别给出了pGa（−129/−34mκB）和−129/+81mκB相对于pGa的百分比值（−29/−34）和−129/+81。

位于−52/−43的NF-κB样结合位点介导NF-κ的B亚单位蛋白p65而非c-Rel的反式激活。

NF-κB的亚单位组成不仅可以极大地影响其与特定DNA序列基序结合的能力，还可以影响启动子反式激活的程度(99). 直接研究Rel家族成员驱动转录的能力高炉煤气-1因此，用表达单个NF-κB亚单位蛋白的载体与DG75细胞进行瞬时共转染。可以看出，当与p65表达载体共转染时，pGa（−129/−34）报告子被反式激活约3.0倍（超过pGa50-7）（图。​（图9A）9安)当NF-κB样结合位点在−52/−43突变时，反式激活被完全消除[图。​[图9A，9安，pGa（−129/−34mκB）]。同一报告者与c-Rel或p50表达载体共转染未能显著反式私有pGa（−129/−34）（图。​（图9A）。9安). 还可以看出，当p65/p50或p65/c-Rel表达载体组合与相同的报告构建物共同转染时，缺乏任何协同效应（图。​（图9A）。9安). 与−129/+81-Luc报告者的结果类似，单独联合转染p65效应质粒可显著增加（三倍）高炉煤气-1启动子活性和NF-κB样结合位点的突变再次导致p65的反式激活缺失（图。​（图9B）。9亿). 这些实验表明p65直接反式激活高炉煤气-1启动子，并且在−52/−43处的NF-κB样结合位点对于这种作用以及在DG75细胞中赋予p65对异源最小启动子的响应性都是必不可少的。

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NF-κB样结合位点位于−52/−43，通过NF-κ的B亚单位蛋白p65而非c-Rel介导反式激活。（A和B）DG75细胞转染2μg表达各种NF-κ）B亚单位蛋白质的载体以及每个图下方所示的1μg荧光素酶报告结构。在转染后48小时收获细胞，并如前所述测定荧光素酶活性。正常化荧光素酶值表示为激活(n个-fold）相对于与控制载体pcDNA3.1共转染时每个报告构建物获得的相应值。

讨论

已有研究表明，在EBV阴性BL细胞系中LMP1的表达与细胞因子水平的显著增加相一致高炉煤气-1信使核糖核酸(30). 这里，我们首次显示LMP1激活高炉煤气-1我们提供的证据表明NF-κB在这一过程中起着关键作用。NF-κB作用的含义与其他研究一致，其中增加了高炉煤气-1mRNA水平已被证明是对脂多糖、TNF-α或足叶乙甙等药物的反应，所有这些药物都会导致该转录因子的激活(60,117,123). NF-κB抑制与减少高炉煤气-1LCL中的mRNA水平(11). 此外，NF-κB亚单位蛋白c-Rel和p65（但不是p50）的异位表达也被证明独立上调高炉煤气-1HeLa细胞中的mRNA水平，以及TNF-α的情况下，这被证明是由于高炉煤气-1启动子活性(123). 在同一研究中，c-Rel反式激活了高炉煤气-1启动子通过与已知转录起始位点相关的−833/−823位置的一致NF-κB结合位点的相互作用。在其他地方，小鼠A1（小鼠高炉煤气-1同系物）被证明是对原代B细胞有丝分裂原刺激以c-Rel依赖方式诱导的(49).

在这项研究中，NF-κB在调节高炉煤气-1LMP1的启动子活性基于几个观察结果。首先，超阻遏物IκBα突变体的共表达抑制了反式激活。第二，TRAF2介导的NF-κB活化的抑制通过显性负TRAF2分子的共表达或TRAF2结合锌指蛋白A20的过度表达来削弱LMP1的反式激活。第三，用PMA（许多细胞类型中NF-κB的一种众所周知的激活剂）治疗也会刺激高炉煤气-1启动子活性。第四，NF-κB亚单位蛋白p65的表达可激活高炉煤气-1发起人。在所有情况下，当与NF-κB反应性报告构建物并行监测时，这些分子的预期抑制或刺激作用都得到了反映。

TRAF2Δ（6-86）和A20引起的反式激活缺失强烈暗示TRAF2是参与激活高炉煤气-1由LMP1编制。然而，在这两种药物中，A20在抑制两种药物的LMP1激活方面更有效高炉煤气-1启动子和NF-κB。在涉及LMP1和TNF-α的研究中，这些TRAF2抑制剂与其他启动子也有类似的发现(32,34,58,71,100). 在LMP1的情况下，TRAF2Δ（6-86）仅部分阻断CTAR2（40%）对NF-κB的激活，而几乎完全阻断CTAR1介导的激活（>75%）(71). 对这些观察结果的一种解释是，尽管TRAF2是参与激活高炉煤气-1通过LMP1，其他CTAR1/2相关蛋白（如其他TRAF）的额外贡献也可能参与(26). 在这方面，受体相互作用蛋白也被证明与CTAR2直接相互作用，但不介导NF-κB的激活，因此不可能被纳入本例(63). 或者，有可能TRAF2与其他蛋白质结合在一个稳定的复合物中，或者表达的TRAF2Δ（6-86）数量不足，或者转染后的潜伏期不足以使突变株有效取代内源性野生型TRAF2。事实上，已经鉴定出一些TRAF2相互作用蛋白，如TRAF1、TANK/I-TRAF和c-IAP，它们可能会影响TRAF2杂合物的稳定性和信号传递潜力（有关综述，请参阅参考文献36). 与这种可能性相一致的观察结果是，虽然CTAR1可以直接结合TRAF2，但CTAR2通过TRADD间接与TRAF2结合(63). 因此，TRAF2与LMP1这两个结构域结合的化学计量比的差异可能解释了TRAF2Δ（6-86）抑制主要信号结构域CTAR2（相对于CTAR1）TRAF2介导的信号无效。A20是一种锌指蛋白，由LMP1以NF-κB依赖的方式诱导表达，可以抑制LMP1诱导的NF-κ的B和JNK的激活，从而作用于负反馈环以控制LMP1信号。这种控制可能很重要，因为LMP1的过度表达会对细胞产生毒性作用(42,50,86). 虽然最初认为A20的活性取决于其与TRAF2的相互作用(34)更详细的研究表明，A20可以作为其他TRAF和TRADD活性的混杂抑制剂(42). 在这种情况下，本研究中的数据并不排除其他LMP1相互作用的信号分子在介导细胞活化中的额外作用高炉煤气-1发起人。

一些研究表明，CTAR1和CTAR2可以独立地通过LMP1介导NF-κB的活化；然而，这些结构域对NF-κB总活化的贡献程度因细胞系而异(40,61,92). 总的来说，CTAR2被发现是比CTAR1更强的NF-κB激活剂。LMP1对A20表达的NF-κB依赖性上调同时映射到CTAR1和CTAR2结构域，每个结构域对此效应的贡献与这两个结构域对NFκB的相对激活程度相关(89,90). 第三个可能的激活域CTAR3映射到CTAR1和CTAR2之间的区域（残基275到307），已被证明可以介导JAK3的激活(45). 在这项研究中，我们使用了来自CTAR1（LMPAAA）或CTAR2（LMPG）或这两个结构域共同（LMPAAAG）的信号缺陷的LMP1突变体，以表明这两个域都是最大程度激活高炉煤气-1EBV-阴性BL-衍生细胞系中的启动子。LMPAAAG已经被证明是一种显性负突变体，可以通过野生型LMP1有效抑制NF-κB、JAK3和Jun转录活性的激活(8). 这种突变通过与野生型LMP1相互作用并干扰其结合TRAF2的能力发挥作用。同一异齐聚物中不同LMP1分子上CTAR1和CTAR2结构域之间的合作要求可能是LMPAAAG高效抑制LMP1介导信号的基础。在这方面，可能只需要寡聚物复合物中的一个LMPAAAG分子（至少是三聚体）来改变复合物的信号(39,40). 与这些发现一致，我们观察到LMPAAAG可以有效抑制野生型LMP1介导的高炉煤气-1启动子和NF-κB（数据未显示）。

观察到CTAR1和CTAR2的双重突变完全消除了LMP1介导的高炉煤气-1启动子并不一定排除CTAR3（或JAK3）的作用，因为CTAR3的功能可能依赖于CTAR1和/或CTAR2(8). CTAR1和CTAR2之间存在协同作用，这提醒人们不要过度解读CTAR1或CTAR2无功能突变体获得的数据，尤其是含有大量缺失的突变体，这些缺失可能会对CTAR1与CTAR2的物理协同产生不利影响(26,108).

B细胞中CD40信号的一个重要方面是其控制凋亡的能力。分离的生发中心细胞在培养中自发发生凋亡，当用抗CD40抗体或CD40配体治疗时，能够存活较长时间(4,72). 此外，已知CD40可以从表面IgM和Fas介导的凋亡中拯救未成熟B细胞和成熟B细胞(47). 一些研究表明，CD40的抗凋亡功能是通过上调bcl公司-x升和A20型(82,109,113). 本研究中的结果支持添加高炉煤气-1添加到此列表中。我们发现Rael细胞没有增加高炉煤气-1mRNA水平对CD40激活的反应与其他人的发现一致，因为这种潜伏期1型BL-衍生细胞系在其他参数方面对CD40活化也无反应(54). 据报道，CD40的激活与高炉煤气-1B淋巴瘤衍生细胞系的mRNA水平(22,82). 在这里，我们证实了这些发现，并进一步表明，当通过与配体结合或通过与抗CD40抗体交联触发CD40受体的信号传导时，会导致反式激活高炉煤气-1NF-κB依赖途径启动子。

如果LMP1和CD40利用不同的信号通路进行私有化高炉煤气-1促进剂，那么至少预期会有加性效应。这两种膜分子的信号传递的效应小于加性效应，但大于个体效应，这一发现可以解释为LMP1和CD40共享同一信号通路的成分。据报道，这两种膜蛋白在上调细胞表面分子（如B7.1和IgM）以及诱导小鼠B细胞系分泌IL-6方面以加性或协同方式协同作用(10). 然而，尽管CD40和LMP1可以单独诱导ICAM-1和LFA-1的表达，但在该研究中没有明显的协同作用。在BL-衍生细胞系中，来自CD40和LMP1的双重信号在瞬时转染试验中对NF-κB报告基因构建的诱导没有协同作用(39). 因此，CD40和LMP1在调节基因表达方面的合作可能不是一个全球现象。在mRNA水平上，LMP1可以上调BL-衍生细胞系中CD40的表达，这一事实使情况更加复杂。此外，已经表明高炉煤气-1mRNA在具有潜伏期第3组表型的BL细胞系中更稳定，这种作用至少部分由LMP1介导(30). 然而，我们随后的半衰期研究表明，在用G28.5抗体处理EBV阴性BL细胞系BJAB后，没有证据表明该转录物的稳定性增加（数据未显示）。该细胞系可检测到高炉煤气-1在没有CD40激活的情况下转录。这一结果有些令人惊讶，因为信使核糖核酸的稳定作用通常与对调节基因表达的信号表现出快速反应的基因有关(14). 然而，CD40激活对高炉煤气-1mRNA的稳定性可能是该细胞系所特有的。

我们首次证明了高炉煤气-1在EBV-阴性BL-衍生细胞系中，启动子可以作为LMP1依赖的转录增强子发挥作用。此外，我们已经证明LMP1对该增强子的反式激活是NF-κB依赖性的。随后的缺失和突变分析得出的结论是，位于−52至−43位置的新型NF-κB样结合位点对LMP1的反式激活至关重要，并且还暗示附近AP-1样结合位点（−74/−64）的重要作用。1.4-kb背景下NF-κB样结合位点的突变高炉煤气-1启动子片段导致LMP1几乎完全失去反式激活。经典NF-κB（p65/p50）结合序列5′-GGGRNNYYCC-3′，而RelA/cRel二聚体结合序列5’-HGGARNYCC-3’（H表示A、C或T；R表示嘌呤[A或G]；Y表示嘧啶[T或C]）(6). κB样位点位于高炉煤气-1启动子在核苷酸位置3和2分别与p65/p50和p65/c-Rel共识结合位点不同。在一些凋亡相关基因的启动子中发现了与共识不同的NF-κB样位点，如bcl公司-x个,c（c）-IAP1公司,c（c）-IAP2号机组、和鼠标A1类以及细胞因子基因，如伊利诺伊州-8，这些位点在启动子激活中的功能已经在其中的几个案例中得到证实(15,49,57,94). 值得注意的是高炉煤气-1启动子与IL-2启动子中的CD28应答κB位点100%互补(18,19,115)而且c-Rel和p65都被证明在介导这种反应中发挥作用(44).

在电泳迁移率变化分析（EMSA）中，我们无法检测NF-κB亚单位蛋白与NF-κ子B样结合位点在−52/−43处的相互作用。然而，在对照实验中，当含有来自Ig（κ）轻链基因的κB增强子元件的探针与DG75细胞的核蛋白提取物孵育时，可检测到含有p65的复合物（未显示EMSA数据）。证实了p65的存在，因为核提取物与抗p65抗体的预孵育导致特定DNA-蛋白复合物的超移。这一发现与已知在该细胞环境中存在的活化NF-κB的高组成水平相一致(61,106). 当使用DG75-tTA-LMP1的核蛋白提取物时，LMP1的诱导导致这两种p65复合物的水平增加，而没有形成任何新的复合物。当各种DNA片段（大小从14 bp到完整的−129/+81片段）包含高炉煤气-1使用−52/−43序列基序作为探针，然而，在LMP1诱导下，DNA蛋白复合物形成的剖面和强度均未发生改变。如果NF-κB亚单位在体内确实与该基序结合，那么我们在体外检测不到结合可能是由于低亲和力相互作用的结果，因为它不是一个一致的NFκB结合位点。LMP1相关上调可能是通过弱结合p65复合物的磷酸化发生的。在这方面，IL-1（TNFR超家族成员）已被证明通过磷酸肌醇-3-羟基激酶Akt依赖性途径诱导p65的反式激活结构域磷酸化，从而刺激p65的反式激活潜力(85,110)最近发现LMP1激活了后者(24). 或者，NF-κB相关的高炉煤气-1DG75和BL41中的启动子可能是间接的，由转录因子介导，该转录因子由NF-κB诱导或激活，并且在使用的EMSA条件下无法结合。

一个唯一的NF-κB DNA结合基序（−833/−823）先前与调节高炉煤气-1上皮细胞系HeLa中的启动子(123). 最近，染色质免疫沉淀分析表明，c-Rel和p50（而非p65）与该位点的体内相互作用促进了PMA-离子粘蛋白处理的Jurkat T细胞中增强子样复合物中c/EBPβ和AP-1的协同结合(31). 我们观察到，在DG75或BL41细胞的情况下，通过缺失或突变去除该位点并不影响LMP1相关的激活高炉煤气-1发起人。虽然很明显LMP1以细胞类型依赖的方式激活NF-κB亚单位蛋白的不同亚群(16,55,96)已知c-Rel在淋巴细胞细胞环境中被LMP1激活，包括DG75细胞(16,83). 除了对LMP1无反应外，我们还观察到NF-κB结合位点在调节高炉煤气-1EBV-阴性BL-衍生细胞系中的PMA或p65。这一点，再加上c-Rel未能通过−52/−43位点激活荧光素酶表达，可能表明p65，而不是c-Rel，是参与调节高炉煤气-1EBV阴性BL细胞系中启动子对LMP1的反应。因此，LMP1未能通过−833/−823站点进行私有交易，可能是因为其与p65的亲和力较低。然而，在EBV-阴性BL-衍生细胞系中，接近该位点也可能被其附近的淋巴细胞特异性核蛋白结合所阻断。

LMP1相关信号也激活JNK通路，导致转录因子AP1的诱导。我们已经证明，位于−74到−64的AP1样结合位点也在LMP1介导的高炉煤气-1发起人。然而，在这种情况下，该序列基序的贡献取决于位于−52/−43的NF-κB样结合位点，因为任何缺乏后者的启动子片段都不会对LMP1产生反应。研究还表明，有丝分裂原活化蛋白激酶p38和NF-κB通过共同调节其启动子序列，对某些LMP-1诱导的基因如IL-6、IL-8和IL-10的反式激活起作用(33,116). 然而，在初步实验中，一种公认的p38激活特异性抑制剂（SB203580）(112)不影响高炉煤气-1DG75细胞中LMP1的启动子（结果未显示）。

在淋巴滤泡中高炉煤气-1在B细胞增殖和分化的生发中心检测到转录物(66). CD40激活是挽救生发中心B细胞自发性凋亡所必需的，长寿B细胞的区别在于其高表达高炉煤气-1(111). 在这方面，Bfl-1可能被视为未成熟外周血B细胞命运的关键决定因素。强烈的诱导高炉煤气-1内皮细胞、白血病细胞和造血细胞中促炎细胞因子的转录物与保护它们免受凋亡消退的作用一致(17,67,68,84,93). 与NF-κB在这一过程中的作用一致的是组成型的减少高炉煤气-1c-Rel衍生的B细胞系中mRNA水平−/−老鼠(49). LMP1通过上调细胞的抗凋亡成员的表达来提供细胞存活信号的能力bcl公司-2蛋白质家族，包括高炉煤气-1从外周血记忆B细胞中EBV持续存在的机制来看，这是非常重要的。在体内，EBV阳性扁桃体记忆B细胞表达一种限制型的潜在基因转录物，类似于EBV相关肿瘤中检测到的潜在基因表达模式(三). LMP1和LMP2A的作用提供记忆B细胞长期生存所需的替代T细胞帮助和B细胞受体信号(12). 由于BL株表现出与生发中心B细胞相似的表型特征，并且Bfl-1先前被证明与腺病毒E1A蛋白协同诱导细胞转化(28,29)NF-κB依赖性激活高炉煤气-1LMP1可能是EBV感染的B细胞凋亡拯救的关键事件，也是LMP1在肿瘤发生中发挥作用的重要途径。

致谢

我们感谢以下质粒的馈赠：来自P.Brodin的pEFCX、pEFCX-LMP1和pEFCX-IkBαDN；来自L.Young和A.Eliopoulos的pcDNA3TRAF2Δ（6-86）和pSFFVA20。抗CD40单克隆抗体G28.5是E.Clark慷慨赠送的。我们感谢P.Garrone为我们提供的CD40lig-L和CD32-L细胞系。我们感谢P.Cahill、K.Fitzgerald和P.Brennan的有益讨论和建议。

这项工作得到了健康研究委员会（HRB；爱尔兰都柏林）（D.W.）的研究资助。我们还感谢美国国立卫生研究院拨款CA83937（C.G.）的支持。B.N.D.得到了爱尔兰企业组织的博士后奖学金的支持。

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文章来自病毒学杂志由以下人员提供美国微生物学会（ASM）