人类副流感病毒1型（HPIV1）是一种非片段、单链、负义RNA病毒，是副粘病毒亚科亚科副粘病毒科HPIV 2、3、4A和4B型（分别为HPIV2、HPIV3、HPIV4A和HPIV4B）也是其成员的家族(三). HPIV1及其动物对应物，仙台病毒和HPIV3及其动物对应物牛PIV3在呼吸道病毒属。在婴幼儿中，HPIV1、HPIV2和HPIV3会导致轻度呼吸道疾病，包括鼻炎、咽炎和中耳炎，以及更严重的疾病，如臀部、细支气管炎和肺炎(三,6,12,13,19,25). HPIV1、HPIV2和HPIV3已被确定为致病因子，分别导致6.0%、3.2%和11.5%的婴幼儿呼吸道疾病住院(三). 他们总共占了所有呼吸道疾病患儿住院人数的近五分之一。HPIV也越来越被认为是成人和免疫缺陷患者呼吸道疾病的病因(1,5,9,14,17,18).
目前还没有获得许可的疫苗可用于任何HPIV，我们正在进行研究，以开发用于鼻腔免疫的HPIV1、HPIV2和HPIV3减毒活疫苗(15,16,29,31). 本论文描述了使用反向遗传学识别衰减的初步研究(自动变速箱)在重组减活HPIV1疫苗中有用的突变。HPIV1/Washington/20993/1964（HPIV1/Wash/64）株，长度为15600个核苷酸，基因组结构类似于呼吸道病毒属，最近从cDNA中恢复(23). HPIV1的基因组编码几个核衣壳相关蛋白，包括核衣壳蛋白（N）、磷酸蛋白（P）和大聚合酶（L），以及几个包膜相关蛋白，其中包括基质蛋白（M）和主要的保护性抗原决定簇，融合糖蛋白（F）和血凝素-神经氨酸酶糖蛋白（HN）。基因顺序为N、P/C、M、F、HN和L，其中C是由P中的另一个开放阅读框（ORF）编码的辅助蛋白，部分抵消干扰素的抗病毒活性(10). 基于cDNA的HPIV1恢复系统的可用性使得从本疫苗开发项目一开始就有可能对活性减弱HPIV1候选疫苗进行分子工程，并优化疫苗特性。先前的研究表明，有可能将一种副粘病毒中存在的减弱突变转移到该组另一成员的同源位点，从而快速实现抗原不同受体病毒的减弱(7,8,31). 核苷酸和氨基酸序列比对分析表明，HPIV1与仙台病毒，然后是HPIV3(23)，表明仙台病毒而HPIV3将是HPIV1减突变的良好供体。
本研究通过转移HPIV3的L蛋白中鉴定的三个独立衰减氨基酸取代中的两个（Tyr-942到His，Y942H；Leu-992到Phe，L992F；Thr-1558到Ile，T1558I）来启动内容提供商rHPIV1的45个候选疫苗Y942H和L992F(30). 尝试生成包含所有三种内容提供商HPIV1中的45个突变是有问题的，这表明这三个突变在HPIV1同时存在时是不兼容的。HPIV3中存在的两个密码子（Y942H或L992F）中的每一个内容提供商45分别转移到HPIV1中的同源位置，使得所得到的HPIV1L基因与HPIV1野生型L基因相差一个核苷酸并且蛋白质相差一个氨基酸。在HPIV3主干中，Y942H和L992F突变各自指定对温度敏感(ts秒)体外表型与自动变速箱仓鼠的表型(28). 本研究的一个目的是确定HPIV1主干中每个突变的影响。我们也有兴趣探索一种通用策略，以提高ts秒和自动变速箱活性减弱呼吸道病毒疫苗中的氨基酸点突变。之前的研究确定了一些ts秒和自动变速箱HPIV3、呼吸道合胞病毒和流感病毒中的氨基酸替代突变，每一种都涉及一个单核苷酸变化(4,22,35). 总的来说，RNA病毒的高突变率会使单核苷酸变化容易受到遗传和表型不稳定性的影响。例如，携带两种或两种以上的呼吸道病毒ts秒突变在体内复制后表现出失去表型的趋势(22,33,35). 这一发现表明，最好尽早开发HPIV1减活病毒疫苗，以提高疫苗中包含的单个突变的遗传稳定性。由于一种机制的损失ts秒表型是将核苷酸替代逆转为野生型分配，我们试图修改重组HPIV1（rHPIV1）密码子，以便需要两个或三个核苷酸改变才能恢复野生型氨基酸编码分配。这种策略以前曾被用于产生一组在E2病毒蛋白的几个位点发生密码子替换突变的减毒重组Sindbis病毒(24,27). 这些重组病毒在体内表现出不同程度的衰减，但其在体外或体内的表型稳定性尚不清楚。因此，我们使用rHPIV1密码子942和992处的突变来探索每个位置的活性氨基酸编码分配的范围，并回收了13个rHPIVI病毒，每个病毒在942处具有不同的氨基酸，以及10个病毒在992处具有替换。对这些密码子替换突变体进行体外复制的温度敏感性和在仓鼠呼吸道中复制的能力分析。在这两个密码子中都发现了衰减或遗传稳定性增强的rHPIV1病毒。这些突变将有助于减弱rHPIV1候选疫苗的突变。
材料和方法
病毒和细胞。
LLC-MK2细胞（ATCC CCL 7.1）和HEp-2细胞（ATACC CCL 23）保存在Opti-MEM I（Gibco-Invitrogen，Inc.，Grand Island，N.Y.）中，并添加5%胎牛血清、硫酸庆大霉素（50μg/ml）和2 mM谷氨酰胺（Gibco-Invitrogen，Inc.）。如前所述，rHPIV1和rHPIV1突变体在LLC-MK2细胞中生长(23).
抗原HPIV1 cDNA点突变的构建。
将这些突变导入适当的rHPIV1亚基因克隆(23)使用其他地方描述的改良PCR诱变方案(20)使用Advantage-HF PCR试剂盒（Clontech Laboratories，Palo Alto，Calif.）。然后使用ABI 3100测序器和BigDye测序试剂盒（英国沃林顿Perkin-Elmer Applied Biosystems）对包含突变的亚基因组克隆进行PCR扩增的整个区域的测序以确认亚克隆包含引入的突变，但不包含PCR扩增过程中引入的任何不定突变。使用标准分子克隆技术组装包含突变的全长HPIV1 cDNA克隆（FLC）(23)，并对每个FLC中包含引入突变的区域进行上述测序，以确保FLC包含引入突变。
恢复rHPIV1突变病毒。
如前所述，恢复rHPIV1突变体(23). 为了证实病毒含有适当的突变，使用Qiaquick vRNA试剂盒（Qiagen Inc.，Valencia，CA）从感染的细胞上清液中分离病毒RNA，并通过逆转录（RT）-PCR扩增每个病毒中的适当区域，如前所述(23)并通过测序分析。本研究中的所有病毒RNA序列分析均涉及未连接RT-PCR产物的直接分析。进行对照RT-PCR，其中省略了RT酶，以确认RT-PCR产物是由RNA生成的，而不是污染DNA。对于含有密码子替换突变的FLC，使用pTM（L1)含有HPIV1野生型L蛋白序列的支持质粒(23). 在涉及942或992密码子的几个例子中，恢复的病毒包含野生型L蛋白编码序列，表明pTM（L1)支持质粒与突变FLC(11). 因此，随后进行了恢复尝试，其中野生型pTM（L1)将支持质粒替换为一个含有被挽救FLC中适当L突变的质粒。回收的rHPIV1病毒通过使用LLC-MK2单层在96个平板上连续两轮末端稀释进行生物克隆（Costar；Corning，Inc.，Corning，N.Y.）。通过RT-PCR产物的序列分析，确认每个生物克隆病毒中都存在引入的突变。
在允许和限制温度下，在LLC-MK2细胞中复制rHPIV1突变体。
这个ts秒通过比较每种病毒与rHPIV1野生型病毒在32、35、36、37、38和39°C下的复制水平，确定每种rHPIVI突变病毒的表型，如前所述(32). 病毒滴度，表示为平均对数10每毫升50%组织培养感染剂量（log10TCID公司50/ml），在一到三个单独的实验中测定。滴度降低（log10)在每个限制温度下，通过与许可温度32°C下的滴度进行比较来确定每个实验的滴度，并计算平均减少量。这个ts秒表型被定义为与野生型病毒相比滴度降低100倍或更多。
rHPIV1突变病毒在仓鼠呼吸道中的复制。
用0.1毫升L-15（纽约州格兰德岛英维特罗根公司）（含106TCID公司50野生型或突变型HPIV1。四天后，如前所述收集鼻甲和肺部(23). 样品中存在的病毒通过32°C下LLC-MK2单层上的滴定进行定量。感染细胞在感染后第6天通过豚鼠红细胞的血液吸收进行检测。平均滴度（log10TCID公司50/g） 计算每组六只仓鼠。这个自动变速箱表型被定义为与野生型相比，在任一或两个解剖位置的病毒滴度降低了100倍或更大。
在限制温度下通过传代测定LLC-MK2细胞中rHPIV1-Y942H和rHPIV1-Y942A的遗传和表型稳定性。
具有原始Y942H突变或Y942A突变的rHPIV1突变体在32°C的LLC-MK2单层上生长，输入接种量约为0.01 TCID50直到细胞病理学可见（约5至7天）。将上清液中的病毒稀释1至1000，并在32°C下再次在LLC-MK2单层上传播。这个过程总共重复了10段。或者，这两种病毒也在越来越严格的温度下传代，如下所示：两个传代（如上所述）在32°C，两个在35°C，二个在36°C，和两个在37°C，然后将第二个37°C传代收获的未稀释上清液在38°C传递给LLC-MK2单层，然后在39°C传递一次，共10段。
在每个传代水平，冷冻等分试样进行表型和基因型分析。测定了rHPIV1-Y942H和rHPIV1-Y942A的复制水平和温度敏感性，并与上述rHPIV1的复制水平进行了比较。如上所述对每种病毒进行序列分析。
结果
恢复L蛋白942位氨基酸处携带密码子替换突变的rHPIV1。
减毒HPIV3的L蛋白Y942H突变内容提供商通过反向遗传学将45种病毒导入rHPIV1的同源位置，产生一种名为rHPIV1-Y942H的活病毒（表). rHPIV1中的突变与原始HPIV3中的突变相同内容提供商45型病毒，涉及单核苷酸替换(T型AC至C类AC，替换下划线）。考虑到Tyr（TAT和TAC）和His（CAT和CAC）可能的密码子序列，这种氨基酸替换不能设计为涉及一个以上的核苷酸变化。为了评估涉及该氨基酸位点的所有可能表型，我们制备了额外的突变cDNA，其中942位被改变为其他18个可能的氨基酸分配中的每一个。尽可能选择密码子，以便与野生型Tyr分配的两个可能密码子相比，最大化核苷酸差异的数量（表).
表1。
L蛋白942位氨基酸携带rHPIV1密码子替换突变的恢复
| 病毒 | 密码子一 | 恢复野生型氨基酸所需的核苷酸变化数量 | 恢复rHPIV1突变 | L ORF中的偶然编码突变 |
|---|
| rHPIV1野生型 | TAT、TAC | 0 | + | ND（无损检测）b条 |
| rHPIV1-Y942H型 | CAC公司 | 1 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942C型c（c） | TGC公司 | 1 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942F型 | TTT公司 | 1 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942N型c（c） | AAC公司 | 1 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942D型c（c） | 通用汽车公司 | 1 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942S型 | 自动增益控制 | 2 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942W型 | TGG公司 | 2 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942Q型 | CAG公司 | 2 | + | 第1302页 |
| rHPIV1-Y942K型 | 美国汽车协会 | 2 | −d日 | ND（无损检测） |
| rHPIV1-Y942I型 | 空中交通管制 | 2 | − | ND（无损检测） |
| rHPIV1-Y942E型 | GAG公司 | 2 | − | ND（无损检测） |
| rHPIV1-Y942M型c（c） | 自动液位计 | 三 | + | L1367S系列 |
| rHPIV1-Y942A型 | GCG公司 | 三 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942T型c（c） | ACA公司 | 三 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942G型 | GGG公司 | 三 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942Vc（c） | 全球技术集团 | 三 | + | G1755Q号 |
| rHPIV1-Y942L型c（c） | CTG公司 | 三 | + | 无 |
| rHPIV1-Y942R | CGG公司 | 三 | − | ND（无损检测） |
| rHPIV1-Y942P型 | CCG公司 | 三 | − | ND（无损检测） |
在这18个额外的密码子替换突变体中，有13个在感染病毒中被回收。如果经过三到五次尝试后，所需的rHPIV1重组体仍未恢复，我们认为该突变株无法存活。每一个回收的病毒都进行了生物克隆，并对完整的L基因进行了测序，以确认每一种情况下都存在引入的突变。在14个恢复的rHPIV1密码子替换突变体中，包括原始Y942H突变体，发现3个在L中各有一个额外的不定编码突变（表). 根据我们的经验，在克隆的生物衍生或重组病毒中，如果采取额外的权宜之计进行广泛的序列分析，经常会发现不定突变，通常是表型沉默的。这些不定突变对这3个突变体表现出的表型的可能贡献没有进一步研究，因为在L ORF中缺乏不定突变的11个突变体足以进行本研究的分析。14个rHPIV1-942密码子替换突变体中的每一个在32°C的体外高效复制，并达到至少10的滴度7TCID公司50/ml（表).
表2。
rHPIV1 L蛋白密码子942替换突变体的温度敏感性和衰减表型
| 病毒 | 恢复野生型氨基酸所需的核苷酸变化数量 | 32°C下的病毒滴度（log10TCID公司50/毫升） | 平均对数10指示温度下病毒滴度降低（°C）一
| 病毒在仓鼠体内的复制
|
|---|
| 动物数量 | 病毒平均滴度（log10TCID公司50/g±SE）
|
|---|
| 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 鼻鼻甲 | 肺 |
|---|
| rHPIV1野生型 | 0 | 7.8 | 0.1 | 0.4 | 0.8 | 1.5 | 1.8 | 30 | 4.2 ± 0.2 | 3.9 ± 0.4 |
| rHPIV1-Y942H型内容提供商45 | 1 | 8 | | 1.4 | 3.1 | 5.1 | 5.8 | 18 | <1.5 ± 0.0b条 | <1.5 ± 0.0 |
| rHPIV1-Y942C型 | 1 | 8 | 1.8 | 2.1 | 2.3 | 4.8 | 6.5 | 6 | 4.4±0.2 | 3.4 ± 0.4 |
| rHPIV1-Y942F型 | 1 | 8.1 | 0.3 | 1.3 | 1.9 | 3.4 | 5.4 | 6 | 3.8 ± 0.1 | 3.9 ± 0.2 |
| rHPIV1-Y942N型 | 1 | 9 | 1 | 2.1 | 3.7 | 4.3 | 7 | 6 | 2.0 ± 0.2 | 1.6 ± 0.1 |
| rHPIV1-Y942D型 | 1 | 7.9 | 3.3 | 5.3 | >6.6 | >6.7 | >6.9 | 6 | 1.6 ± 0.1 | 1.8 ± 0.3 |
| rHPIV1-Y942S型 | 2 | 8.3 | 0.6 | 1.2 | 3.6 | 5.2 | >6.4 | 6 | 3.2 ± 0.1 | 1.8 ± 0.2 |
| rHPIV1-Y942W型 | 2 | 8.4 | 0.8 | 1.5 | 3 | 4.2 | >6.4 | 12 | 1.8 ± 0.2 | 1.6 ± 0.1 |
| rHPIV1-Y942Q型 | 2 | 7 | 1.4 | 3.6 | >4.7 | >5.8 | >5.9 | 12 | 1.5 ± 0.1 | 1.7 ± 0.2 |
| rHPIV1-Y942M型 | 三 | 7.3 | 3 | 5.3 | >6.0 | >5.8 | >6.2 | 6 | <1.5 ± 0.0 | <1.5±0.0 |
| rHPIV1-Y942A型 | 三 | 8.1 | 3.5 | 3.5 | >5.1 | >6.4 | >6.8 | 6 | <1.5 ± 0.0 | <1.5 ± 0.0 |
| rHPIV1-Y942T型 | 三 | 8 | 1.8 | 3 | >5.0 | >6.8 | >6.9 | 6 | <1.5 ± 0.0 | <1.5 ± 0.0 |
| rHPIV1-Y942G型 | 三 | 8.1 | 1 | 3.1 | >4.1 | >5.8 | >7.3 | 6 | <1.5 ± 0.0 | <1.5 ± 0.0 |
| rHPIV1-Y942V | 三 | 7 | 2.6 | 5 | >5.7 | >5.8 | >6.1 | 12 | <1.5 ± 0.0 | 1.6 ± 0.1 |
| rHPIV1-Y942L型 | 三 | 7 | 2.8 | 5 | 5.5 | 5.5 | >5.8 | 6 | <1.5 ± 0.0 | <1.5 ± 0.0 |
rHPIV1密码子942替换突变体的温度敏感性和衰减表型。
携带从HPIV3转移的Y942H突变的rHPIV1病毒内容提供商45强ts秒体外，显示3.1 log10相对于32°C，37°C时的病毒产量降低（表). 这一发现表明，这种导入的突变有效地发挥了ts秒rHPIV1主干突变。值得注意的是，其他13个恢复的rHPIV1突变体也都是ts秒在突变体中观察到温度敏感性谱。5个rHPIV1突变体，即具有Y942D、Y942M、Y942A、Y94 2V或Y942L突变的突变体，被发现为时间如rHPIV1-Y942H，后四个涉及密码子，每个密码子都需要三个核苷酸改变才能将Tyr恢复到942位。因此，我们实现了用ts秒表型与rHPIV1-Y942H相似，但需要在942位进行三次核苷酸改变才能恢复野生型Tyr残基。
接下来，我们将密码子替代病毒在感染仓鼠的上呼吸道（鼻甲）和下呼吸道（肺部）复制的能力与野生型rHPIV1进行了比较（表). 携带从HPIV3转移的Y942H突变的rHPIV1内容提供商与其rHPIV1亲本病毒相比，45在仓鼠的上呼吸道和下呼吸道中高度衰减（表). 这一发现表明，这种HPIV3衍生的突变有效地作为自动变速箱HPIV1主干发生突变。13个rHPIV1突变体中有11个在仓鼠中减弱，其定义是与HPIV1野生型相比，上呼吸道或下呼吸道的病毒滴度降低了100倍或更多（表中下划线的数值). 需要改变密码子942中的三个核苷酸来恢复野生型氨基酸（Y942M、Y942A、Y942T、Y942 G、Y942-V和Y942L）的六个rHPIV1突变体中的每一个都与rHPIV1-Y942H一样弱。因此，我们实现了用自动变速箱表型与rHPIV1-Y942H的表型相似，但其中一个表型需要在942位改变三个核苷酸才能恢复野生型Tyr。
在限制温度下，使用原始Y942H突变或稳定的Y942A密码子传代rHPIV1突变体。
对于ts秒病毒，在限制温度下传播病毒是确定病毒稳定性水平的有效方法ts秒表型(2,26,34). 因此，我们使用此程序来比较ts秒原始突变体（rHPIV1-Y942H）的表型在密码子942处包含单核苷酸替换，而rHPIV1-Y942A的表型在该密码子中包含三个核苷酸替换。这两种病毒（i）在32℃的允许温度下传播10次，或（ii）在越来越严格的温度下传播，如下所示：在32℃下传播2次，在35℃下传播两次，在36℃下传播二次，在37℃下传播一次，在38℃下传播1次，在39℃下传播，共传播10次。对来自不同传代水平的小份病毒进行分析ts秒并对L基因进行部分或完整序列分析（表).
表3。
限制温度下传代后具有L蛋白Y942H突变（单核苷酸替换）或Y942A突变（三核苷酸替换）的rHPIV1突变体的温度敏感性和序列分析
| 病毒 | 通道系列一 | 分析的通道水平b条（摄氏度） | 平均滴度（log10TCID公司50/毫升），温度为32°C | 指示温度下病毒滴度降低c（c）
| L基因和蛋白质序列d日
|
|---|
| 38摄氏度 | 39摄氏度 | 密码子942（氨基酸分配） | 测序范围e（电子） | 第二位突变 |
|---|
| rHPIV1野生型 | | | 8 | 1.2 | 3.4 | TAT（酪氨酸） | F类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | | 未通过的 | 6.7 | 3.7（f） | >5.2克 | CAC（他的） | C类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | 1 | 第10-32页 | 7.7 | 3.5 | 5.5 | CAC（他的） | C类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | 2 | 第4-35页 | 7.5 | 3.3 | 5.3 | CAC（他的） | C类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | 2 | 第6-36页 | 7.2 | 2 | 4 | TAC（轮胎） | C类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | 2 | 第8-37页 | 7 | 0.3 | 3.5 | TAC（轮胎） | C类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | 2 | 第9-38页 | 6.5 | 1 | 3.3 | TAC（轮胎） | F类 | 无 |
| rHPIV1-Y942H型 | 2 | 第10-39页 | 5.2 | 1 | 3 | TAC（轮胎） | F类 | 无 |
| rHPIV1-Y942A型 | | 未通过的 | 6.5 | 4.8 | >5.0克 | GCG（阿拉巴马州） | P（P） | 无 |
| rHPIV1-Y942A型 | 三 | 第10-32页 | 7.5 | 4 | 4.5 | GCG（阿拉巴马州） | P（P） | 无 |
| rHPIV1-Y942A型 | 4 | 第4-35页 | 7 | 4.3 | >5.5克 | GCG（丙氨酸） | P（P） | 无 |
| rHPIV1-Y942A型 | 4 | 第6-36页 | 7 | 4 | 4.8 | GCG（丙氨酸） | P（P） | v1016升 |
| rHPIV1-Y942A型 | 4 | 第8-37页 | 6.7 | 3.5 | >5.2克 | GCG（丙氨酸） | P（P） | V1016L/N1125D小时 |
| rHPIV1-Y942A型 | 4 | 第9-38页 | 6.2 | 3.5 | >4.7克 | GCG（丙氨酸） | F类 | V1016L/N1125D |
| rHPIV1-Y942A型 | 5 | 第10-39页 | 5.2 | 3 | >3.7克 | GCG（丙氨酸） | F类 | S1328P型 |
这个ts秒两种突变病毒rHPIV1-Y942H和rHPIV1-Y942A的表型在32°C下传代10次后没有变化（传代系列1和3分别见表)每个L基因的序列分析表明，各自的突变密码子没有改变。未检测到其他突变。相反，对rHPIV1-Y942H突变体传代的等分样品进行分析（表中的传代系列2)在限制温度下，通过传代水平p6-36（36°C），病毒已失去其ts秒表型和密码子942处的一致序列已直接恢复到Tyr的野生型分配(C类AC至T型AC）。这种单核苷酸改变恢复了Y942H-p6在限制温度下复制的能力，使其在这方面与rHPIV1野生型病毒无法区分。从传代水平p9-38和p10-39（分别为38和39°C，传代系列2，表).
在两个独立的传代序列中，即使在38或39°C的高度限制温度下，Y942A突变体也没有在密码子942处回复（表（第4代和第5代），即密码子942处的序列在所有测序的后代中保持GCG。来自传代水平p8-37和p9-38（分别为37和38°C）的病毒的温度敏感性水平，表，通道系列4）保持高度ts秒38°C和39°C温度下。然而，部分损失了ts秒表型，使这些菌株的复制在38°C时增加了约20倍（表，传代序列4）与原始Y942A突变体进行比较。这一转变ts秒表型与L蛋白、V1016L和N1125D中第二位点氨基酸点突变的获得相关。这些突变对温度敏感性丧失的相对贡献没有得到解决，并且由于完整的Y942A p9-38基因组没有测序，基因组其他部分（例如N或P基因）的突变也可能有贡献。然而，与野生型rHPIV1相比，p8-37和p9-38病毒在38°C下的复制受到的限制仍然是野生型rHRIV1的200倍，并且这两种病毒在39°C下都无法在ts秒化验。类似地，来自p10-39（39°C）传代水平的病毒是一个独立的传代序列（表，第5代）在38°C时表现出介于野生型rHPIV1和起始Y942A病毒之间的中等温度敏感性，但仍然足够ts秒在39°C时未能复制（表). 这种温度敏感性的部分丧失与L中第三个第二位点突变的发生有关，即S1328P。然而，整个基因组没有测序，L ORF之外的突变也可能导致温度敏感性的部分丧失。因此，ats秒涉及单核苷酸取代的突变很容易恢复到野生型，并在限制性温度下迅速成为主要的病毒种类。相反，没有观察到与野生型密码子不同的三个核苷酸的逆转，而是部分丢失了ts秒在越来越严格的温度下传代8代后观察到表型，并检测到可能的第二位点基因内抑制突变。
恢复L蛋白中氨基酸位置992处携带rHPIV1的密码子替换突变。
HPIV3的第二个L蛋白突变内容提供商通过反向遗传学将45 L，L992F引入rHPIV1的同源位置，产生了一种名为rHPIV1-L992V的活病毒（表). 我们还准备了额外的突变体（表)其中992位被更改为18个其他可能氨基酸分配中的17个（仅缺少Ser）（表). 与Leu野生型分配的可能密码子相比，选择密码子是为了最大化核苷酸差异的数量，但由于Leu存在六个不同的密码子，这一点很难实现。尽管如此，与任何亮氨酸密码子相比，九个替换突变可能设计为涉及两个核苷酸差异（表). 在这17个额外的突变中，有10个携带适当突变的重组病毒被回收，并易于在体外繁殖和生物克隆。在剩下的7个rHPIV1突变体中，有3个（L992R、L992P和L992Q）在转染收获中被恢复，但在生物克隆过程中恢复为野生型，另外两个（L996E和L992D）在转导收获中恢复，但复制效率很低，无法繁殖。另外两个（L992G和L992T）与野生型pTM（L1)并且没有进一步研究。在10个恢复的稳定突变病毒中，每个病毒的L基因都围绕突变位点进行了测序，并确认了每个引入的突变的存在。11个恢复的密码子992替换突变体中的每一个都在32°C的体外高效复制，并达到≥10的滴度7TCID公司50/ml（表).
表4。
L蛋白992位氨基酸携带rHPIV1密码子替换突变的恢复
| 病毒 | 密码子一 | 恢复野生型氨基酸所需的核苷酸变化数量 | 恢复rHPIV1突变 |
|---|
| rHPIV1野生型 | TTA、TTG、CTT、CTC、CTA、CTG | 0 | + |
| rHPIV1 L992F型内容提供商45 | TTT公司 | 1 | + |
| rHPIV1 L992M型 | 自动液位计 | 1 | + |
| rHPIV1 L992H型 | CAC公司 | 1 | + |
| rHPIV1 L992I型 | 空中交通管制 | 1 | + |
| rHPIV1 L992W型 | TGG公司 | 1 | + |
| rHPIV1 L992R型 | CGG公司 | 1 | −b条 |
| rHPIV1 L992V | GTC公司 | 1 | + |
| rHPIV1 L992Q型 | CAG公司 | 1 | −b条,c（c） |
| rHPIV1 L992E型 | GAG公司 | 1 | −d日 |
| rHPIV1 L992P型 | CCG公司 | 1 | −b条 |
| rHPIV1 L9992A型 | GCG公司 | 2 | + |
| rHPIV1 L992Y型 | 节气门执行器控制 | 2 | + |
| rHPIV1 L992C型 | TGC公司 | 2 | + |
| rHPIV1 L9992N型 | AAC公司 | 2 | + |
| rHPIV1 L992D型 | 通用汽车公司 | 2 | −d日 |
| rHPIV1 L992T型 | 行政协调会 | 2 | −c（c） |
| rHPIV1 L992G型 | GGG公司 | 2 | −c（c） |
| rHPIV1 L992K型 | AAG公司 | 2 | + |
表5。
rHPIV1 L蛋白密码子992替代突变体的温度敏感性和衰减表型
| 病毒 | 恢复野生型氨基酸所需的核苷酸变化数量 | 32°C下的病毒滴度（log10TCID公司50/毫升）b条 | 平均对数10减少一指示温度下的病毒滴度（°C）
| 病毒在仓鼠体内的复制
|
|---|
| 动物数量 | 病毒平均滴度（log10TCID公司50/g±SE）
|
|---|
| 35 | 36 | 37 | 38 | 39 | 鼻甲 | 肺 |
|---|
| rHPIV1-野生型 | 0 | 7.5 | 0.1 | 0.1 | 0.5 | 0.6 | 1.2 | 30 | 4.2 ± 0.2 | 3.9 ± 0.4 |
| rHPIV1 L992F型内容提供商45 | 1 | 8.1 | 0.2 | 0.3 | 1.3 | 0.9 | 2.4 | 12 | 4.4 ± 0.3 | 3.0 ± 0.2 |
| rHPIV1 L992M型 | 1 | 8.4 | 0.2 | 0.2 | 0.4 | 0.7 | 2.7 | 6 | 4.7 ± 0.3 | 3.2 ± 0.4 |
| rHPIV1 L9992I型 | 1 | 8.2 | 0.3 | 0.5 | 0.5 | 2.7 | 4.3b条 | 6 | 4.1 ± 0.2 | 2.6 ± 0.3 |
| rHPIV1 L9992W型 | 1 | 8.5 | 0 | 0.5 | 0.8 | 3.7 | 3.8 | 6 | 4.0 ± 0.2 | 3.3 ± 0.1 |
| rHPIV1 L992H型 | 1 | 8.1 | 0.3 | 1.3 | 1.3 | 1.8 | 4.9 | 6 | 3.3 ± 0.2 | 3.4 ± 0.1 |
| rHPIV1 L992V | 1 | 6.2 | 0.7 | 0.5 | 1.5 | 2.5 | 4 | 6 | <1.5 ± 0.0c（c） | 1.7±0.2 |
| rHPIV1 L992N型 | 2 | 7.8 | 0.6 | 0.3 | 0.6 | 2 | 3.3 | 6 | 2.7 ± 0.2 | <1.5 ± 0.0 |
| rHPIV1 L992Y型 | 2 | 8.5 | 0 | 0.2 | 0.5 | 1.4 | 2.9 | 6 | 4.5 ± 0.2 | 3.3 ± 0.4 |
| rHPIV1 L992K型 | 2 | 8.6 | 0 | 1.2 | 0.2 | 1.8 | 3 | 6 | 4.1 ± 0.3 | 3.1 ± 0.4 |
| rHPIV1 L992A型 | 2 | 7.9 | 0.5 | 0.3 | 1.2 | 3 | 4.5 | 6 | 3.6 ± 0.2 | 3.2 ± 0.3 |
| rHPIV1 L992C型 | 2 | 7.3 | 0.7 | 2.2 | 2.9 | 4 | >4.9 | 6 | 3.2 ± 0.2 | 1.7 ± 0.1 |
rHPIV1密码子992替换突变体的温度敏感性和衰减表型。
携带HPIV3转染的L992F突变的rHPIV1病毒内容提供商45不是ts秒体外（表). 回收的10个额外的rHPIV1突变体中有7个是ts秒在突变体中观察到温度敏感性谱。一种病毒rHPIV1-L9992C表现出最高水平的温度敏感性，在36°C时复制减少了100倍。因此，我们能够获得一个rHPIV1密码子992替换突变体，与最初的非-ts秒rHPIV1-L992F突变体ts秒.
将密码子992替换突变体在仓鼠上下呼吸道的复制水平与rHPIV1的复制水平进行比较（表). rHPIV1-L992F病毒在仓鼠中没有减弱：因此，HPIV3中的L992V突变正在减弱(28)但在HPIV1中没有。然而，与野生型病毒相比，其他10个密码子992替换突变体中的3个（L992V、L992N和L992C）的复制减少了100倍或更多。因此，我们能够获得几个rHPIV1密码子992替换突变体自动变速箱表型。有趣的是，rHPIV1-L992V突变株只是轻微的ts秒表明L992V突变导致了-ts秒衰减表型。
讨论
从cDNA中回收重组负链RNA病毒的能力使得通过计划引入野生型病毒的减毒突变来开发减毒活病毒候选疫苗成为可能。这一过程可以根据正在进行的临床前和临床评估以循序渐进的方式完成，直到在衰减和免疫原性之间达到所需的平衡(4,21). 工程疫苗的遗传稳定性可以通过积累足够数量的衰减突变来实现，以使衰减表型在制造期间和这些呼吸道病毒在人体内短暂复制期间不太可能丢失(4,21). 此外，还可以设计具有更高稳定性的衰减突变，例如删除整个基因，或如本研究中所述，稳定密码子替换突变。添加点突变，指定ts秒和自动变速箱部分减毒病毒的表型在逐步减毒病毒如呼吸道合胞病毒和HPIV3中非常有用(4,31). 然而，如上所述自动变速箱在体内复制过程中，这些突变指定的表型可以通过直接逆转或其他突变进行修改(33,35). 由于分子工程使改变密码子成为可能ts秒和自动变速箱表型，我们在本研究中试图检验在给定基因座上选择替代密码子是否可以用于增强a的遗传稳定性ts秒-自动变速箱突变并增加衰减水平。
在本研究中，我们利用了在低温下HPIV3传代过程中发生的L密码子942突变，该突变指定了一个ts秒HPIV3的表型。这一先前的发现确定了L中的该位点易发生突变，因此它代表了一个合理的位点，可用于检测密码子替换突变对体外和体内表型的影响。HPIV3基因L基因Y942H突变的引入内容提供商45插入rHPIV1的同源位置产生了一种病毒，该病毒具有ts秒和自动变速箱表型。然而，这些表型是密码子942中单核苷酸替换的结果，因此可能存在不稳定性。另外产生了13个具有活性的rHPIV1突变体，这些突变体在密码子942处含有各种替代氨基酸，所有突变体均为ts秒。我们假设我们未能恢复五个氨基酸替换突变体，这表明在密码子942中指定这些氨基酸的突变是死基因突变，也就是说，它们将不起作用。已鉴定出六个高度衰减的突变体（那些在942位具有Met、Ala、Thr、Gly、Val或Leu替代的突变体），它们需要发生三个核苷酸变化才能生成一个密码子，该密码子在密码子942处指定野生型Tyr残基。然而，在仓鼠体内复制的13个恢复的rHPIV1突变体中，还有2个突变体（Cys或Phe位于942位）的效率与野生型HPIV1相同。因此，自然发生的Tyr-942分配并不是唯一赋予野生型表型的分配：Cys-942和Phe-942也具有野生型表型。因此，必须选择942分配，该分配（i）指定适当的衰减水平，并且（ii）与Tyr、Cys和Phe的所有可能的密码子相差两个，或者优选三个核苷酸。对于六种高度减毒的病毒中的四种病毒（具有Met、Gly、Val或Leu替代的病毒），它们的密码子中只需两个核苷酸替换就可以产生位置942处带有Tyr、Cys或Phe的病毒。其余两种高度减毒的病毒（具有丙氨酸或苏氨酸分配）需要三个核苷酸替换才能生成Tyr、Cys或Phe的密码子。因此，在对ts秒和自动变速箱13个活的密码子942替换突变、Y942A和Y942T突变的表型被鉴定为密码子942T替换，这些替换高度衰减，需要发生三个核苷酸变化才能产生具有野生型表型的病毒。幸运的是，这两种病毒都是11个突变株中的一个，这些突变株在L基因中没有偶然突变，因此这些发现是明确的。
在限制温度下复制后，对这两种rHPIV1病毒之一的Y942A病毒的遗传和表型稳定性进行了检测。这一过程与原始Y942H病毒的过程并行进行，该病毒与野生型病毒的区别仅在于单个核苷酸。Y942H病毒在35至36°C温度下仅传代四次后就很容易恢复到野生型表型，而密码子稳定的Y942A病毒仅表现出部分缺失的ts秒即使在高温条件下传代八代，也会出现表型。Y942H病毒的表型不稳定伴随着密码子942处野生型序列的直接逆转。这种变化仅在高温下复制后发生，表明高温在选择ts秒rHPIV1-Y942H回复物。
序列分析证实，稳定的Y942A病毒在高温下的整个传代过程中保留了GCG Ala密码子。然而，部分损失ts秒上述表型与L。稳定的Y942A病毒即使在高度限制的温度下传代后仍保持高度的温度敏感性，这一发现表明它在体外和体内的表型稳定性也将高于非稳定的Y94 2H病毒。对HPIV1 L蛋白残基942处密码子替换的分析提供了一个示例，说明如何识别具有一系列特性的突变，包括减毒活病毒疫苗所需的减毒和表型稳定性。这个特定的例子证明了有几个优点，有助于选择稳定的突变分配：（i）Tyr的野生型分配只有两个可能的密码子，（ii）在具有替代氨基酸分配的突变中，只有两个没有高度衰减，以及（iii）这两个赋值都只有两个可能的密码子。
在之前的研究中，HPIV3的引入内容提供商45 L992F L蛋白突变为野生型HPIV3骨架ts秒体外表型和自动变速箱仓鼠的表型(28)，确定L992F为独立ts瓦特突变。然而，在本研究中，将该突变引入HPIV1背景的同源位置并没有赋予任何表型。当在密码子992处引入替代氨基酸分配时，17个突变体中只有10个被恢复，表明该位点确实对突变敏感。已鉴定出三个密码子替换突变体，rHPIV1-L992V、rHPIV1-L992N和rHPIV1-L992C，它们在仓鼠的上呼吸道或下呼吸道中的复制限制是rHPIVl野生型病毒的10到100倍。因此，这些发现例证了密码子替换突变的第二种用法，即生成体内衰减水平增强的突变。有趣的是，三种减毒重组体（rHPIV1-L992C、rHPIV1-L992V和rHPIVI-L992N）中的每一种都对温度敏感。然而，温度敏感性水平和衰减水平之间存在分离。例如，L992C突变在36至37°C时限制体外复制，主要在下呼吸道减弱，而L992V突变仅在39°C时抑制体外复制，但在上呼吸道和下呼吸道均高度减弱。因此，L992V突变主要是非-ts秒类型。
先前的研究表明，含有ts秒通过添加非-ts秒衰减突变(22). 也，ts秒突变在较低、较温暖的呼吸道区域发挥其衰减作用更为显著，而非-ts秒无论温度梯度如何，突变都会减弱。因此，混合这两种类型的突变最有利于实现预防严重下呼吸道疾病和减少上呼吸道充血的双重目标。这个ts秒和非-ts秒本报告中发现的密码子替换突变现在与其他非-ts秒减弱突变以产生减毒效果好、有效且基因稳定的rHPIV1疫苗。
