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神经科学杂志。2013年3月27日；33(13): 5603–5611.
数字对象标识：2013年10月1523日至2013年12月18日
预防性维修识别码：邮编：690366
NIHMSID公司：NIHMS460257标准
PMID：23536075

TRPV1和TRPA1拮抗剂预防慢性胰腺炎急慢性炎症和疼痛的转变

埃里卡·施瓦茨，通讯作者1,2 Jun-Ho La公司，1,2 尼科尔·谢夫，1,4 布莱恩·戴维斯，1,三 凯瑟琳·M·阿尔伯斯，1,三和G.F.Gebhart公司1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

摘要

表达瞬时受体电位（TRP）通道TRPV1和TRPA1的内脏传入纤维被认为是神经源性炎症和炎症性痛觉过敏发展所必需的。我们使用反复发作（每周两次）由氯化胆碱诱导的急性胰腺炎（AP）产生的慢性胰腺炎（CP）小鼠模型，研究这些TRP通道在胰腺炎症和疼痛相关行为中的参与。在不同的时间给药两个TRP通道的拮抗剂以阻断AP的神经源性成分。6次AP注射（超过3周）增加了胰腺炎症和疼痛相关行为，产生了胰腺神经纤维纤维化和萌芽，增加了胰腺传入体中TRPV1和TRPA1基因转录物和伤害性标记物pERK。在第3周前开始使用TRP拮抗剂治疗时，可降低胰腺炎症和疼痛相关行为，并阻止胰腺组织病理学变化的发展，以及胰腺传入纤维中TRPV1、TRPA1和pERK的上调。即使小鼠再接受7周每周两次的青霉素攻击，TRP拮抗剂的持续治疗也会阻止CP和疼痛行为的发展。然而，当第3周后开始治疗时，TRP拮抗剂在阻止AP向CP的转变和疼痛行为的出现方面无效。这些结果表明：（1）神经源性炎症在胰腺炎和疼痛相关行为中起着重要作用。

引言

慢性胰腺炎（CP）是一种使人衰弱的疾病，其特征是持续炎症、疼痛和不可逆的形态学改变，通常伴有部分或全部功能丧失。CP疼痛最初可能是间歇性的，但随着疾病的发展，疼痛的发生率和强度会增加。相反，急性胰腺炎（AP）被定义为胰腺恢复的炎症事件。尽管有人认为AP和CP代表同一疾病的连续谱(Dimcevski等人，2007年)AP和CP具有不同的组织病理学、病因和时间进程(Dimcevski等人，2007年;Demir等人，2010年). 人们也普遍认为反复发作AP（RAP）会增加发生CP的可能性(Demir等人，2010年;Puylaert等人，2011年).

CP疼痛很常见，反映了胰腺传入（感觉）神经元的敏感性和神经源性炎症的发展(利德尔和内森，2004年;Anaparthy和Pasricha，2008年). 炎症使胰腺传入细胞接触炎症介质、内源性神经肽、免疫竞争细胞及其释放的细胞因子。如果不加检查，这个过程会导致导管破坏，最终导致神经损伤和过度兴奋。研究表明，与胰腺炎相关的疼痛和炎症需要表达瞬时受体电位（TRP）通道TRPV1和TRPA1的传入纤维，当靶向时，可以减弱小鼠实验性AP的发展(Nathan等人，2001年;Schwartz等人，2011年). 基于这些结果，有人提出，这种胰腺传入群体的活动是导致组织损伤和初始胰腺损伤恶化的神经源性炎症的原因。最近，我们报道了在一个由青霉素诱导的AP模型中，TRPV1和TRPA1 mRNA在胰腺传入中的表达和功能显著增加(Schwartz等人，2011年). 这些变化与7天内消退的胰腺白细胞浸润有关。传入功能的这些变化至少是部分炎症反应的原因，使用TRPV1或TRPA1拮抗剂的逆转证明了这一点。这些拮抗剂的应用显著降低了氯霉素诱导的AP和疼痛相关行为，两种拮抗剂联合使用产生的效应大于相加效应(Schwartz等人，2011年).

本研究使用了一种RAP模型（每周两次，持续10周），随着时间的推移，该模型会形成CP的特征，包括疼痛、纤维化和胰腺持续免疫细胞浸润。为了评估胰腺传入神经两种来源的相对贡献，我们分别研究了背根神经节（DRG）和结节神经节（NG）中的脊髓和迷走神经胰腺感觉神经元。我们在RAP的第三周确定了一个关键时期，在此期间，TRPV1和TRPA1拮抗剂的联合阻止RAP发展为CP。然而，如果在RAP第三周后开始联合TRP拮抗剂治疗，阻断TRP通道功能不再能够逆转胰腺炎症诱导的变化，这表明TRPV1和TRPA1依赖性神经源性炎症是AP向CP转变和疼痛相关行为所必需的。一旦发生转换并建立CP，疾病的进展就变得独立于这两个通道的活动。

材料和方法

动物。

实验在6至14周龄雄性C57BL/6小鼠（杰克逊实验室）上进行，该小鼠位于匹兹堡大学实验动物护理评估与认证协会认可设施内。小鼠可以获得水和食物随意所有方案均由机构动物护理和使用委员会批准。

手术程序和细胞标记。

所有手术均在无菌条件下进行。吸入4%异氟醚开始麻醉，并用2%异氟醚维持麻醉。为了逆行标记胰腺DRG和NG神经元，进行剖腹探查，暴露胰头，用微量注射器注射三次Fast Blue（FB；1%无菌盐水；注射总体积～5μl）。分别缝合腹部肌肉和上覆皮肤，让小鼠恢复至少4天，然后再进行任何其他操作。

Caerulein诱导的CP。

CP是通过反复注射胆囊收缩素类似物蓝绿色素（Sigma-Aldrich）诱导的。Caerulein在0.01年溶解米磷酸盐缓冲液（PB），每小时腹腔注射（100μl/次，50μg/kg），每周两次（星期二和星期五），每次8次，持续10周(图1). 对照（载具）小鼠接受PB注射。在最后一次注射蓝绿色素后（即每周两次注射1、3、6或10周后72小时），处死小鼠，迅速取出胰腺，用盐水冲洗，进行印迹，并进行组织学分级、髓过氧化物酶定量和免疫组化，以评估炎症程度。还采集、急性分离、培养（见下文）脊髓T9-12 DRG和NG，并通过单细胞逆转录酶（RT）-PCR分析TRPV1和TRPA1基因表达，或用于Ca2+成像实验。

保存图片、插图等的外部文件。对象名称为zns9991335780001.jpg

青霉素（caer）和TRP拮抗剂的疗程（10周）和治疗计划。通过腹膜内重复注射盲肠（50mg/kg，100ml/注射）每小时8次，每周两次，持续10周来诱导CP。每周两次腹腔注射TRPA1拮抗剂A-967079和/或TRPV1拮抗剂A-889425或载体（veh）：第一次caer或veh注射前1小时，注射后4小时。在caer治疗开始前3周或开始后3周开始拮抗剂治疗。

髓过氧化物酶测定和组织学。

如前所述进行髓过氧化物酶（MPO）检测(Schwartz等人，2011年). 小鼠吸入过量异氟醚，解剖胰腺，称重，添加到含有1.0 ml 0.5%十六烷基三甲基溴化铵（HTAB；Sigma-Aldrich）的烧杯中，并将其切碎。将内容物与另外2 ml HTAB一起转移到15 ml离心管中，并在均质30 s之前超声10 s。再添加2 ml HTAB，并将试管置于干冰上，直到所有样品都以类似方式制备。样品经过三次冷冻-解冻循环，离心两次，然后与MPO标准品（Calbiochem）一起装载到96 well板上。样品和标准品与O（运行）-二氯二胺（Sigma-Aldrich），每20秒在460 nm的平板读数器上读取15分钟。计算、绘制每个标准品的斜率，并用于计算每个样品的MPO活性/组织重量单位。

为了进行组织病理学评估，将组织包埋在石蜡中，切片（4μm），用苏木精和伊红染色，并由对治疗组不知情的病理学家进行编码检查。根据以下标准对胰腺炎的严重程度进行评分：表1，结果表示为炎症浸润和萎缩的0到3分。纤维化评分被细分为小叶内纤维化、小叶周围纤维化和小叶间纤维化评分，每个评分范围为0至3。总组织学评分是炎症浸润、萎缩和纤维化的综合评分。

表1。

青霉素治疗对胰腺组织学的影响

车辆卡鲁林
3周6周10周
炎症浸润01*2*2*
萎缩02*3*3*
纤维化03*3*3*

结果以中位数表示(n个= 6). 组织学参数采用盲法评分。数据通过Kruskal-Wallis单因素方差分析进行分析。

*第页<0.05，对于caerulein和vehicle。

免疫组织化学。

小鼠被深度麻醉（异氟醚），通过右心房灌注冰镇4%多聚甲醛（0.1）米PB、胰腺和神经节（DRG和NG）如上所述移除。在20%蔗糖中冷冻保护后，将固定组织包埋在最佳切割温度的复合物（Sakura Finetek）中，冷冻，并在20μm（胰腺）和14μm（DRG/NG）厚度下切片。一些胰腺组织切片用兔抗降钙素基因相关肽（CGRP）抗体（1:2000；Sigma-Aldrich）孵育，然后用Cy3-结合抗兔IgG（1:200；Jackson Immunoresearch）免疫标记感觉纤维。通过省略一级抗体来确认抗体特异性。使用大鼠抗F4/80抗体（1:1000；Abcam）和Cy3-结合抗鼠IgG抗体（1:200）对其他胰腺组织切片中的单核细胞和巨噬细胞进行染色。DRG和NG切片用兔抗pERK（1:600；细胞信号技术）培养，然后用Cy3-共轭抗兔IgG（1:200）培养。F4/80的特异性通过同型对照抗体（大鼠κ单克隆IgG）的免疫染色缺失来验证2亿, 1:1000; Abcam），表明F4/80抗体染色不是由于免疫球蛋白与免疫细胞上表达的Fc受体的非特异性结合。使用显微镜安装的数码相机（DFC340FX；徕卡）拍摄免疫染色组织切片。通过使用ImageJ设置8位灰度图像的亮度阈值，并计算免疫反应相对于胰腺区域的面积（比例），对免疫染色进行量化。为了确定胰腺切片中感觉纤维的大体分布，在每个观察区域（500μm×500μm）测定单位面积的神经纤维（CGRP）和单核细胞（F4/80）密度。为了减少组织载玻片之间的差异，对照组和盲囊素治疗的胰腺被安装在相同的载玻片上。

细胞培养。

对小鼠进行深度麻醉（异氟醚）并灌注冰镇钙2+/镁2+-游离Hanks平衡盐溶液（Invitrogen）。如前所述，快速解剖T9–12 DRG和NG并分别制备用于培养(Schwartz等人，2011年). 将分离的细胞重新悬浮在含有10%胎牛血清和抗生素（青霉素/链霉素，50 U/ml）的DMEM/F12培养基（Invitrogen）中，并将其涂布在聚乙烯上-d日-赖氨酸（5 mg/ml）涂层玻璃盖玻片。培养基中未添加其他生长因子。细胞在37°C下孵育过夜，仅研究FB标记的胰腺T9-12 DRG和NG神经元。

钙成像。

用2.5μ米钙的浓度2+指示剂fura-2 AM酯与0.025%Pluronic F-127在室温下放置20分钟。将FB标记的神经元放置在记录室中，并与含有以下物质（单位：m米)：130 NaCl，3 KCl，2.5 CaCl2，0.6 MgCl2，10 HEPES，10葡萄糖，pH 7.4，渗透压325 mOsm，速率为1 ml/min。荧光数据通过CCD相机（RTE/CCD 1300；Roper Scientific）在运行Metafluor软件（分子器件）的PC上采集。比率(对)在用药期间，以1 Hz的频率获得340/380 nm激发（由λ10-2滤波器转换器（Sutter仪器）控制）的荧光发射（510 nm）。所有药物均使用计算机控制的灌注快速步长系统（切换时间<20 ms；SF-77B灌注系统；华纳仪器）。细胞内钙2+浓度（[Ca2+]我)根据呋喃-2比率确定就地根据以下等式进行校准实验：

方程式图像

在哪里？K（K）d日是钙的fura-2的离解常数2+室温下，S公司f2/S公司b2型是在没有Ca的情况下380 nm信号激发的发射强度的荧光比2+、和对最小值和对最大值分别是最小和最大荧光比率。这些变量的确定已在前面详细描述(Grynkiewicz等人，1985年;Kao等人，1994年;Lu等人，2006年). 50米的简短应用（4秒）米KCl（高K+)用于引起[Ca的增加2+]我，后来被称为Ca2+瞬态。诱发钙的幅度和衰减2+瞬态被分析为峰值诱发的Ca2+以及达到峰值50%的时间。对高K无反应的细胞+没有进一步研究。在10分钟恢复期后，将细胞暴露于TRPV1激动剂辣椒素（CAP；500 n米; Sigma-Aldrich）或TRPA1激动剂芥末油（MO；100μ米; Calbiochem）用于20 s。储备溶液（10 m米乙醇或100 m中的CAP米每日新鲜制备1-甲基-2-吡咯烷酮中的MO和工作稀释液（浴溶液中）。CAP或MO反应性胰腺传入的患病率被确定为总健康（高K+响应性）FB阳性细胞。

单细胞RT-PCR和qRT-PCR。

如前所述进行单细胞RT-PCR和qRT-PCR分析(Schwartz等人，2011年). 简单地说，用大孔（～50μm）玻璃移液管收集单个FB标记的胰腺神经元，并将其放入含有RT混合物的微型离心管中。采用20U上标II（Invitrogen）进行RT-PCR。RT反应在65°C培养1.5分钟，室温培养2分钟，然后在37°C培养20分钟，65°C添加20 U上标II后培养10分钟。在每个实验中，阴性对照包括省略RT或使用无细胞浴吸引物作为模板。胰腺感觉神经元的第一链cDNA被用作PCR模板，包含1×GoTaq公司反应缓冲液（Promega），20 m米外部底漆，0.2 m米dNTP和0.2 mlGoTaq公司DNA聚合酶（Promega）。反应在95°C下孵育10分钟，然后在94°C/30 s、52°C/30和72°C/30秒下循环35次，然后在72°C下进行最终延伸步骤10分钟。每个初始PCR产物用作后续PCR的模板，使用嵌套引物对，其产物在2%琼脂糖-溴化乙锭凝胶上电泳并拍照。仅对产生可检测到的看家基因扩增（GAPDH）的神经元进行了进一步分析。对于qRT-PCR，使用上述PCR条件对表达目标基因的细胞的第一链cDNA进行预扩增（26个周期）。在应用生物系统5700实时热循环中，使用ABsolute QPCR SYBR Green ROX混合物（ABgene）将产物用作实时PCR模板。记录阈值循环（Ct）值作为初始模板浓度的测量值，并使用GAPDH作为参考标准，通过ΔΔCt方法计算RNA水平的相对折叠变化。通过比较在线性窗口内直接从单个扩增曲线计算的PCR效率（GAPDH 1.77，TRPV1 1.79，TRPA1 1.83）和不同程度的预放大样品中保留的ΔCt值（ΔCt-difference±0.08 cycle），检验ΔΔCt方法的有效性和预放大的均匀性，分别是。

TRP受体拮抗剂。

每周两次（星期二和星期五）腹腔注射TRPV1拮抗剂A-889425和/或TRPA1拮抗剂A-967079（50–300 mg/kg；雅培实验室）或溶媒：第一次注射caerulein或溶媒前1小时，后4小时(图1).

行为测试。

为了评估与疼痛相关的行为，将经溶媒和氯霉素治疗的小鼠放置在25厘米见方、40厘米高的有机玻璃盒中，每周早上用光电监测其探索行为15分钟。光电束的间距为1.5厘米，提供0.75厘米的空间分辨率。TruScan软件（Coulbourn Instruments）用于分析在盒子的不同部分花费的时间、路径信息、行进距离以及在X-Y平面上同时进行的总移动。该软件还分析了每只小鼠在“垂直面”或需要伸展腹部肌肉的站立位置上花费的时间，该位置被认为在出现腹部超敏反应时会感到不适。在长期联合TRPV1和TRPA1拮抗剂治疗后，以及在不同的小鼠中，在治疗后时间点前30分钟注射吗啡（2.0 mg/kg，皮下注射）后，评估探索行为的调节。

数据呈现和分析。

数据以平均值±SEM表示，并使用SigmaStat软件（3.1版；Systat软件）进行分析。使用双向ANOVA和Holm-Sidak对多组随时间变化的差异进行统计分析事后（post-hoc）测试。使用Student’s吨测试（比较两组时）或单向方差分析（比较两个以上组时），然后事后（post-hoc）Bonferroni保护的成对比较。统计显著性设置为第页≤ 0.05.

结果

胰腺炎症

每两周给药一次的蓝精灵产生了CP的证据，如从第3周开始的广泛炎症性小叶内、小叶周和小叶间浸润、腺萎缩和胰腺纤维化所证明的那样(图2A–D). 盲法组织学评分显示，这些形态学变化在治疗6周和10周时最大(表1). 从第3周开始，在接受蓝绿色素治疗的小鼠中，胰腺MPO活性显著增加，并在第10周保持显著升高(图2E；F类(3,24)= 4.72,第页< 0.05). 注射了6周的青霉素的小鼠在10周后胰腺中的MPO活性仍然升高，尽管4周内没有出现青霉素激发(图2E类，填充方块）。MPO活性与组织学变化保持同步升高，这表明重复6周的caerulein治疗导致了不可逆损伤(图2E类). 在任何时候都没有观察到车辆处理小鼠的形态学或MPO活性发生显著变化，这也无法与未经处理的小鼠区分开来（数据未显示）。与形态和MPO活性的变化一致，图3A、 C类说明从第3周开始F4/80阳性单核细胞显著累积，持续10周(F类(4,30)= 4.86,第页< 0.01).

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重复注射溶媒（veh；A类)或3(B类), 6 (C类)、或10(D类)重复注射青霉素（caer；n个=6/组）显示明显的炎症浸润、萎缩和坏死。比例尺，40μm。E类，车辆胰腺中的MPO活性(n个=6/组）和caer(n个=8/组）-治疗小鼠。MPO活性（单位/毫克组织）从每两周注射一次caer的第3周开始显著增加，并在caer治疗的10周内保持升高；10周的车辆注射并未增加MPO活性。联合TRP拮抗剂（V1和A1拮抗剂各100 mg/kg；V1/A1；n个=6/治疗组）在第3周（<3wk）前开始的治疗使MPO活性在第3周降低了40%，MPO活性恢复到对照值。在第3周（V1/A1>3周）后开始的联合TRP拮抗剂治疗并不能阻止由cae产生的MPO活性增加。这些值与车辆处理小鼠有显著差异。在注射caer 6周的一组小鼠胰腺中，MPO活性在10周时仍显著升高(n个=6）尽管有4周的时间没有caer挑战*第页caer vs veh<0.05；†第页<0.05，caer vs caer+V1/A1<3周或>3周，Bonferroni双向方差分析事后（post-hoc）测试。

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胰腺单核细胞浸润和神经支配密度。A类，当在每两周一次的盲肠注射的3周（盲肠3周）和6周（盲肠6周）进行评估时，Caerulein（盲肠）治疗导致单核细胞（F4/80免疫反应圆形红细胞）浸润。TRP联合拮抗剂（V1和A1拮抗剂各100 mg/kg；V1/A1）在第3周（<3wk）前开始治疗，但在第3周（>3wk）后开始治疗时，单核细胞浸润减少。治疗效果量化于C类。B类Caer治疗还增加了胰腺CGRP免疫活性神经纤维（箭头所示）。TRP拮抗剂联合治疗（如上所述）在第3周前开始，但第3周后开始，阻止了CGRP免疫活性纤维密度的增加D类. *第页<0.05，caer vs veh）；†第页<0.05，caer vs caer+V1/A1<3周或>3周，Bonferroni单因素方差分析事后（post-hoc）测试。n个=6/治疗组。比例尺，100μm。

胰腺纤维密度

为了检测CP的进展是否改变胰腺的神经支配，用CGRP抗体对传入纤维进行免疫标记。在经载体治疗的小鼠中，胰腺实质内CGRP免疫染色稀少(图3B类). 相反，在每两周进行一次的青霉素治疗3周、6周和10周后，CGRP免疫染色密度（主要与大中型血管相关）显著增加(F类(3,24)= 4.21,第页<0.05），表明神经肥大伴随着CP的发生和发展，这与其他研究显示疾病状态下胰腺神经支配增加一致(Lindsay等人，2006年).

胰腺炎增加神经元TRP表达

车辆处理小鼠的大多数胰腺DRG神经元表达TRPV1和TRPA1的mRNA，而表达这些转录物的NG神经元明显较少(表2). 在任何时候，表达TRPV1或TRPA1转录物的胰腺DRG或NG神经元的数量在caerulein治疗后都没有显著增加(表2). 然而，对表达这些通道的胰腺神经元的实时定量PCR显示，在每个细胞的基础上，在治疗3周、6周和10周后，与载体治疗相比，蓝绿色治疗显著增加了胰腺DRG和NG神经元中TRPV1和TRPA1 mRNA的相对含量(表3).

表2。

蓝绿色素诱导胰腺炎前后FB标记胰腺神经元TRP转录物的表达

车辆卡鲁林
Caerulein+TRPV1/TRPA1
3周6周10周<3周>3周
TRPV1型
    DRG公司69%78%80%78%71%69%
    天然气*38%47%45%42%43%43%
TRPA1号机组
    DRG公司68%77%77%81%65%62%
    天然气*38%47%45%45%43%38%

数据经χ分析2测试。在所有组中，n个≥40个细胞。

*第页< 0.05. 在所有组中，NG组的TRPV1和TRPA1转录物显著低于DRG组。

表3。

CP中神经元TRPV1和TRPA1基因转录物的相对数量（与载体的倍数变化）

DRG公司
天然气
TRPV1型TRPA1号机组TRPV1型TRPA1号机组
卡鲁林
    3周2.03 (48)*2.13 (49)*2.65 (33)*2.40 (34)*
    6周2.62 (45)*2.58（42）*3.08（29）*3.32 (28)*
    10周2.86 (44)*2.83 (40)*3.39 (30)*3.31 (29)*
Caerulein+TRPV1/TRPA1
    <3周1.21 (42)†1.16 (41)†1.34 (28)†1.11 (31)†
    >3周1.99 (40)*1.91 (43)*2.26 (32)*1.68 (26)*

用于mRNA定量的细胞数量在括号中表示。数据采用单因素方差分析。

*第页与车辆相比<0.05；

†第页<0.05与使用Holm-Sidak治疗6周的caerulein比较事后（post-hoc）测试以比较各组。

TRP拮抗剂减轻胰腺变化

为了确定TRPV1和TRPA1通道活性是否有助于CP表型的发展，使用了两个TRP通道的选择性拮抗剂。当在RAP第3周前治疗时（并在第4周至第10周继续治疗），给予100或300 mg/kg剂量的TRPV1或TRPA1拮抗剂，但不是50 mg/kg剂量，可显著且剂量依赖性地减轻炎症，如在第6周评估的MPO活性降低所示(图4A类). 在车用治疗的小鼠中，TRPV1或TRPA1拮抗剂治疗均未影响形态学（数据未显示）或MPO活性（数据仅显示最大剂量；图4A类). 与单独使用100或300 mg/kg浓度的两种拮抗剂相比，联合使用100 mg/kg浓度两种拮抗物对降低MPO活性更有效，这表明这些拮抗剂的作用大于加性作用。此外，在第3周前开始的联合拮抗剂治疗（每次100 mg/kg）改善了胰腺的形态学变化(图4B类)，减少神经肥大(图3B、 D类；F类(1,12)= 6.01,第页<0.05），减少单核细胞浸润(图3A、 C类；F类(1,12)= 5.22,第页< 0.01). TRP通道拮抗剂还降低了在第6周和第10周时，在胰腺DRG和NG神经元中由蓝精灵产生的TRPV1和TRPA1 mRNA表达的增加(表3). 因此，TRP拮抗剂治疗在第3周前开始，并在随后的几周内持续，通过炎症、单核细胞浸润和胰腺高神经传导来评估，尽管持续每两周进行一次蓝精灵治疗，但阻止了CP的发展。

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TRP拮抗剂可减轻CP的炎症和形态学变化。A类TRPV1（V1）和TRPA1（A1）拮抗剂治疗均未影响载剂（veh）治疗小鼠的MPO活性(n个=6），但当在第3周之前给药时，每种拮抗剂都会剂量依赖性地减弱经蓝绿色素（caer）处理的小鼠的MPO活性。在第3周前开始的联合拮抗剂治疗[caer+V1/A1（<3周）]，但在第3周后开始的联合对抗剂治疗[caer+V1/A（>3周）]MPO活性显著减弱（剂量单位为毫克/千克，单位为巴；n个=5–8/治疗组；F类>所有组均为7.8）*第页caer vs veh<0.01；†第页caer vs V1或A1单独<0.01，Bonferroni单因素方差分析事后（post-hoc）测试。B类在注射veh 10周或caer（caer-6wk）6周后，在第3周（<3wk）前或每两周一次的caer治疗第3周后开始进行V1/A1拮抗剂联合治疗（每次100 mg/kg），进行典型的胰腺组织学检查。比例尺，100μm。

相反，当开始治疗时之后第3周（持续到第10周），单一或联合TRP拮抗剂治疗均不影响RAP向CP的进展，这表明在第2周和第3周之间存在一个关键期，在此期间过渡到CP（以及相关的疼痛相关行为；见下文）可以通过减少或阻断RAP的神经原成分来预防。为了进一步检查这一明显的关键期，仅在第2周和第3周给予TRP拮抗剂联合治疗，并在此后的第10周监测MPO活性。图2E类表明，在每两周一次的青霉素治疗1周或2周后，MPO活性没有增加，但在治疗后（第3-10周）显著增加。在第2周至第3周进行TRP拮抗剂联合治疗后，当在第3周后进行检测时，MPO活性降低了40%，并且在没有进一步的caerulein治疗的情况下，MPO活动恢复到对照值。

TRP拮抗剂减轻疼痛行为

与可以机械扩张的中空器官的超敏反应评估不同，胰腺超敏反应的评估是间接的，依赖于对旷野行为的评估(Schwartz等人，2011年). 重复注射蓝绿色素可减少野外活动和垂直直立（与车辆注射相比），行为与疼痛和不适一致(图5). 联合使用TRPV1和TRPA1拮抗剂（各100 mg/kg；F类(2,18)= 5.22,第页<0.05）如果在第3周之前开始治疗，但如果在第三周之后开始治疗(图5). 在关键期后阻断TRPV1和TRPA1通道并没有减弱伤害性行为，这与上述发现一致（例如炎症、过度神经支配）。为了证实疼痛确实被TRP拮抗剂阻断，在10周测试前30分钟给予阿片类镇痛剂吗啡（2.0 mg/kg）。吗啡将开放场活性恢复到与TRP拮抗剂治疗小鼠相似的水平。

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TRP拮抗剂可逆转CP中的疼痛行为。野外活动监测显示，在水平面上移动的时间（以秒为单位）(A类)，总行驶距离（厘米）(B类)、和数字(n个)垂直面上的饲养事件(C类)与caerulein（caer）处理的小鼠相比，veh处理的小鼠的死亡率显著降低。在caer双周治疗的第3周[caer+V1/A1（<3周）]之前服用TRP拮抗剂（TRPV1和TRPA1均为100 mg/kg），并持续到第10周，可逆转caer产生的疼痛行为，而同样的治疗在第3周后开始[caer+V1/A1。在试验前30分钟给予吗啡（2.0 mg/kg皮下注射）显著降低了经caer治疗的小鼠的疼痛相关行为参数。所有数据均采用Holm-Sidak双因素方差分析法进行分析事后（post-hoc）测试，并且在所有情况下F类> 11.3. *第页<0.05 caer vs veh；†第页<0.05 caer vs caer+V1/A1<3周或>3周。n个=6/治疗组。

炎症增加[Ca2+]我和胰腺传入的诱发瞬变

细胞质钙严重调节许多细胞功能，包括神经递质释放、信号级联和膜通道功能(Berridge等人，2000年). [加利福尼亚州2+]我在CP进展期间显著增加(表4). 此外，去极化激发Ca2+施加50m产生的瞬态米KCl（高K+)与车用药物治疗的小鼠相比，用氯霉素治疗的小鼠的胰腺DRG神经元的峰值反应明显更大，衰减更慢（即达到峰值50%的时间），这表明持续性胰腺炎影响感觉神经元[Ca]的调节2+]我其他炎症性疼痛模型也有报道(Lu等人，2008，2010).

表4。

对[Ca的影响2+]我胰腺DRG体细胞的诱发瞬变

休息[钙2+]我（纳米）峰值响应（nm）50 mm KClT50（秒）50毫米KCl
车辆（30）59.2 ± 3.8*313.1 ± 17.1*47.6 ± 7.3*
卡鲁林
    3周（30）94.4±7.7*426.1 ± 31.7*86.9 ± 9.9*
    6周（21）81.0 ± 6.4*417.5 ± 24.7*98.6 ± 11.7*
Caerulein+TRPV1/TRPA1
    <3周（28）48.3±3.0†275.6 ± 23.6†60.8 ± 11.6†
    >3周（14）95.4 ± 5.2*398.3 ± 38.4*56.1 ± 10.1†

结果表示为平均值±SEM。括号中显示了用于量化的细胞数量。数据采用单因素方差分析。

*第页与车辆相比<0.05；

†第页<0.05与使用Holm-Sidak治疗6周的caerulein比较事后（post-hoc）测试以比较各组。

当在第3周前开始联合TRP拮抗剂治疗时，n只接受过氯霉素治疗的小鼠，既没有休息也没有高钾+-诱发Ca2+胰腺DRG神经元的瞬变与车用处理的神经元不同(表4). 相反，当联合TRP拮抗剂治疗开始时之后第3周，在接受氯霉素治疗的小鼠中，胰腺DRG神经元（在第6周收获）的静息[Ca显著升高2+]我和高K的振幅+-诱发Ca2+与车用治疗小鼠相关的短暂性变化，表明联合TRP拮抗剂治疗无法逆转这些由菜青素诱导的胰腺炎的后果。

与氯霉素治疗引起的TRPV1 mRNA增加相一致，对CAP反应的DRG神经元百分比（500 m）米)治疗后显著增加(表5)而对MO（100μ米)未增加，可能是由于受测MO浓度产生的上限效应。意外地。与载体治疗相比，TRP拮抗剂的联合给药降低了对CAP有反应的经事业单位素治疗的小鼠胰腺DRG神经元的百分比，无论何时给药。

表5。

CP前后应答者百分比的变化

响应者百分比
500纳米CAP100毫米MO
车辆20.0% (6/30)*30.0% (9/30)
卡鲁林
    3周47.1% (16/34)*55.9% (19/34)
    6周57.1% (12/21)*42.9%（9/21）
钙镁蛋白+TRPV1/TRPA1
    <3周10.3% (3/28)†32.1% (9/28)
    >3周7.1% (1/14)†*25.0% (7/14)

所有数据均采用χ分析2测试。

*第页与车辆相比<0.05；

†第页<0.05，对比6周后残留物矫正的caerulein。

我们还试图评估胰腺迷走神经传入神经元体细胞的变化，但未能获得可重复的结果。在大多数情况下，K值较高+应用TRP激动剂前的挑战导致基础[Ca不稳定2+]我波动和细胞死亡；低K+这一挑战产生了微弱、不可靠的反应。我们将其归因于胰腺迷走神经传入神经（多动作电位放电）在去极化时比其DRG对应神经（单动作电位放电；Schwartz等人，2011年).

胰腺炎增加DRG和NG中ERK的激活

在RAP的第3周，胰腺DRG神经元中的磷酸ERK（pERK）显著增加，这与上文报道的明显的caerulein诱导的解剖和炎症变化有关。有趣的是，在开始使用蓝绿色素治疗后的1周内，NG神经元的pERK免疫反应神经元的数量就增加了，这种增加持续到第10周(图6). 当在RAP的第3周之前开始给药，而在第3周之后开始给药时，联合给药TRP拮抗剂（每种100 mg/kg）显著减弱了pERK免疫反应神经元的caerulein诱导增加，进一步支持了该模型中向CP过渡的关键期。这些数据表明，在CP进展过程中，胰腺传入神经元的兴奋性增加，在向CP过渡之前，通过抑制TRPV1和TRPA1通道可以防止这种增加。

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CP中的神经元pERK免疫反应（IR）。胰腺T11 DRG中FB（绿色）、pERK（红色）和合并pERK/FB（黄色）的免疫荧光图像(A类)和NG神经元(B类)在第3周【caer+V1/A1（<3周）】之前或第3周后【caer+V1/A1，>3周】开始，给药小鼠服用溶媒（veh）-和caer-luein（caer-6wk）-，不使用TRPV1和TRPA1拮抗剂联合治疗（各100mg/kg）。veh-treated小鼠FB标记的T11和NG神经元的免疫荧光图像显示pERK无/罕见表达，而caer治疗后pERK/FB-IR神经元的数量显著增加。TRP拮抗剂治疗在第3周之前开始，但在第3周之后没有开始，显著减少了pERK/FB-IR神经元谱的数量，这在C类对于DRG和inD类使用Holm-Sidak对所有数据进行双向方差分析事后（post-hoc）测试(n个=6/治疗组）*第页caer vs veh<0.05；†第页<0.05，caer vs caer+V1/A1<3周或>3周。比例尺，50μm。

讨论

本研究揭示了表达TRPV1和TRPA1的胰腺传入在小鼠实验性胰腺炎模型中从RAP转变为慢性胰腺炎症和疼痛相关行为中的关键作用。TRPV1和TRPA1通道拮抗剂均显著降低或阻断胰腺炎症（MPO和单核细胞浸润）、胰腺纤维化、神经元萌芽以及TRPA1和TRPV1基因表达，尤其是联合用药时。此外，我们观察到疼痛相关行为的变化以及去极化钙动力学中的功能变化2+DRG胰腺传入的瞬态，与其他炎症模型中报道的一致(Lu等人，2008年，2010). TRPV1和TRPA1拮抗剂也显著降低或阻止了伤害性行为和传入兴奋性。持续的CP疼痛被认为是由致敏胰腺传入神经的活动维持的(Zhu和Roper，2001年;Xu等人，2007年). 以前的报告表明，DRG神经元中ERK1/2的激活（通过磷酸化）通过增加基因转录和/或目标蛋白的翻译后修饰而导致超敏反应(Aley等人，2001年;Averill等人，2001年;Obata等人，2003年;Dai等人，2004年). 在TRP拮抗剂治疗有效的关键时期，胰腺DRG和NG神经元中pERK的表达相应上调。这些拮抗剂仅在RAP第3周前开始治疗时有效阻止变化。这些结果表明，在无人协助的情况下，胰腺可以在有限的时间内从反复损伤中恢复（在本模型中为2周或4次AP），如果TRPV1和TRPA1拮抗剂阻止炎症进展，则可以提供额外的保护。

以前(Schwartz等人，2011年)，我们每8小时注射一次蓝绿色素诱导AP，并观察到胰腺形态的急性变化，这些变化相对较快地消失；24小时时明显水肿和炎症（由MPO测定），但第3天时减少一半，第7天完全恢复。有趣的是，即使是一次AP发作，胰腺传入TRPV1和TRPA1的表达和功能也会增加，持续3天(Schwartz等人，2011年). 目前的结果表明，在一个传入敏感性增强的环境中（第一次治疗后），每两周注射一次的青霉素可诱导CP，从而加剧神经源性炎症，放大RAP后续每一次发作所造成的损害。

TRP拮抗剂被认为是针对胰腺损伤时产生神经源性炎症的胰腺传入纤维(利德尔，2007年;Lieb和Forsmark，2009年). RAP损伤腺泡细胞，释放质子、缓激肽、硫化氢、血清素和钙2+可以使胰腺传入神经增敏(Detlefsen等人，2008年;Lieb和Forsmark，2009年). 这些炎症介质可以直接或间接上调大多数胰腺传入纤维中表达的TRPV1和TRPA1通道。因此，RAP可能会产生一个启动、前馈的胰腺环境，在该环境中，胰腺传入的敏化导致基因上调，从而进一步增加传入敏感性，导致额外的神经源性炎症。这可以解释TRP拮抗剂有效的关键时期的存在；事实上，在这个模型中，传入神经中TRP通道表达的持续增加始于3周。一旦这些通道上调，就很难限制神经源性炎症并防止胰腺永久性损伤。

本研究使用钙成像研究去极化钙动力学中的功能变化2+DRG胰腺传入的短暂变化，以及在CP进展过程中评估TRPV1和TRPA1受体的功能。我们的结果显示，所有测试参数（静息[Ca2+]我浓度、峰值反应和衰变时间），与给予青霉素6周的组相比，给予青霉素加TRPV1和TRPA1治疗3周的组显著降低。然而，用氯化物加TRPV1和TRPA1治疗3周后，峰值反应增加，到高K的衰减时间没有明显变化+与车辆处理相关；此外，休息时[Ca2+]我该水平与赋形剂有显著差异，与6周的蓝精灵治疗相似。这些结果引发了一系列有趣的问题，即Ca2+调节机制受TRP拮抗剂治疗及其方式的影响。根据诱发钙瞬变的动力学，峰值和衰减由不同的机制介导。峰值响应是通过电压门控钙通道的内流和通过钙诱导的钙从内部存储释放的输入的组合。衰变动力学最初通过线粒体进行缓冲，然后通过肌浆/内质网钙重新吸收到内部存储中2+-ATP酶（快速衰变阶段），然后通过Na进一步挤出细胞+-钙2+交换器和质膜钙2+-ATP酶（慢衰变期）。钙调节得到了高度控制，并且分离得相当好。响应幅度的增加不会直接反映在衰减时间中。利用药理学，人们可以独立操纵峰值和衰减动力学(Scheff等人，2011年). 在氯霉素治疗后3周和6周，炎症诱导的峰值和衰退都发生了变化，这表明钙至少发生了两种不同的变化2+失调：（1）内流/CICR机制增加，（2）再摄取/挤压改变。钙的选择性恢复2+-高K瞬态衰减时间+但不是高峰和休息期2+]我3周后开始的TRP拮抗剂治疗表明其对细胞机械钙的选择性作用2+胰腺DRG神经元的再摄取和挤压。

三周的RAP也使表达pERK的胰腺传入纤维数量显著增加，pERK是调节基因转录的激酶的激活形式，有助于传入超敏反应。该模型中的CP和疼痛相关行为可能与ERK调节TRPV1和TRPA1通道活性/功能有关。为了支持这种可能性，辣椒素诱导分离的DRG神经元产生热诱导电流需要ERK激活(Firner等人，2006年)并在行为研究中调节NGF和辣椒素诱导的热痛觉过敏(庄等，2004，2005). 此外，ERK激活介导NGF诱导的TRPV1表达上调(Bron等人，2003年;朱和牛津，2011年)，支持NGF在胰腺疼痛中的关键作用，并强调其对TRPV1表达和活性的调节(朱和牛津，2011年). 在初步实验中（未发表），发现MAPK1/2抑制剂U0126阻断ERK1/2信号传导可减少CP的炎症和疼痛行为。

激活的ERK也可能通过非TRP通道相关的胰腺传入改变而促进CP和疼痛行为。例如，在DRG神经元中，ERK激活被证明是外周炎症和神经病理性疼痛模型中BDNF和NPY上调的原因。抑制ERK磷酸化下调BDNF和NPY，并与降低超敏反应相关(Obata和Noguchi，2004年). 此外，ERK磷酸化还可以调节吗啡诱导的神经肽SP和CGRP的上调(马和比斯比，2000年;Ma等人，2001年).

总之，我们在这里记录了RAP导致胰腺组织不可逆的形态学变化和强烈的疼痛相关行为，这两者都与CP患者的临床变化相平行(Liddle和Nathan，2004年;利德尔，2007年). 在该模型中，这些变化可以在第四次之后、第七次实验诱导的急性胰腺炎发作之前的关键时期内被阻断（即，在每两周进行一次的青霉素治疗的第3周内）。从AP到CP的转变和疼痛相关行为伴随着胰腺传入纤维的变化，包括TRPV1、TRPA1和pERK的表达增加，所有这些都已被证明增加传入敏感性。TRPV1和TRPA1拮抗剂在预防组织学、免疫学和行为学变化方面的功效支持了这些分子的增加表达，这是该模型中负责向CP过渡的机制的一部分。因此，在RAP患者中，针对传入兴奋性的早期积极治疗可能会抑制进展为CP。

脚注

这项工作得到了美国国立卫生研究院（NIH；向E.S.S.拨款T32 DK063922，向E.S.S和G.F.G.拨款UL1 RR024153，向K.M.A.拨款R01 NS33730，向G.F.G拨款R01 DK093525和NS035790）以及国家研究资源中心的支持，NIH和NIH医学研究路线图的组成部分（拨款R01 NS035790、R01 DK093525和R01 NS0.33730、T32 DK063922和UL1 RR024153）。我们感谢迈克尔·伯彻姆（Michael Burcham）准备数据，感谢帕姆·科努特（Pam Cornuet）和蒂莫西·麦克默里（Timothy McMurray）提供技术援助，感谢迈克尔·S·戈尔德（Michael S.Gold）使用他的钙成像设备，感谢雅培实验室（Abbott Laboratories）慷慨赠送TRP拮抗剂A-967079和A-889425。

作者声明没有竞争性的经济利益。

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