声波刺猬（SHH）在人类腺癌及其前体病变中表达错误。SHH表达使用就地杂交检测SHH公司信使RNA和免疫组织化学（IHC）检测SHH抗体蛋白9胰腺组织取自20例胰腺癌切除标本。在组织学评估中没有异常或自溶证据的对照胰腺组织是从尸检标本或创伤胰腺切除中获得的。在正常成人胰腺中，胰岛、腺泡或导管上皮中未检测到SHH(). 然而，对腺癌患者胰腺的评估表明，SHH在70%的标本中异常表达。正常导管上皮不表达可检测到的SHH水平(); 然而，随着导管上皮细胞异型性程度的增加，PanIN-1至-3()观察到SHH的高表达。在腺癌样本的恶性上皮中也检测到SHH的表达(). 这种表达模式也被我们的就地杂交SHH公司信使核糖核酸(补充图1).
SHH的免疫组织化学鉴定。一，正常人胰腺。在腺泡、胰岛（I）或导管（D）中未发现SHH蛋白的特异性染色（×125放大倍数）。b条，正常导管上皮中未检测到SHH表达（放大500倍）。c（c），PanIN-1表达少量SHH（×500）。d日，PanIN-2表达中等水平的SHH（×250）。e（电子）、PanIN-3（×250）和（f），浸润性癌（×125）：SHH中高水平。
该途径的调控缺失与几种人类癌症有关10,11因此，为了确定SHH错误表达在成人胰腺中的潜在作用，对由胰腺特异性Pdx-1启动子驱动的SHH错误表达的转基因小鼠（H.Edlund的礼物）的胰腺进行组织学和免疫组织化学分析。
胃肠道病理学家（G.Y.L.）对三周龄Pdx–Shh小鼠共四个胰腺进行了组织学评估。这四种细胞都表达了胰腺上皮的显著肠道表型。这四种细胞都表现出类似胰腺癌前病变（PanINs）的异常管状上皮复合物形成。根据人类胰腺导管病变的病理分类方案，对这些异常上皮变化进行了描述和分类12。
转基因胰腺表现出混合表型，其特征是腺泡转化为腺体结构，腺体结构由嵌入细胞纺锤体基质中的高肠型上皮排列。局灶性化生上皮由柱状细胞组成，柱状细胞具有位于基底的细胞核和丰富的核上黏蛋白(). 该表型与人类PanIN-1相似()是胰腺癌发生的阶段性序列中的早期病变。此外，一些腺体的特征是分泌粘液的程度较低，但异型性程度较高，核紊乱、分层、有丝分裂和凋亡()，与人类PanIN-2相似，表现出更高程度的异常增生变化(). 根据胰腺癌的肿瘤进展模型，这些特征提示肿瘤潜能增加。
人类PanINs和Pdx–Shh小鼠胰腺的组织学比较。一，Pdx–Shh胰腺显示异常的肠上皮改变（箭头所示为丰富的核上粘蛋白），类似于人类PanIN-1(b条) (×500).c（c），Pdx–Shh胰腺（×500）也表现出较高程度的异型性，核紊乱和分层（长箭头）、有丝分裂（短箭头）和凋亡（箭头），类似于人类PanIN-2(d日) (×250).e（电子）,（f），Pdx–Shh胰腺的低倍（×125）视图(e（电子）)人腺癌中的管状复合体(（f）).克、Pdx–Shh小鼠（×500）和人类PanINs(小时)（×250）过度表达HER-2/neu（新）棕色染色（AD；导管上皮异常）。我，使用不匹配引物（突变K-ras）进行突变-等位基因特异性PCR扩增，以检测密码子12 K-ras突变。使用野生型引物（WT K-ras）作为对照。车道1和14，梯子；2、5、8、11，第一轮PCR（第一PCR）未显示出预期的可检测带。野生型小鼠只表达野生型K-ras（3、4道）。两个Pdx–Shh小鼠的异常胰腺上皮表达K-ras（9、12道）和野生型K-ras的TGT密码子12突变（10、13道），而Shh表达域外的Pdx-Shh小鼠胰腺外组织仅表达野生型K-rac（6、7道）。箭头标识70-bp放大器。
胰腺癌的组织学进展模式也与进行性基因改变有关13转基因小鼠胰腺在组织学上类似于PanIN-1和-2，也表达了在人类进展模型中观察到的一些早期基因改变。三种胰腺过度表达HER-2/neu（新）在上皮中(). 此外，初步数据表明，在两个胰腺中存在K-ras密码子12突变()：发现人类PanIN-1和PanIN-2病变发生变化14,15因此，Pdx–Shh小鼠发育出异常胰腺，其形态和遗传变化与人类导管PanIN相似。
刺猬（Hh）信号通过Shh与膜受体Ptc结合而激活。这种配体-受体相互作用抑制了Ptc功能，从而允许另一种跨膜蛋白平滑（Smo）的去表达，最终导致Hh通路的激活和Hh特异性基因的表达，其中之一是Ptc1（参考文献。16). 正常小鼠或人类胰腺中未检测到Ptc1表达（由IHC测定）(). 然而，Pdx–Shh小鼠的异常上皮中检测到Ptc1蛋白的表达()和人类肿瘤胰腺(). 此外，在人类肿瘤胰腺中，在异常上皮周围的反应性间充质细胞中也检测到PTC1().
刺猬信号通路。一——d日，Ptc1受体的免疫组织化学鉴定。在两种小鼠的正常腺泡、导管或胰岛中均未发现Ptc1受体(一)或人类(b条)胰腺。Ptc1（棕色染色）在Pdx–Shh小鼠的异常胰腺上皮中显著过度表达(c（c）)和人类胰腺肿瘤(d日). 在人类，PTC1也在围绕上皮的反应性基质（S）中过度表达。e（电子）——小时，光滑（Smo）的免疫组织化学鉴定。正常小鼠正常导管上皮（D）未检测到光滑(e（电子）)或人类(（f）)胰腺。在人类胰腺的散在细胞（SC）中很少检测到Smo；然而，在Pdx–Shh小鼠的异常上皮中检测到Smo（棕色染色）(克)和人类胰腺肿瘤(小时)（箭头）。所有图像的放大倍数均为×250。
Hh途径的另一个成员是Smo，它在人类肿瘤和小鼠转基因胰腺中同样过度表达。在正常人和小鼠胰腺中，IHC通常不会在导管或腺泡中检测到Smo。正常胰腺内偶尔可见导管细胞或散在腺泡细胞中的Smo(). 然而，Smo在Pdx–Shh小鼠的异常胰腺上皮中过度表达()以及人类腺癌和前体病变的上皮(). 在间质和异常上皮中过表达的Hh信号传导成员的鉴定表明，Shh的错误表达可能通过旁分泌和自分泌机制引起胰腺癌的许多形态学变化。为了确定HH途径在该肿瘤的恶性生物学行为中是否具有同等重要的作用，我们对胰腺癌细胞株进行了研究。
对20个人类腺癌细胞系进行HH信号成分表达筛选。这些细胞系来源于原发性肿瘤（例如，Panc系列Panc 01.28至10.05（参考。17))或肝、淋巴结和脾转移瘤（分别为CFPAC1、Hs 766T和SW 1990）。所有测试线路都表达了两个或多个HH信号成分，包括PTCH1型,SMO公司,HIP（热等静压）和GLI1型(补充图2). 因此，从原发性肿瘤和转移性肿瘤分离的胰腺癌细胞系中检测到持续的HH信号活性。
环磷酰胺，一种甾体生物碱，通过与Smo的直接相互作用抑制Hh信号18——20用于测试胰腺癌细胞是否需要HH信号来促进增殖和存活。最初对五种胰腺癌细胞系——BxPC3、Panc 01.28、CFPAC、L3.6sl和Panc 05.04进行定性评估。经过7天的治疗后，在对照样品中，包括未经处理的细胞或用非活性环胺类似物托马替丁处理的细胞，环胺对细胞密度或形态没有影响。相比之下，细胞系CFPAC、L3.6sl和Panc 05.04的细胞密度显著降低。形态学上，在治疗期间，大多数细胞从组织培养板上脱落，剩下的少数细胞出现再生障碍(和数据未显示）。
环胺治疗对胰腺癌细胞的影响。一5个未经处理（对照）或用10µM环胺处理7天的胰腺癌细胞系的细胞培养。b条，BrdU掺入后三种细胞系的代表性FACS直方图(n个= 4). 这个x个轴显示DNA含量，而年轴显示BrdU级别；垂直框标记凋亡细胞；虚线水平框标记增殖细胞。c（c），凋亡细胞的定量测定b条(n个= 4). 为了比较处理过和未处理过的细胞，将对照样品中凋亡细胞的数量调整为1。d日，以b条(n个= 4). 为了比较处理过和未处理过的细胞，将对照样品中的增殖细胞数量调整为1。误差线表示标准偏差。星号，P（P）< 0.05; 双星号，P（P）< 0.01. 烟雾−，无表情；SMOH公司+/−低水平表达；SMOH公司+，表达力强。
三种有代表性的胰腺癌细胞系-BxPC3-SMO公司低的，升3.6sl-SMO公司高的和Panc 05.04-SMO公司高的-在5-溴脱氧尿苷（BrdU）标记后，通过FACS分析定量测定环胺对增殖和凋亡的影响。环磷酰胺没有诱导细胞凋亡，只是略微减少了BxPC3的增殖-SMO公司低的控制细胞系。相比之下，细胞凋亡增加2.5至3.5倍，同时细胞增殖减少75至80%SMO公司高的环胺反应细胞系L3.6sl和Panc 05.04().
我们对五种细胞株的初步研究表明，只有一部分胰腺癌细胞株对环胺治疗敏感。这可能是激活SMO下游HH通路突变的结果，而SMO下游的HH通路不应被该拮抗剂抑制。为了确定对环胺治疗敏感的癌细胞株的百分比，我们将分析扩展到总共13株。分析的13行中有12行表示SMO公司; 其中一半（50%）对环胺治疗有反应。正如预测的那样SMO公司-阴性Panc 01.28细胞未受影响(补充图3). 因此，我们的数据表明，SMO下游HH途径的突变可能导致这些细胞的异常增殖。然而，我们不能排除其他HH依赖性途径的突变调节抗环丙胺胰腺癌细胞系增殖的可能性。
为了证明环胺诱导的癌细胞增殖抑制继发于HH通路的失活，一种含有TK最小启动子上游Gli-binding位点的Gli-luciferase报告子构建物21转染到对照细胞系和环胺反应细胞系。GLI1是Hh途径的下游转录因子和转录靶点22所有受试细胞系均表达GLI1(补充图2)，转染Gli-reporter结构导致荧光素酶活性显著升高(补充图4a)进一步表明Hh信号在腺癌细胞中是活跃的。用环胺处理转染细胞可消除反应细胞系中的荧光素酶活性，而对照细胞的荧光素酶活性仅略有降低。因此，在培养的人胰腺癌细胞系中，活跃的HH信号对细胞存活和增殖至关重要。
作为环胺抑制肿瘤细胞增殖能力的更明确测试，将对照细胞（BxPC3）和环胺反应细胞（L3.6sl和Panc 05.04）皮下注射到免疫功能受损的裸鼠体内(). 采用了两种治疗模式——同时或延迟治疗——在肿瘤植入时（同时）或皮下肿瘤可触及时（延迟）给予环胺。给予环磷酰胺或载体对照剂7天，然后切除肿瘤并称重。在延迟治疗模型中，对照组和经环胺处理的BxPC3之间的体重没有差异-SMO公司低的肿瘤(). 相比之下，Panc 05.04和L3.6sl衍生肿瘤的肿瘤质量分别减少了50-60%()-并行治疗模式的疗效更为显著，显示L3.6sl衍生肿瘤的肿瘤质量减少了84%().
环磷酰胺治疗阻断人胰腺癌细胞移植到裸鼠体内后肿瘤的形成。一，肿瘤细胞和环磷酰胺/载体注射部位示意图。b条，来源于对照或经环丙胺处理的L3.6sl和Panc 05.04腺癌细胞的孤立肿瘤。在可触及的肿瘤形成后（延迟）或在注射肿瘤细胞的同时（同时）开始注射维拉帕米/载体。所有图片都以相同的放大倍数显示。c（c），孤立肿瘤的重量。将每个细胞系的未治疗对照肿瘤调整为1，以便比较肿瘤质量的相对变化。对于延迟注射环磷酰胺/载体，值为：BxPC3，对照1(n个=6），环胺1.1(n个= 5); Panc 05.04，控制1(n个=5），环胺0.48(n个= 4); L3.6sl，控制1(n个=5），环胺0.39(n个= 4). 同时注射环胺/溶媒的值为：L3.6sl，对照1(n个=4），环胺0.16(n个= 4). 误差线表示标准偏差。双星号，P（P）<0.01。d日——小时，环磷酰胺治疗L3.6sl衍生肿瘤效果的组织学分析。d日,e（电子）外周肿瘤区域切片的血红素/伊红染色。（f）,克，对照组凋亡细胞的TUNEL染色(（f）)和经环胺处理的(克)肿瘤。小时，对照（蓝色）和环胺治疗（红色）肿瘤中TUNEL阳性细胞的定量。误差条表示s.e.m.双星，P（P）<0.01。
L3.6sl衍生肿瘤（延迟治疗）的组织学分析显示，未经治疗的对照组中存在致密的上皮细胞团，而经治疗的肿瘤表现为松散的上皮细胞聚集物，其间散布着大量的间充质细胞(). TdT-介导的dUTP缺口末端标记（TUNEL）分析表明，与未经治疗的对照组相比，环胺治疗导致凋亡细胞增加6倍(). 因此，两者在体外和体内实验表明，HH信号对增殖和生存至关重要，因此可能是人类胰腺腺癌恶性生物学行为的重要介质。
HH信号在胰腺发育中起关键和核心作用，并在突变时导致恶性转化，这一观察结果促使我们询问其在胰腺癌中的潜在作用16,23——25我们的实验使我们相信HH信号的错误调节在人类胰腺导管腺癌的早期发病中起着关键作用，在后期的维持中起着重要作用，这一假说得到了随附论文中研究结果的支持31我们的证据基于Pdx1–Shh转基因小鼠胰腺和人类腺癌的对比分析。我们发现HH信号成分在正常人导管上皮中未检测到，但在胰腺前体（PanIN）和浸润性病变中强烈表达。当Shh在Pdx–Shh小鼠中错误表达时，我们检测到异常胰腺的存在，其特征在组织学、免疫组织化学和遗传学上与人类PanIN病变相似。此外，我们对人类胰腺癌细胞株的分析表明，HH信号通路对细胞分裂和抑制凋亡都是必需的。一个重要但尚未解决的问题是，在HH信号增强时转化的胰腺细胞的身份。尽管胰腺干细胞尚未被分离出来，但其他组织的研究结果表明，祖细胞中HH信号的增加可能引发癌症的形成。未来的研究需要阐明HH活性在干细胞介导的组织再生和胰腺腺癌中的作用。
胰腺癌是美国第四大癌症死亡原因，仍是一种无法治愈且快速致死的疾病，5年生存率不到3%。许多因素导致了这种不良预后，但归根结底，正是我们对与该肿瘤的发病机制和进展有关的分子决定因素缺乏了解，限制了我们设计有效治疗方法的能力。HH通路在胰腺癌发生和维持中的作用的鉴定表明，该通路可能有望成为新的诊断和治疗方法。
方法
组织准备
人体组织标本是根据马萨诸塞州总医院IRB批准采集的。存档标本按照标准机构协议用福尔马林和石蜡包埋固定。野生型和Pdx–Shh小鼠组织固定在4%多聚甲醛中，然后如上所述嵌入石蜡。将组织切割成4–6-µm的切片，并应用于带电的ProbeOn Plus载玻片（Fisher）。
转基因小鼠
最初的胰腺组织（H.Edlund的礼物）是B6/CBA背景。通过原核注射非1/Bam含有4.5千碱基（kb）的H1表达盒不是1–不适用在2.6kb前克隆的Pdx启动子的1个基因组片段Xho1号机组全长大鼠碎片嘘如前所述，互补DNA（载体也是H.Edlund的礼物）进入B6/C3F1背景26。
免疫组织化学
如前所述完成了单抗体检测26，对方案进行了以下修改：内源性过氧化物酶活性用3%H阻断2O（运行）2室温下在甲醇中放置10分钟。通过在0.01 M柠檬酸钠（pH 2.0、6.0或8.0）中煮沸组织10分钟，实现抗原回收。首先在室温下用10%的NGS在TBS中封闭组织40分钟，然后用链霉亲和素和生物素分别在37°C下封闭组织20分钟。所有初级抗体在4°C下培养过夜。使用的主要抗体为：Shh、Ptc1和Smo（1:250；Santa Cruz）。次级生物素化抗体（Vector Laboratories）在室温下以1:500稀释1小时。通过标准DAB协议，通过棕色色素沉着观察蛋白质的检测。玻片用苏木精轻微复染。
K-ras密码子12突变的检测
突变等位基因特异性扩增方法用于检测K-ras密码子12突变，如前所述27,28从显微解剖的胰腺中提取DNA。用于K-ras第一轮PCR扩增的引物为K12正向引物5′-CGCGCGGCTGATACTGA-3′和K12反向引物5’-TCGTAGGTCATCATCC-3′。PCR条件为：94℃1 min，54℃1 min和72℃0.5 min，共20个周期。然后在类似条件下，对2.0µl第一反应进行第二次PCR，再进行40个循环，使用不匹配的引物或野生型引物作为新的上游引物来扩增特定突变带（GGT到TGT），或产生72碱基对（bp）突变或71 bp野生型片段。第二个PCR下游引物序列为K12 R nest-in 5′-CACAAAGTGATTCTGAATTA-3′。错配的上游引物序列是突变体K12（TGT）5′-TTTGTGGTGGTGAGCTT-3′；野生型序列为WT K12 5′-TGTTGGGTGGTGGAGCTG-3′。扩增子在10%TBE聚丙烯酰胺凝胶上运行，并用SYBR绿（分子探针）染色。
细胞培养
人胰腺癌细胞系HPAC、SW1990、Mpanc-96、SU86.86、PL45、Panc 10.05、Panc 8.13和Panc 2.03来自美国组织培养库；细胞系MiaPaCa2、Panc-1、CFPAC1、HPAFII、Capan-2、AsPC1、Hs766T和BxPC3是先灵葆雅赠送的。细胞系COLO357、L3.3、L3.6sl和L3.6pl是I.Fidler的礼物；细胞系Panc 3.07、Panc 5.04、Panc 2.13、Panc 6.03、Panc 4.21和Panc 1.28是来自E.Jaffee的礼物。BxPC3和所有Panc细胞系在添加了10%胎牛血清的RPMI培养基（Gibco）中生长，我-谷氨酰胺和青霉素/链霉素；Panc细胞系培养基中还添加了胰岛素-转铁蛋白-硒（Gibco）。CFPAC、Panc1、L3.6sl和L3.6pl细胞系在不含酚红（CellGro）的DMEM中生长，并补充10%胎牛血清。为了测试环胺反应性，细胞在含有托马替丁（Sigma）或DMSO的对照培养基或含有环胺的实验培养基（10µM，多伦多研究化学品公司；环胺剂量-反应如所示补充图4b). 我们每两天换一次培养基。显示细胞形态的图片是用尼康Eclipse TE300拍摄的。
BrdU掺入分析
细胞在含有tomatidine（对照，Sigma）或环胺（10µM，Toronto Research Chemicals）的培养基中培养3或4天。每48小时更换一次培养基。在培养的最后2小时内，用10µM BrdU对细胞进行脉冲处理。用异硫氰酸荧光素结合的抗BrdU抗体（BD Biosciences）检测BrdU；总DNA用7-AAD染色。根据BD Biosciences BrdU流动试剂盒说明书进行FACS分析。S期细胞被定义为包含BrdU的细胞群，DNA含量在2N个和4N个根据手册，凋亡细胞被定义为DNA含量低于二倍体数量的G0/G1细胞亚群。
同种异体移植治疗体内
同种异体移植治疗体内根据参考进行。19稍作修改。总共0.1 ml Hanks平衡盐溶液和含有2×10的基质凝胶（1:1）6将细胞皮下注射到CD-1裸鼠体内。肿瘤生长4天，最小体积为125 mm三; 所有受试者同时开始治疗。每天向小鼠皮下注射载体（三油酸：乙醇4:1 v/v）或环胺悬浮液（每只小鼠1.2 mg，三油酸∶乙醇4:1 v/v），持续7天。在治疗期结束时，从小鼠身上切除肿瘤，称重，然后在4°C下用4%多聚甲醛固定3小时，包埋在石蜡中并切片（6µm）。如前所述，使用重组Tdt（Invitrogen）通过TUNEL鉴定凋亡细胞29然后用曙红对切片进行复染。从两个对照组和两个环丙胺治疗的肿瘤的外部、中部和内部对应的区域中随机选择8×20放大视野。我们手动计数TUNEL阳性细胞核的数量。如前所述进行血红素/曙红染色30。
