摩尔癌症研究。作者手稿；PMC 2014年6月1日提供。
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美国国立卫生研究院：美国国立卫生研究院454934
肺癌相关成纤维细胞的代谢改变与肿瘤糖酵解代谢增加相关
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维伦德拉·K·乔德里
1纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065
三纽伯格伯曼肺癌研究中心，威尔康奈尔医学院，纽约，邮编10065
格雷戈里·萨兹勒
2纽约州纽约威尔康奈尔医学院心胸外科胸外科
三纽伯格·伯曼肺癌研究中心，纽约州纽约威尔康奈尔医学院，邮编：10065
萨利哈·迪克
1纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065
三纽伯格·伯曼肺癌研究中心，纽约州纽约威尔康奈尔医学院，邮编：10065
爱德华·D·卡罗利
6Metabolon公司，北卡罗来纳州达勒姆，27713
罗伯特·莫尼
6Metabolon公司，北卡罗来纳州达勒姆，27713
布伦登·M·斯蒂尔斯
2纽约州纽约威尔康奈尔医学院心胸外科胸外科
三纽伯格·伯曼肺癌研究中心，纽约州纽约威尔康奈尔医学院，邮编：10065
Olivier Elemento公司
4纽约州冷泉港冷泉港实验室
纳赛尔·K·阿尔托基
2纽约州纽约威尔康奈尔医学院心胸外科胸外科
三纽伯格·伯曼肺癌研究中心，纽约州纽约威尔康奈尔医学院，邮编：10065
蒂莫西·麦格劳
1纽约州纽约市威尔康奈尔医学院生物化学系，邮编：10065
2纽约州纽约威尔康奈尔医学院心胸外科胸外科
三纽伯格·伯曼肺癌研究中心，纽约州纽约威尔康奈尔医学院，邮编：10065
1威尔康奈尔医学院生物化学系，纽约州纽约市10065
2纽约州纽约威尔康奈尔医学院心胸外科胸外科
三纽伯格·伯曼肺癌研究中心，纽约州纽约威尔康奈尔医学院，邮编：10065
4纽约州冷泉港冷泉港实验室
5纽约州纽约威尔康奈尔医学院生理和生物物理系，邮编：10065
6Metabolon公司，北卡罗来纳州达勒姆，27713
#共同回应和资深作者
- 补充资料
1
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2
GUID:49814EE4-D8FF-44D7-AC64-253B5A79D1BE
总结
癌细胞会进行代谢重编程，但对肿瘤内其他细胞的代谢变化知之甚少。我们使用基于质谱的分析和基于代谢途径的系统分析，将21种原发性人类肺癌相关成纤维细胞系（CAFs）与相邻非肿瘤肺组织产生的“正常”成纤维细胞系（NFs）进行比较。尽管CAF支持肿瘤的机制尚未阐明，但CAF具有促肿瘤原性。我们已经确定了一些代谢产物丰度在全球范围内区分CAF和NF的途径，这表明代谢改变并不局限于癌细胞。此外，我们发现来自高和低糖酵解肿瘤的CAF之间的代谢差异，这可能反映了CAF与肿瘤糖酵分解能力相关的不同作用。其中一个变化是CAF中二肽的增加。二肽主要来源于蛋白质的分解。我们发现CAF中基础大分子自噬增加，这可能是二肽增加的原因。此外，我们还证明了CAF和NF在诱导葡萄糖降低促进的自噬方面的差异。总之，我们的数据表明，自噬增加可能是CAF和NF之间代谢差异的原因，并可能在肺癌中发挥其他尚未确定的作用。
简介
肿瘤由构成肿瘤微环境的恶性肿瘤细胞和基质细胞组成。研究工作主要集中在了解肿瘤上皮成分的生物学，从而确定癌细胞中失调的基因和信号通路。肿瘤块的非上皮细胞成分虽然本身不是恶性的，但通过支持癌细胞在致癌过程中发挥着重要作用(1,2). 肿瘤微环境中的癌相关成纤维细胞（CAF）具有促肿瘤原性，尽管CAF的确切功能尚未完全阐明(三,4). CAF的拟议功能包括分泌生长因子、促血管生成VEGF和/或重塑细胞外基质的蛋白酶(5-9). 不同研究中确定的CAF不同的促肿瘤活性可能反映了CAF的肿瘤类型特异性作用。
增殖需要促生长信号和适当的营养环境。癌细胞通常具有主要的糖酵解代谢，即“Warburg效应”(10,11)，这是某些肿瘤生长所必需的[例如(12)]. 新出现的观点是，以糖酵解代谢为主的依赖支持了癌细胞的合成代谢需求，而牺牲了葡萄糖高效生产ATP的能力(11). 关于肿瘤微环境中基质细胞可能发生的代谢变化，目前知之甚少。基质细胞代谢的改变可能对癌细胞有利，如基质细胞代谢与癌细胞代谢偶联的情况[例如(13)].
在这里，我们使用基于质谱的46个代谢途径/组203种生化物质丰度分析，比较原发性人类肺部肿瘤CAF与从距离肿瘤至少5cm的非肿瘤肺组织分离的“正常”成纤维细胞（NF）。我们发现了区分CAF和NF的几种代谢途径的差异，这表明细胞代谢的改变不仅限于肿瘤的上皮癌细胞。此外，我们发现CAF和NF之间的差异与肿瘤的糖酵解能力相关，其中之一是17个无关二肽的CAF相对增加。尽管与配对NF相比，来自糖酵解程度较低的肿瘤的CAF中的二肽也有所增加，但来自高度糖酵化肿瘤的CAFs与其配对NF之间的二肽相对差异最为显著。出乎意料的是，与糖酵解较少的肿瘤相比，从高糖酵化肿瘤患者肺组织中分离出的NF中二肽也增加了，提示肿瘤特异性场效应延伸超过5cm，或广泛炎症或其他原发性实质环境诱导NFs代谢改变。二肽产生于蛋白质的分解。在CAF中，我们发现自噬增加的证据，这是一种溶酶体相关的分解代谢机制，可能解释了二肽增加的原因。我们还发现，将培养基中的葡萄糖量从25 mM减少到5 mM会导致NF中的二肽和自噬增加，但不会导致CAF中的自噬，这表明CAF和NF对葡萄糖诱导自噬具有不同的设定点。越来越多的证据表明，癌细胞中增加的降解途径（例如自噬）可能作为应激反应机制，在肿瘤维持和化疗抵抗中发挥作用(14-16). 我们的研究提供了证据表明，自噬和溶酶体容量增加是人类肺CAF的特征，这些改变可能有助于CAF的促肿瘤活性。
材料和方法
人体受试者
临床研究()是机构审查委员会批准的对非小细胞肺癌患者前瞻性汇编胸部手术数据库的审查（2000年2月至2009年12月）。患者同意被放弃。手术切除肿瘤（I-III期）和记录的SUV患者最大值正电子发射断层扫描的值被认为符合本综述的条件（n=693）。患者被分为两组，即SUV患者最大值≥8辆（n=231，33%）和SUV最大值≤5（n=350，50%）。通过Kaplan-Meier（KM）生存分析评估队列（从手术日期到复发或死亡）的无病生存率（DFS）。采用对数秩检验对两组DFS进行比较。中位随访时间为23个月。
高肿瘤SUV最大值（SUV≥8）与减少相关无病生存2000年2月至2009年12月581名非小细胞肺癌患者的无病生存率（按SUV分类）最大值（SUV≥8:n=231；SUV≤5:n=350；中位随访23个月）。
细胞
在机构审查委员会批准的一项研究中，细胞来源于切除的肿瘤和邻近的非肿瘤组织。患者同意在本研究中使用来自其组织的细胞。切除后2小时内处理的组织用剃刀切碎，并在37°C下搅拌，在1 mg/ml胶原酶D中培养60分钟。将材料通过70μm的筛子，溶解红细胞，并在HEPES-buffered DMEM（25 mM葡萄糖）中广泛洗涤，然后在补充有10%胎牛血清（FBS）的DMEM中电镀。当培养物达到约80%的融合时，细胞通过传代和生长进一步扩大。细胞颗粒（≥2.5×106细胞）用磷酸盐缓冲盐水清洗，在干冰乙醇浴中快速冷冻，并储存在−80°C。在某些情况下，细胞在5mM葡萄糖-DMEM-10%胎牛血清中扩增。
质谱法
加入示例
收到的每个样本都被添加到Metabolon LIMS系统中，并由LIMS分配一个唯一标识符，该标识符仅与原始源标识符关联。该标识符用于跟踪所有样本处理、任务、结果等。LIMS系统跟踪样本（和所有衍生的小份）。创建新任务时，LIMS会自动为任何样本的所有部分分配自己的唯一标识符；还跟踪了这些样本之间的关系。所有样品在加工前均保持在−80°C。
样品制备
样品使用汉密尔顿公司的自动化MicroLab STAR®系统制备。为了进行质量控制，在提取过程的第一步之前添加了回收标准。样品制备采用水甲醇萃取工艺，以去除蛋白质部分，同时最大限度地回收小分子。所得提取物分为四个部分：一个用于UPLC/MS/MS分析（正模式），一个用于UPLC/MS/MS分析（负模式），另一个用于GC/MS，还有一个用于备用。将样品短暂放置在TurboVap®（Zymark）上，以去除有机溶剂。然后将每个样品冷冻并在真空下干燥。然后为适当的仪器（UPLC/MS/MS或GC/MS）制备样品。
超高效液相色谱/质谱（UPLC/MS/MS）
LC/MS基于Waters ACQUITY超高效液相色谱（UPLC）和Thermo-Finnigan线性阱四极杆（LTQ）质谱仪，该质谱仪由电喷雾电离（ESI）源和线性离子阱（LIT）质谱仪组成。将样品提取物干燥，然后在酸性或碱性与LC-相容的溶剂中重新配制，每个溶剂包含8个或更多固定浓度的注射标准品，以确保注射和色谱的一致性。一份样品使用酸性正离子优化条件进行分析，另一份使用碱性负离子优化条件，在两次独立进样中使用单独的专用柱进行分析。使用含有0.1%甲酸的水和甲醇梯度洗脱在酸性条件下重构的提取物，而同样使用水/甲醇的碱性提取物含有6.5mM碳酸氢铵。MS分析在MS和数据相关MS之间交替进行2使用动态排除进行扫描。原始数据文件已存档和提取。
气相色谱/质谱（GC/MS）
用于GC/MS分析的样品在真空干燥条件下重新干燥至少24小时，然后使用双三甲基硅三氟乙酰胺（BSTFA）在干燥氮气下衍生。GC柱为5%苯基，温度在16分钟内从40°C升至300°C。样品在使用电子碰撞电离的Thermo-Finigan Trace DSQ快速扫描单四极质谱仪上进行分析。该仪器每天进行质量分辨率和质量精度的调整和校准。从原始数据文件中输出的信息会自动提取，如下所述。
质量保证/QC
出于质量保证/质量控制的目的，每天的分析都包括额外的样本。这些样品包括一池特征良好的人类血浆的提取物、一小杯实验样品制成的血浆的提取物和加工空白液。QC样品均匀地分布在各注射之间，所有实验样品在整个过程中随机分布。将选择的QC化合物添加到每个样品中，以进行色谱校准，包括受试样品。仔细选择这些化合物，以免干扰内源性化合物的测量。
数据提取和化合物识别
使用Metabolon的硬件和软件提取原始数据、确定峰值并进行QC处理。这些系统是建立在利用微软的网络服务平台上的。NET技术，在高性能应用程序服务器和集群中的光纤通道存储阵列上运行，以提供主动故障转移和负载平衡。通过与纯化的标准品或反复出现的未知实体的文库条目进行比较来鉴定化合物。已获得2400多个商用纯化标准化合物，并将其注册到LIMS中，以分发到LC和GC平台，以确定其分析特性。
数据规范化
假设缺失值（如果有）低于检测水平。然而，假设在一个或多个组的所有样品中检测到的生化物质，而在其他组的样品中没有检测到，接近未检测到的组的检测下限。在这些情况下，缺失的值被替换为所有组内生物化学的最小值。然后将每个生化值归一化为细胞数，并按其中值进行缩放。将每个样品中的单个代谢物归一化为该样品中所有代谢物的中位数后，也对数据进行了分析。这种标度解释了由于所有代谢物丰度的变化导致的样品之间的任何差异，就像组间细胞大小存在差异一样。无论每个细胞系的数据是否按该细胞系的中值缩放，在所有比较中都获得了类似的结果。该样本中所有代谢物中位数的无标度和有标度的数据集见补充表1所示结果是无标度和有标度数据分析中常见的显著差异。
热图
热图数据按比例放大，以获得零均值和单位方差，方法是首先减去需要可视化矩阵的每一行的均值，然后将每一行除以其标准偏差。这提供了一个矩阵，其中每个代谢物浓度的平均值为零，标准偏差为1。
统计分析
使用MATLAB中的mattes函数对每种代谢物进行标准双尾和双样本t检验，对差异丰度进行非配对t检验，以计算Wilcoxont吨-比较两组的统计数据。然后使用非配对t检验对t核和倍数变化进行t检验（log2)根据分析要求分组的代谢物。然后根据Benjamini-Hochberg多重测试校正所述的假发现率调整结果p值。用随机洗牌重复相同的分析（104时间）（排列测试）。在这次洗牌练习中出现的概率小于0.05的结果被选为显著结果。利用生物信息学（4.0版）和统计学（7.6版）工具箱在MATLAB R2011b中完成了完整的分析。
为了分析分为7个主要组的生化物质，我们将该组代谢物的t-核分布（如上文所述，通过t-检验获得）与其余代谢物t-核的分布进行了比较。在对多次测试进行校正后，确定了每组比较的p值。为了分析分为46个亚组的生化物质，我们比较了t核的分布（如上所述从t检验中获得）和平均对数2-各组代谢物的倍数变化与其余代谢物相结合。通过假设方差不相等的正态分布进行非配对t检验来计算显著性。如上所述，获得了每个亚组的多次试验校正后的P值。从t核比较中选择调整后的p值<0.05的亚组（捕获数据方差），从平均倍数变化比较中选择了调整后的p值<0.05.的亚组。数据分析有两种方式，一种是将单个样品的代谢物按比例换算为该样品中所有代谢物的中值，另一种是不按比例换算。缩放前后的结果只有微小差异。显示的结果是两种不同分析方法所共有的组之间的显著差异。
pH值测量
如前所述测量溶酶体pH值(17). 细胞在补充有2.5 mg/ml荧光素-罗丹明标记葡聚糖（Invitrogen，Inc）的生长培养基中培养18小时。在该孵育之后，洗涤细胞并在生长培养基中再孵育3小时，以将葡聚糖追逐到晚期内体和溶酶体中。将细胞转移到含有10 mM葡萄糖的HEPES平衡盐溶液中，并通过荧光素和罗丹明通道的外荧光实时成像。为了构建pH校准曲线，将一组类似标记的细胞固定在含有莫能菌素的pH值为3、4、5、6、7和8的缓冲液中培养。这些细胞的成像设置与活细胞相同。使用变形软件量化罗丹明通道中识别的感兴趣区域（ROI）的罗丹明和荧光素荧光。固定细胞ROI的罗丹明-荧光素比值用于创建pH校准曲线，该曲线用于将pH值分配给活细胞的ROI。
LC3、Lamp-2A和Caveolin-1分析
成对的CAF和NF在6孔板（DMEM-Hams F12 1:1混合物，10%FBS）中培养至100%融合。细胞要么用30μM氯喹处理3或5小时，要么保存在正常生长介质中。蛋白质提取物在150μl 2×Laemmli缓冲液中制备，煮沸，超声处理，并在15%SDS-PAGE凝胶上运行。将膜与一级抗体孵育过夜：兔抗LC3B 1:1000（Invitrogen，Inc）；兔抗肌动蛋白1:5000（Cytosketon Inc.）；兔抗Caveolin-1抗体（BD Biosciences）；和抗Lamp-2A抗体（Abcam，Inc），并用二级抗体（山羊抗兔680 nm，1:5000）维持1小时。在LiCor成像仪上读取膜，并使用Odyssey软件（3.0版）进行量化。或者，在表观荧光显微镜下使用间接免疫荧光检测LC3自噬体。仅对经非氯喹处理的提取物进行Caveolin和LAMP-2A印迹。
结果
成对、非永生化肺癌相关和正常成纤维细胞系的分离
在一项机构审查委员会批准的研究中，我们通过长期培养从手术切除的原发性肺癌中产生了21个CAF系，并从距离肿瘤至少5厘米的非肿瘤性肺组织中获得了匹配的NFs，我们使用这些样本进行了CAF的质谱代谢组学分析(). 通过机械和胶原酶破碎处理肿瘤和非肿瘤组织，在添加10%FBS的生长培养基中培养出分散的异质细胞群。接种后1天，通过免疫荧光检测角蛋白表达和波形蛋白表达细胞(). 在没有传代的培养时间过长，角蛋白和波形蛋白表达细胞都会增殖，角蛋白表达细胞以上皮细胞特有的簇状生长。然而，通过传代扩大培养物后，只有表达波形蛋白的细胞在肿瘤和非肿瘤组织的样本中增殖(). 这些表达波形蛋白的细胞被进一步扩增并准备用于代谢组学分析。以前的许多研究都是通过培养分离CAF和NF系，而没有特定的富集步骤。为了与文献中的术语保持一致，我们将扩大表达波形蛋白的培养物称为CAF细胞系和NFs细胞系，尽管它们不是克隆系。扩张的CAF和NF培养物的生长速度并没有一致的差异。与21个CAFs/NFs配对线相关的相关临床数据见.
原发性非永生人肺CAF和成对NFA。创建研究中使用的CAF和NF线的方案流程图。
B。肺部肿瘤（CEM23）的分散细胞在培养基中保存了所记录的时间。细胞被固定、渗透并染色以检测波形蛋白（红色）和角蛋白（绿色）。箭头显示，在培养14天时，有一簇角蛋白阳性细胞未传代。图像采集时间为20×。
C、。来自图B所示肿瘤的细胞和在培养物中重复传代后的相应非肿瘤组织。细胞固定、渗透和染色如下。显示了相同的单元格字段。在左边的图像中，角蛋白呈假红色，中间的图像中波形蛋白呈红色，右边的波形蛋白为红色和αSMA绿色。在所有的图像中，DNA染色都是假蓝色的。在使用的培养条件下，波形蛋白阳性细胞增殖，而原始培养物（来自肿瘤和非肿瘤组织）的角蛋白阳性细胞则不增殖。因此，只有波形蛋白阳性细胞在重复在体外扩展文化的段落。在所示的例子中，CEM23 CAF高度表达αSMA，这是活化成纤维细胞的标记特征，而配对的CEM23 NF没有表达。以40倍采集图像。各个颜色的强度在所有图像中的缩放比例相同。
D。来自两个不同CAF和NFs对的细胞在体外多次传代后，进行波形蛋白（红色）、αSMA（绿色）和DNA（蓝色）染色。显示了每对CAF和NF的两个不同字段。这些数据说明了不同CAF和NF之间αSMA表达的异质性。在这两种情况下，CAF表达的αSMA多于配对NF。与CEM254相比，CEM248 CAF的αSMA表达相当均匀。一些CEM254 NF表达大量αSMA，而CEM254 nf的αSMA表达水平很低。
E.公司。通过Western blotting检测6对不同CAF和相应NF中caveolin-1的表达。抗体在大约20000道尔顿处检测到一个双抗体。肌动蛋白印迹可用于控制每条车道上装载的提取物数量。
F类来自三种不同CAF和NF对的细胞在体外多次传代后，进行小窝蛋白-1（绿色）和DNA（蓝色）染色。无论是在亚细胞定位还是在每个细胞的数量上，CAF和NFs之间的小窝蛋白-1表达都没有一致的差异。以40倍采集图像。在所有图像中，每个荧光颜色的强度都是相同的。
表一
| 标识符（CEM#） | 运动型多用途汽车最大值 | 组织学 | 肿瘤直径
（厘米） | 节点 |
|---|
| 16瓦 | 0.9 | 腺癌 | 1.5 | N个 |
| 16升 | 1.1 | 腺癌 | 1.1 | N个 |
| 15 | 1.3 | 腺癌 | 2 | N个 |
| 23 | 1.6 | 腺癌 | 1.5 | N个 |
| 248 | 1.7 | 腺癌 | 3.2 | N个 |
| 187 | 3.3 | 鳞状的 | 5 | Y（Y） |
| 166 | 4.7 | 腺癌 | 1.7 | N个 |
| 51 | 5.1 | 腺癌 | 2.5 | Y（Y） |
| 232 | 7.5 | 腺癌 | 2.6 | Y（Y） |
| 57 | 7.2 | 腺癌 | 6.3 | Y（Y） |
| 196 | 8.9 | 鳞状的 | 3.8 | N个 |
| 217 | 10 | 鳞状的 | 3.2 | N个 |
| 48 | 11.1 | 腺癌 | 0.8 | N个 |
| 21 | 11.8 | 腺棘癌 | 5 | Y（Y） |
| 216 | 13.2 | 鳞状的 | 4 | N个 |
| 133 | 14.7 | 腺癌 | 8 | Y（Y） |
| 160 | 14.8 | 鳞状的 | 4.5 | N个 |
| 7 | 16.3 | 鳞状的 | 4.5 | N个 |
| 254 | 16.4 | 鳞状细胞 | 2.5 | N个 |
| 212 | 19.7 | 鳞状的 | 6 | Y（Y） |
| 172 | 29 | 鳞状的 | 6.5 | N个 |
α-平滑肌肌动蛋白（αSMA）表达增加是CAF的一个常见特征，可能反映了CAF处于“激活状态”(三,4). 与先前的观察结果一致，与匹配的NF相比，CAF中αSMA的表达通常更高，但不同品系之间αSMA表达有相当大的差异(). 在任何给定的CAF和NF对中表达αSMA的细胞百分比以及每个细胞的αSMA表达量中观察到这种异质性。αSMA表达与临床数据无相关性。以前曾报道过CAF中αSMA表达的异质性[例如(9)].
一个研究小组提出，小窝蛋白-1表达减少会驱动CAF激活，并负责CAF的代谢重编程(18). western blot检测到CAF和成对NF之间的总caveolin-1表达没有差异(). 此外，caveolin-1在CAF和NF中均在单个细胞水平上均匀表达，标记了质膜和内膜(). 因此，caveolin-1表达降低并不是肺癌衍生CAF的特征。
代谢组区分培养的原发性肺癌相关成纤维细胞和正常肺成纤维细胞
如前所述，使用质谱法分析了21对培养的原发性肺CAF及其匹配NF中的203种代谢物(19,20). 根据细胞数量校正代谢物水平，并将所有样本中的每种代谢物按比例缩放至其中位数(&补充表1). 与CAF相比，NF中被视为一组的所有203种代谢物略有增加，尽管显著(). 数据已针对单元格编号进行了更正，我们不知道造成这种差异的原因。为了解释这一变化，我们还分析了将每个单独样品的代谢物归一化为每个单独样品所有代谢物的中值后的数据(补充表1). 这种归一化并没有改变CAF与NF比较的结果。在比较单个代谢物的平均值时，CAF和NF之间没有任何单一代谢物存在显著差异（p≤0.05，双尾，非配对Student’s t检验，Benjamini-Hochberg经多重检验校正）。
CAFs和配对NFs中的稳态代谢产物谱A。21对CAF和NF中203种代谢物丰度的热图。每种代谢物的丰度按比例定为中值1。色阶如下所示。CEM编号是细胞系标识符。203种代谢物的列表见补充表一。热图面板以较大的格式显示在补充图1A.
B。所有203种代谢产物在CAFs和NFs中的分布。
C、。203种代谢物的“相对”t核分布分为7个生化分组(补充表一). 各组代谢物的数量如图所示（n）。为了显示目的，从所分析组的代谢物的t-核中减去不在所分析组中的（203-n）代谢物平均t-核。因此，将7条主要路径中每一条的t核分布与其自身的参考集进行比较。这样，相对于0的t核偏移越远，与参考集的差异越大。右图所示为经Benjamini-Hochberg修正的双尾非配对p值，用于对7组代谢物的t核分布与其余代谢物t核分布的比较进行多重测试。
D&E公司。t核分布的代谢物亚群(D类)和丰度变化（对数2（CAF/NF）(E类)在p值≤0.05时，两者都不同于其参考数据（经多次测试校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。显示了子组（n）中代谢物的数量。所有46个子组的结果如所示补充图2.
为了最小化独立于可能的CAF与NF差异的受试者之间的差异，我们检查了每个CAF中的单个代谢物与来自相同个体的NF中的代谢物数量的比率(补充图1B). 在该分析中，只有CAF和NF之间的葡萄糖丰度在p≤0.05时存在显著差异（双尾非配对Student’s t检验，Benjamini-Hochberg校正）。在葡萄糖代谢产物没有相应变化的情况下，这种变化的生物学意义尚不清楚。
细胞代谢是一个相互联系的网络；因此，稳态分析可能会令人困惑，因为代谢途径的生化变化将分布在该途径的各个中间产物上，也可能更广泛地分布在连接的途径上。为了捕捉代谢途径代谢物丰度的差异，从而潜在地提高我们检测CAF和NF差异的分析灵敏度，我们根据《京都基因和基因组百科全书》（KEGG）将203种代谢物分为7组(21)并基于这些组比较了CAF和NF(补充表1). 为了实现这一点，我们使用t检验将7组中每一组代谢物的t核与所有其他代谢物（不包括被检测途径的代谢物）的t核进行比较。在该分析中，我们确定CAF和NF之间7组代谢物中的任何一组的差异是否比CAF和nf之间所有代谢物丰度的差异更显著。7组中有两组的CAF显著富集：氨基酸和肽（p≤0.05，未配对双尾Student’s t检验，Benjamini-Hochberg校正)(). 这些数据表明，CAF和NF的细胞代谢存在差异，而这些差异在个体代谢物/生化水平上并不明显。
为了完善比较，我们通过根据KEGG命名将代谢物进一步分类为46个亚组来分析数据(21) (补充表一). 我们比较了t型核和折叠变化（对数2)每个亚组的代谢物丰度分别为t核或所有其他代谢物的倍数变化，不包括被检查亚组的那些代谢物(补充图2). 因此，在该分析中，我们确定CAF和NF之间46个代谢产物亚群中的任何一个亚群的差异是否比CAF和nf之间所有代谢产物丰度的差异更显著。为了考虑CAF和NF之间的一个亚组存在显著差异，我们采用了一个标准，即子组代谢物的t核分布和平均对数2亚组代谢物丰度的倍数差异二者都差异显著（p值≤0.05，未配对双尾Student t检验，Benjamini-Hochberg校正）。
该分析表明，CAF和NF之间有3个亚组存在显著差异(). 甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸亚组的代谢物包括这些氨基酸以及n-乙酰丝氨酸和甜菜碱(补充表一). 肌酐亚组由肌酐和肌酐组成。二肽亚组由17个不相关的二肽组成(补充表一). 甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸和肌酐亚群中的CAF和NF之间的差异，两者都是KEGG指定氨基酸组的一部分，可能是该组区分CAF和nf的原因()，而二肽亚群的变化解释了肽群区分CAF和NF的原因(). CAF和NF之间不同的3个亚组的代谢产物均富集在CAF中。
这些代谢产物分析数据支持CAF和NF之间存在稳态代谢差异的假设。
不同代谢物组区分高SUV和低SUV最大值从配对正常肺成纤维细胞培养原发性肺癌相关成纤维细胞
为了进一步验证数据，我们根据标准化摄取值（SUV）测量的原发性肿瘤的糖酵解活性，对CAF和NF进行细分后，分析了代谢物最大值)关于氟脱氧葡萄糖正电子发射断层扫描(). 运动型多用途汽车最大值是磷酸化脱氧葡萄糖细胞内积累的一种测量方法，是肿瘤糖酵解代谢的替代测量方法(22). 确定与SUV相关的CAF和NF的代谢产物特征是否存在差异最大值在肿瘤中，CAF/NF对被分离成“低”SUV最大值（≤5）和“高”SUV最大值（≥8）组。从我们的诊所收集的数据显示，基于这些SUV的患者无病生存率存在显著差异最大值根据SUV的潜在临床相关性进行分组最大值分层() (23,24). 根据这些标准，七对CAF/NF被归类为低SUV最大值和11辆一样高的SUV最大值(). SUV之间的三对CAF/NF最大值5例和7例被排除在本分析之外。
来自高SUV的CAF之间没有显著差异的个别代谢物最大值肿瘤及其相应的NF。46个KEGG亚组中的三个亚组在高SUV之间存在显著差异最大值CAF及其匹配NF(). 二肽和甘氨酸/丝氨酸/苏氨酸亚群在CAF中显著富集。这些亚组也在CAF与独立于SUV的NF的比较中确定最大值分类(). 此外，溶血磷脂亚组（16种不同的溶血磷脂种类）代谢物的平均丰度在高SUV中降低最大值相对于配对NF的CAF().
代谢组分析揭示肿瘤SUV的影响最大值关于CAF和NFA。11对CAF/NF与SUV肿瘤相关的比较最大值≥ 8. 其t核分布（顶面板）和丰度变化（对数）的代谢物亚群2（CAF/NF）（底部面板）在p值≤0.05时均与参考数据不同（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。
B。SUV肿瘤相关的7对CAF/NF的比较最大值≤ 5. 其t核分布（上面板）和丰度变化分布（对数）的子群2（CAF/NF）（下面板）在p值≤0.05时均与参考数据不同（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。子组（n）中的代谢物数量如左图所示。
C、。高SUV 11个CAF的比较最大值低SUV（≥8）至7个CAF最大值（≤5）肿瘤。其t核分布（上面板）和丰度变化分布（对数）的子群2（CAF/NF）（下面板）在p值≤0.05时均与参考数据不同（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）。子组（n）中的代谢物数量如左图所示。
D类.来自高SUV人群的11名NF的比较最大值低SUV个体的7个NF（≥8）肿瘤最大值（≤5）个肿瘤。其t核分布（上面板）和丰度变化分布（对数）的子群2（CAF/NF）（下面板）在p值≤0.05（经多次试验校正的双尾未配对p值Benjamini-Hochberg）时均与参考数据不同。子组（n）中的代谢物数量如左图所示。
来自低SUV的CAF之间没有显著差异的个别代谢物最大值肿瘤及其配对的NF。46个KEGG亚组中的两个亚组在低SUV之间存在显著差异最大值CAF及其匹配NF(). 与高SUV的对比情况一样最大值从CAF到NF，二肽亚群在低SUV中显著富集最大值CAF相对于其配对NF，尽管低SUV中相对富集最大值CAF小于高SUV最大值比较。在低SUV中，糖酵解/丙酮酸代谢物亚群也显著减少最大值相对于配对NF的CAF(). 区分低SUV的代谢物亚组最大值来自匹配NF的CAF与区分高SUV的CAF不同最大值来自配对NF的CAF，表明CAF的代谢改变与肿瘤的糖酵解活性（即SUV）之间存在联系最大值)从中导出CAF。
来自高SUV的原发性肺癌相关成纤维细胞最大值肿瘤的代谢产物与低SUV的不同最大值肿瘤
进一步探讨CAF代谢与肿瘤SUV之间关系的可能性最大值，我们比较了低SUV的CAF最大值从高SUV到CAF的肿瘤最大值肿瘤。低SUV和高SUV的CAF中的两个代谢产物亚群不同最大值肿瘤：溶血磷脂和二肽(). 高SUV的CAF中溶血磷脂的丰度降低最大值肿瘤，而高SUV导致CAF中的二肽增加最大值肿瘤。这两个亚组还区分了高SUV最大值配对NF的CAF(). 有趣的是，在这两项比较中，高SUV中溶血磷脂减少，二肽增加最大值CAF，表明这些变化是源自高端SUV的CAF的特征最大值肿瘤，强化了CAF的代谢变化在某种程度上与肿瘤的糖酵解能力有关的假设。
高SUV患者的原代正常肺成纤维细胞最大值肿瘤的代谢产物特征与低SUV患者不同最大值肿瘤
上述数据直接支持了高SUV和低SUV的CAF存在差异的假设最大值肿瘤。接下来，我们比较了分配给高或低SUV的NF的代谢物特征最大值基于SUV的组最大值相应CAF来源的肿瘤。KEGG指定的代谢物的两个亚组在与低SUV和高SUV相关的NF之间不同最大值肿瘤(). 二肽在与高SUV相关的NFs中富集最大值肿瘤，而肉碱亚组（乙酰肉碱、肉碱、脱氧肉碱和己酰肉碱）在与低SUV相关的NF中富集最大值肿瘤。这些数据表明肿瘤的糖酵解活性（即SUV）之间存在意想不到的联系最大值)以及来自与肿瘤相同肺叶的非肿瘤组织的成纤维细胞的代谢谱。
与正常肺成纤维细胞相比，原发性肺癌相关成纤维细胞的基础自噬增加
在CAF和NF的每次比较中，二肽都会增加，这表明二肽的增加是CAF的一个特征(&). 此外，高SUV的CAF中也增加了二肽最大值与低SUV相比的肿瘤最大值肿瘤，并且它们在与高SUV相关的NFs中增加最大值与低SUV相关的肿瘤最大值肿瘤(). 因此，二肽的增加也与较高的SUV有关最大值肿瘤。
蛋白质水解是二肽的来源，因此二肽的差异可能反映了细胞群之间蛋白质水解的差异。自噬是一种溶酶体相关的蛋白分解机制，在癌细胞中发现了自噬的改变，这种改变可能反映了癌细胞对能量平衡改变的反应(25). 两种自噬机制，即宏观自噬和伴侣介导的自噬，与癌症有关(14-16,26).
我们首先确定CAF和NF之间的宏观自噬是否存在差异。在诱导大分子自噬后（从这里开始称为自噬），微管相关蛋白1轻链3（LC3I）通过脂质氧化形成LC3II，在自噬体形成的伸长阶段与膜结合。通过改变电泳迁移可以明显看出LC3II的增加是自噬增加的一种度量() (27-29). 尽管CAF/NF对之间的LC3总量（LC3I+II）存在差异（反映个体对个体的差异），但CAFs和NFs之间的总LC3没有一致的差异，总LC3与肿瘤SUV也没有相关性最大值(). 然而，基础稳态LC3II在CAF中占总LC3的百分比显著增加，表明CAF中自噬增加(). 为了确定LC3II的基本稳态增加是由于LC3II产量的增加，而不是LC3II周转量的减少，我们使用氯喹来抑制LC3II降解(29). 氯喹诱导CAF和NFs株系LC3II增加；然而，由于自噬增加，CAF中LC3II相对增加，占总LC3的百分比保持不变，与CAF中基础LC3II较高一致(). 当我们分离肿瘤SUV的数据时最大值我们发现，与配对NF相比，CAF中LC3II的增加对于与高SUV相关的配对而言是显著的最大值肿瘤，但不适用于与低SUV相关的患者最大值肿瘤(). 这些结果与高SUV之间二肽的更稳健差异一致最大值CAF/NF对()和稳态LC3II测量可能没有足够的灵敏度来检测低SUV之间的较小差异最大值CAF/NF对。
相对于成对NF，CAF中的LC3II增加A。用于LC3I和LC3II定量的CAF/NF对（CEM 217）的代表性LC3 western blot。数据来自生长培养基中的细胞，反映了LC3的基本稳态水平，以及来自用10μM氯喹处理3小时以抑制LC3II降解的细胞。
B。用定量Western印迹法测定8种成纤维细胞株中LC3（LC3I和LC3II）的总量。这些值被归一化为总蛋白（肌动蛋白）。数据为至少3次测量的平均值±SEM。
C、。LC3II占NF和成对CAF中总LC3（I+II）的百分比，这是通过量化如面板a所示的Western blot确定的。所有11NF/CAF对的平均值，以及与低SUV相关的4对NF/CAF最大值肿瘤和7对与高SUV相关最大值显示肿瘤。*p<0.01。
D。LC3免疫荧光成像自噬体。对照细胞（生长培养基）或在不含葡萄糖或谷氨酰胺的DMEM培养基中孵育3小时后的细胞的代表区域用LC3抗体染色。含有LC3II的自噬体以绿色显示。使用40倍物镜收集图像。细胞之间的强度差异反映了LC3染色量的差异。DAPI染色细胞核显示为蓝色。
E.公司。在无葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养3小时对通过Western blotting测定的LC3II百分比的影响。数据是4对CAF/NF对±SEM数据的平均值。*p<0.05，配对，单尾学生t检验。
我们还研究了伴侣介导的自噬（CMA）过程中CAF和NFs之间是否存在差异，在这个过程中，细胞溶质蛋白被运输到溶酶体中进行降解，而这一过程在一些癌细胞中已被证实增加(25)(14-16,26). LAMP-2A上调是CMA升高的标志。尽管LAMP-2A表达存在个体间差异，但CAF和NF之间没有一致性差异(补充图3). 这些数据表明，CMA在CAF中没有上调。
上述结果证实了CAF中基础自噬的增加。营养限制是自噬的主要诱导因素，这促使我们研究CAF和NF在激活自噬以响应营养减少方面是否存在差异。我们首先通过在缺乏葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养细胞3小时来确定急性严格营养剥夺的影响。通过测定Western blot中的LC3II和LC3染色斑点的荧光显微镜测量来研究自噬的诱导。CAF中的基础自噬增加明显表现为LC3阳性旁核结构相对于NF的数量和强度增加(). LC3标记和细胞近核区的浓度是自噬体的特征。缺乏葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中细胞的急性营养剥夺导致CAF和NF中自噬体的增加，尽管CAF和nf中都存在一些细胞间异质性(). 通过Western blotting检测，急性营养剥夺诱导CAF和NF中LC3II增加到相同水平(). 因此，尽管CAF中的基础自噬增加，但在急性营养剥夺诱导自噬方面，CAF和NF之间没有差异，这表明CAF在营养胁迫下进一步诱导了自噬。
接下来，我们研究了CAFs和NFs之间自噬的差异，这是对葡萄糖可利用性慢性降低的反应，而不是对没有葡萄糖的急性挑战的反应。由于癌细胞对葡萄糖的高需求，可用于肿瘤微环境中基质细胞代谢的葡萄糖可能会长期受到限制。细胞通常在添加25 mM葡萄糖的培养基中培养，我们的代谢组分析是在25 mM糖中扩增的细胞中进行的。为了确定降低葡萄糖的效果，细胞在含有25 mM或5 mM葡萄糖的培养基中生长。我们使用LC3的定量荧光显微镜检测自噬体。在5 mM和25 mM葡萄糖中生长的NFs中，与溶酶体/自噬体特征的近核点相关的LC3（染色强度增加）数量增加，尽管增加的幅度不如在缺乏葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养的细胞大(). 这些数据证实，生长培养基中的葡萄糖降低可诱导NF的自噬。然而，与生长在25mM葡萄糖中的CAF相比，生长在5mM葡萄糖中CAF的自噬体没有增加(). 这些数据表明，CAF和NF之间通过长期降低葡萄糖诱导自噬的设定值不同。
葡萄糖对自噬的影响A。LC3荧光检测生长介质中葡萄糖对自噬体的影响。显示了在5 mM、25 mM葡萄糖中生长或在无葡萄糖和谷氨酰胺的培养基中培养3小时后生长的细胞的典型图像。显示强度伪彩色图像。彩色比例尺位于面板A的底部。图像以40×的速度采集。
B类.用质谱法从在25 mM或5 mM葡萄糖中至少生长7代的细胞中定量17种二肽。*p<0.05，配对，双尾学生t检验。
C类在18小时培养期间，荧光葡聚糖从培养基中内吞，然后在不含葡聚糖的培养基中再培养3小时，将其追赶到溶酶体中的典型表观荧光图像。显示了在25和5mM葡萄糖中生长的细胞。图像采集时间为40×。DAPI染色细胞核显示为蓝色。
D类通过摄入罗丹明-荧光素（R/F）标记葡聚糖的比率荧光显微镜测定7对NF/CAF溶酶体的pH值。数据是8个CAF/NF对（5 mM葡萄糖）和2个CAF-NF对（25 mM糖）的平均溶酶体pH值的平均值。
为了确定降低的葡萄糖是否影响二肽的生成，在代谢组分析中测定了生长在5 mM葡萄糖中的7个CAF/NF的17个二肽的丰度(). 与21对CAF/NF的情况一样()在25 mM葡萄糖中生长的7对CAF中，二肽的丰度增加。然而，当细胞生长在5 mM葡萄糖中时，这些CAF和NF的二肽丰度没有差异(). 在5 mM与25 mM葡萄糖中生长的NF中，二肽的丰度显著增加，而CAF中的二肽丰度没有因细胞在5 mM葡萄糖中生长而显著改变。因此，降低葡萄糖的生长诱导NFs中自噬体形成的增加与二肽的增加平行。
在含有不同量葡萄糖（25 mM、5 mM或2 mM）的培养基中，CAF和NF的生长并未显示CAF对葡萄糖降低的增殖优势(补充图4)尽管在体外试验中，NFs在慢性葡萄糖降低时上调自噬的能力可能减轻CAF基础自噬增加的任何优势。
自噬降解最终取决于活性溶酶体系统。酸化对溶酶体的水解功能至关重要，调节溶酶体pH值是控制溶酶体活性的一种机制(30-32). 我们研究了CAFs和NFs之间的溶酶体酸化是否发生了变化。细胞与双重标记的荧光素-罗丹明-葡聚糖孵育18小时，并在不含葡聚糖的培养基中孵育3小时，将内吞葡聚糖追捕到溶酶体中。在CAF和NF中，标记以点状累积，分布在整个细胞中，但在溶酶体的核周区域有一定程度的浓度(). 测量点刺的罗丹明-荧光素荧光比率，并使用pH标准曲线将其转换为pH值(补充图5和6). 在25 mM或5 mM葡萄糖中生长时，CAF和NF的平均溶酶体pH值没有一致性差异(). 在所有条件下，溶酶体的pH值均为4.5，与之前测定的溶酶体pH值一致。
讨论
许多肿瘤在代谢上与非肿瘤组织不同（例如。，18F-脱氧葡萄糖PET活性），反映癌细胞明显的糖酵解代谢。然而，尚不清楚肿瘤非上皮细胞的代谢是否也发生改变。为了开始探索这个问题，我们使用定量质谱分析法对原代、未转化的人肺CAFs及其配对NFs中203种代谢产物的稳态丰度进行了分析。虽然我们没有发现区分CAF和NF的个别代谢物的差异，但我们在此报告了对CAF和nf在选定代谢途径的稳态代谢物丰度方面的显著差异的新观察。
在这项初步研究中，由于使用初级非转化细胞的一些实际限制，我们进行了稳态代谢产物分析。我们使用系统途径方法分析数据，确定KEGG代谢物指定组的变化，这些变化与比较样品之间代谢物丰度的总体差异显著不同。除了比较CAF和NF之外，我们还分析了基于SUV分离样本后的数据最大值肿瘤：“高”SUV最大值（≥8）和“低”SUV最大值(≤5). 这一分类的推动力是SUV最大值是对肿瘤糖酵解活性的测量，因此有兴趣了解这是否与CAFs的代谢谱有关。此外，拥有高SUV的个人最大值肿瘤的5年无病生存率较差，因此该分类具有潜在的临床意义。我们检测到代谢物组的变化，表明代谢途径可能发生变化。我们对其中一个变化进行了随访，即CAF中的二肽增加，并进行了额外的实验。需要进一步研究以调查本研究中发现的其他代谢变化。尽管如此，我们的结果首次确立了CAF与其配对NF之间的代谢差异，这种差异持续存在于在体外与母瘤的糖酵解活性相关。
在不同成纤维细胞组的比较中，17个无关二肽的相对丰度存在显著差异。与其他代谢物相比，在CAF与NF以及高SUV的CAF中，二肽富集最大值肿瘤与来自低SUV的CAF的比较最大值肿瘤。因此，二肽丰度增加是CAF的一般特征，与肿瘤的糖酵解活性相关。
细胞二肽的主要来源是蛋白质周转，这表明不同成纤维细胞组之间的蛋白质降解存在差异。与双外延丰度的差异平行，我们发现基于LC3标记的吞噬体的增加以及LC3II/I比率的增加，CAF相对于其配对NF的自噬增加。自噬最初被描述为对营养剥夺的一种反应，在这种反应中，细胞成分被降解，以提供产生氧化能的底物。然而，自噬现在被认为在正常的基础细胞生理学中起作用，它通过调节长寿命蛋白质的周转，清除受损的线粒体和其他细胞器，清除潜在的有毒蛋白质聚集体，以防止氧化损伤(14,25). 除了这些促生存活动外，在某些条件下，自噬还可能导致细胞死亡(14).
对肿瘤自噬的研究主要集中在癌细胞上(14). 我们的数据支持肿瘤微环境中成纤维细胞的自噬增加，这表明肿瘤中自噬的改变并不局限于癌细胞。我们还发现CAF中二肽丰度增加/基础自噬增加与肿瘤SUV呈正相关最大值揭示了肿瘤的糖酵解活性与自噬之间的可能联系。
自噬增加被认为可以通过提供营养物质（氨基酸、脂质和核酸）和/或保护细胞免受氧化损伤来促进癌细胞的存活。CAF自噬增加也可能为肿瘤中的CAF提供生存益处。因此，通过促进CAF的存活，提高自噬可间接促进CAF促肿瘤生成作用，因为在肿瘤中生长的CAF能够通过一种或多种先前描述的机制（例如旁分泌支持）支持癌细胞和肿瘤生长。另一种并非相互排斥的观点是，自噬增加并不局限于对CAF生存的细胞自主益处，但CAF中自噬的增加可能对癌细胞有直接益处。一些可能性包括增加CAF自噬，将其作为保留肿瘤微环境中营养物质供癌细胞使用的手段，或从自噬产生的CAF中分泌营养物质，以丰富肿瘤微环境的营养环境。后者对二肽特别感兴趣，因为补充含有某些二肽的培养基可以增强在体外细胞活力(33).
当受到从培养基中去除葡萄糖和谷氨酰胺的严重营养限制的急性挑战时，CAFs和NFs类似地诱导自噬。然而，当培养基中的葡萄糖慢性降低时，只有NF诱导了自噬，这表明NF诱导自噬的设定值较低，受营养环境变化的控制。由于癌细胞的高糖消耗，肿瘤内其他细胞的葡萄糖可用性可能有限。因此，很容易推测CAF中自噬的基础上调反映了诱导自噬设定点的差异，并且有利于CAF在肿瘤环境中的生长/存活。虽然我们没有观察到CAF和NF在正常生长介质（25 mM葡萄糖）或在由还原葡萄糖（5或2.5 mM葡萄糖。因此，需要进一步研究CAF自噬增加的功能后果。
无论如何，我们的结果表明，在考虑自噬在实体肿瘤中的作用时，必须考虑肿瘤微环境中细胞的自噬变化。
除了高SUV的CAF中二肽丰度增加外最大值与低SUV相比的肿瘤最大值在肿瘤中，从高SUV个体分离的NFs中二肽的丰度增加，尽管不那么强烈最大值与低SUV个体相关的肿瘤最大值肿瘤。SUV之间的这种联系最大值肿瘤微环境外成纤维细胞中二肽的丰度增加是意料之外的。对这些结果的解释是，肿瘤对CAF的可能影响是深远的，而非肿瘤性肺组织中成纤维细胞的不太明显的差异反映了由于远离肿瘤而导致的影响减弱。另一种可能性是NF增加的二肽丰度与高SUV配对最大值肿瘤反映了与肿瘤无关的预先存在的差异，以及高SUV和低SUV的CAF之间更为明显的差异最大值肿瘤是肿瘤重新强化这种先前存在的差异的结果。另一种可能性是高SUV和低SUV产生的NF之间代谢物的差异最大值肿瘤可能反映了暴露于烟草相关致癌物后宿主表观遗传改变的差异。
在这里，我们重点关注了二肽的变化，这导致我们考虑了CAF和NF之间自噬/蛋白水解的差异。然而，在一些成纤维细胞比较中，其他组代谢物存在显著差异。在许多比较中，氨基酸途径的代谢物发生了变化，在每种情况下，丰度的变化与二肽的变化方向相同。这些数据表明，蛋白质/氨基酸代谢的变化是CAF和NF之间的重要差异。
以前有人认为CAF可能会改变碳水化合物代谢，以支持癌细胞的“Warburg”代谢。我们发现CAF中糖酵解中间体的稳态丰度降低，这与低SUV中的NF相比最大值肿瘤，符合这个假设。然而，在高级SUV之间的比较中没有观察到这种差异最大值CAF和NF。对这些结果的一个可能解释是，低SUV的癌细胞最大值肿瘤需要改变CAF碳水化合物代谢，而高SUV癌细胞的糖酵解代谢最大值肿瘤足够强大，不依赖肿瘤内CAF代谢的调节。无论如何，我们的研究揭示了在CAF研究中考虑肿瘤糖酵解性质的重要性。
对培养的细胞进行分析。这种方法相对于整个肿瘤组织的特征分析的一个优点是，我们能够专门检查肿瘤块的非上皮细胞。我们重点分析了从肿瘤和邻近非肿瘤组织的分散细胞中生长出来的波形蛋白阳性、角蛋白阴性细胞，这是隔离CAF的标准方法[例如(9)]. 与文献一致，CAF细胞系作为一个组比成对NF表达更多的αSMA，这是活化成纤维细胞的标记物，但重要的是注意到不同细胞系之间存在相当大的异质性。然而，尽管存在这种异质性，我们的分析揭示了CAF和NF之间的差异在体外文化。先前的研究表明，CAF在在体外培养，包括基因表达差异以及测定的促肿瘤活性在体外和体内[例如(9)]. 因此，我们发现CAF和NF之间的代谢差异在在体外文化与先前的研究一致。
致谢
作者感谢Fred Maxfield、Vivek Mittal以及McGraw和Altorki小组成员对手稿的评论。
基金：哥伦比亚大学DIRC P30 DK063608-09（授予NKA和TEM），纽伯格伯曼肺癌研究中心（NKA）；塞斯·斯普拉格教育和慈善基金会奖（NKA）、WCMC发现奖（TEM）、STARR癌症基金会（RS）、NSF职业奖1054964（OE）、斯塔尔癌症基金会和威尔康奈尔医学院临床和转化科学中心TL1RR02499（GS）。
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