《国际肝病杂志》。作者手稿；PMC 2014年7月1日发布。
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内质网应激通过自噬诱导肝星状细胞的成纤维活性
,1 ,1 ,2 ,2 ,1 ,三 ,2和1
弗吉尼亚·埃尔南德斯·赫亚
1美国纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
莫伊拉·希尔舍尔
1美国纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
拉斐尔·罗森菲尔德
2美国纽约州纽约市西奈山医学院药理学和系统治疗学系
玛丽贝尔·P·林
2美国纽约州纽约市西奈山医学院药理学和系统治疗学系
娜塔莉亚·尼托
1美国纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
萨宾·沃纳
三瑞士苏黎世ETH苏黎世分子健康科学研究所生物系
拉克希米·A·德维
2美国纽约州纽约市西奈山医学院药理学和系统治疗学系
斯科特·弗里德曼
1美国纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
1美国纽约州纽约市西奈山医学院医学部肝病科
2美国纽约州纽约市西奈山医学院药理学和系统治疗学系
三瑞士苏黎世ETH苏黎世分子健康科学研究所生物系
通讯地址：Scott L.Friedman，M.D.Box 1123，Mount Sinai School of Medicine 1425 Madison Ave，Room 1170C New York，NY 10029电话212 659 9501传真212 849 2574ude.msms@namdierf.ttocs - 补充资料
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摘要
背景和目标
肝损伤期间的代谢应激通过瘢痕基质的分泌增强自噬并刺激星状细胞活化。蛋白质合成增强的条件增加了内质网（ER）折叠能力的需求，并触发未折叠蛋白反应（UPR）以应对由此产生的ER应激。活性氧（ROS）的产生是肝纤维化的一个共同特征，氧化应激和内质网应激之间存在串扰。我们研究的目的是确定氧化剂和内质网应激对星状细胞活化的影响。
方法
H诱导肝星状细胞氧化应激2O（运行）2在培养或体内通过乙醇喂养，并分析UPR反应。由于UPR的分支主要受IREα影响，我们在星状细胞中阻断了这一途径，并分析了纤维生成反应、自噬和下游MAPK信号。在氧化应激条件下，还评估了星形细胞中的Nrf2抗氧化反应。
结果
H（H）2O（运行）2培养中的治疗或体内的乙醇喂养增加了基于XBP1 mRNA剪接的UPR反应，从而触发自噬。在内质网应激条件下，通过其靶基因的qRT-PCR测定，Nrf2介导的抗氧化反应也被诱导。相反，在星状细胞中阻断IRE1通路以p38 MAPK依赖的方式显著降低其激活和自噬活性，导致纤维生成反应降低。
结论
这些数据暗示了蛋白质折叠质量控制在调节肝星状细胞纤维化反应中的机制。
关键词：肝纤维化、肝星状细胞、自噬、内质网应激、Nrf2
介绍
常驻肝星状细胞获得纤维化表型是肝脏对损伤反应的关键事件。这种细胞“激活”导致胶原蛋白和细胞外基质的其他成分沉积，如果损伤持续，将导致肝脏实质逐渐被瘢痕替代，最终导致肝硬化[1,2]. 我们最近已经证明，自噬的上调驱动星状细胞的纤维化反应[三]. 然而，导致星状细胞自噬的上游事件尚不清楚。
长期饮酒会激活星状细胞，引发创伤愈合反应，并可能导致酒精性纤维化。事实上，在所有死于肝病的人中，多达44%的人可能死于酒精[4]. 酒精代谢产生活性氧，这种氧化应激是星形细胞活化和胶原蛋白分泌的特征良好的诱导剂[5]. 此外，氧化应激可导致Nrf2转录因子的激活，Nrf2是细胞抗氧化反应的主要调节因子[6]. 激活后，Nrf2从其细胞质抑制剂Keap1中释放出来，稳定并积聚在细胞核中，在细胞核中与几个抗氧化基因启动子区的抗氧化反应元件（ARE）结合，包括编码硫氧还蛋白-1（Srxn1）谷胱甘肽S-转移酶mu亚基（Gstm）的基因，NADPH：醌氧化还原酶1（Nqo1）、谷氨酸-半胱氨酸连接酶催化（Gclc）和调节（Gclm）亚基以及几种过氧化物酶类[7,8].
随着星状细胞被激活并产生更多的细胞外基质成分，蛋白质合成的增加对内质网折叠能力提出了更高的要求，这可能会干扰内质网的稳态。在大多数组织中，氧化应激可以改变内质网稳态并引起UPR激活[9,10]. 三种通常与ER伴侣蛋白BIP结合的跨膜蛋白处于非活性状态，可以感知ER稳态的扰动：肌醇需要酶1（IRE1）、激活转录因子6（ATF-6）和RNA-活化蛋白激酶（PKR）样ER激酶（PERK）[11]. IRE1是三个分支中最保守的一个。它与BIP的分离允许其反磷酸化，激活其RNase活性，并导致X盒转录因子（Xbp1）修饰为其转录活性剪接变异体[12]. sXBP1可以转位到细胞核并激活特定的靶基因。IRE1-XBP1通路在星状细胞激活中的作用尚未被探索。因为自噬和UPR都是在细胞内环境稳定的扰动下诱导的，所以我们已经探索了它们对星状细胞中的成纤维反应有贡献的可能性。
我们的研究旨在确定氧化剂和内质网应激是否激活肝星状细胞的自噬，从而刺激细胞活化和胶原沉积。
材料和方法
体外实验
采用酶消化法和改良Percoll密度梯度离心法分离C57/BL6野生型小鼠肝星状细胞[13]. 小鼠永生化星状细胞系JS1，之前在我们实验室产生[14]用含有10%胎牛血清的Dulbecco改良Eagle培养基营养混合物F12（DMEM-12）培养。如前所述，从8个月内喂食对照或乙醇Lieber-DeCarli饮食的大鼠中分离出永生大鼠肝星状细胞[15,16]. 用10 mM氯喹（CQ）（西格玛，密苏里州圣路易斯）处理一些细胞，20μM H2O（运行）2（西格玛，密苏里州圣路易斯市），5μg/ml衣霉素（西格马，密苏里达州圣路易市），p38 MAPK抑制剂SB203580（Cell Signaling，马萨诸塞州波士顿）或与10 ng/ml PDGF-BB（BD Biosciences San Jose，CA）孵育。一些研究中使用了编码显性阴性Nrf2突变体的表达质粒[17]. 还使用了Fumihiko Urano博士产生的编码DN IRE1（K599A，一种显性负激酶突变）的Addgene质粒20745（Addgene，Cambridge，MA，USA）。使用TransITρ-LT1转染试剂转染细胞（美国威斯康星州麦迪逊市Mirus Bio LLC）。
定量实时逆转录酶聚合酶链反应（q-rt-PCR）
总RNA是使用Qiagen微柱（奇根，Germantown，MD）和柱上DNA酶处理提取的。使用RT完整双预引物试剂盒（Clontech，Mountain View，CA）逆转录一微克RNA。FastStartSYBR Green Master Mix（印第安纳波利斯罗氏）用于PCR反应。样品在Microsoft Excel中分析三份，并归一化为肌动蛋白表达。用于拼接新业务流程1采用标准PCR检测，程序如下：（1）94℃4 min，（2）94℃45 s，63℃30 s，72℃30 s的35个循环，（3）72℃10 min，琼脂糖凝胶电泳分离PCR产物，解析473bp（未拼接）和428bp（拼接）扩增子。
免疫印迹
细胞裂解物进行免疫印迹分析。用以下主要抗体培养膜：兔抗LC3（西格玛，密苏里州圣路易斯市）、兔抗GAPDH（西格马，密苏里达州圣路易市）、家兔抗I型胶原蛋白（罗克兰公司，宾夕法尼亚州吉尔伯茨维尔市）、兔子抗SMA（比勒里卡州，马萨诸塞州）、兔抗血小板衍生生长因子受体（PDGFR）（加利福尼亚州圣克鲁斯市）、兔抗MMP2（阿布坎，马萨诸塞姆州剑桥市）、，小鼠抗微管蛋白（西格玛，密苏里州圣路易斯市）、兔抗P62（恩佐，纽约州纽约市）、家兔抗ATF6（加利福尼亚州圣克鲁斯市）、兔子抗ATF4/CREB-2（加利福尼亚州桑塔克鲁斯）、小鼠抗P38（马萨诸塞州波士顿市细胞信号传导）、鼠抗磷酸化P38（麻萨诸塞州波斯顿市细胞信号传递）、兔抗磷酸化JNK，兔抗磷酸-ERK（Cell Signaling，马萨诸塞州波士顿）、兔抗磷酸-AKT（Cell Signaling）、兔抗ERK（Cell-Signaling，波士顿，马萨诸塞诸塞州）和兔抗PDI（Cell-Signaling）。GCLC和GCLM抗体由华盛顿大学的Terrence Kavanaugh博士捐赠。用HRP结合二级抗体检测反应。使用ECL检测系统（英国白金汉郡Amersham Pharmacia Biotech）和Laser4000（富士通）开发印迹。
商品及服务税活动
GST活性根据Habig等人的方法测定[18]，进行了修改。反应在0.1 M磷酸钾、pH 6.5、10 mM磷酸钠、pH 7.4、20 mM谷胱甘肽和20 mM 1-氯-2，4-二硝基苯（在96%乙醇中溶解，存在5μL细胞裂解液（约20 ng蛋白质））中进行。在340 nm和25°C条件下，在6分钟内监测吸光度的变化。结果表示为比活性单位，定义为每分钟每毫克蛋白质产生1μmol共轭产物的酶的量。
统计分析
结果表示为平均值和平均值的标准误差（SEM）。使用Microsoft Excel软件计算至少三个独立测定的P值（学生双尾非配对t检验）。数据被认为具有统计学意义，P<0.05。
结果
活性氧生成引起肝星状细胞内质网应激
内质网应激反应的特征是从喂食对照组或含乙醇（Lieber-DeCarli）饮食8个月的大鼠中分离出的星状细胞。的表达式两足动物,印章,附件6和附件4乙醇处理大鼠星状细胞中mRNA增加()。然而，长期乙醇喂养并没有改变通过Western blot测定的ATF6或ATF4的蛋白质水平()。乙醇喂养大鼠的星形胶质细胞显著增加了新业务流程1信使核糖核酸()类似于先前关于酒精导致胰腺损伤的研究[10].
氧化应激诱导内质网应激内质网应激相关基因的（A，B）实时定量RT-PCR分析Bip、Chop、Atf4和附件6，归一化为家务基因-肌动蛋白（A）从乙醇喂养大鼠分离的大鼠星状细胞和（B）用H处理的JS1细胞2O（运行）2（C）标准RT-PCR新业务流程1显示拼接亚型（sXbp1）增加。（D，E）ATF6和ATF4的Western blot分析，GAPDH显示为加载控制。信使RNA标准化为看家基因-肌动蛋白，表示为相对于对照的折叠变化（*P<0.05；误差条表示SEM）。蛋白质比率（标准化为GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，并在每个印迹下方的绘图中显示。数据表示3个实验的平均值(*P（P）<.05，NS=不显著）。
为了进一步验证ROS诱导星状细胞UPR，我们还通过暴露JS1（一种永生化小鼠肝星状细胞系）诱导氧化应激[14])或原代小鼠星状细胞到H2O（运行）2，一种与纤维生成刺激有关的强效前氧化物质。H（H）2O（运行）2治疗导致附件4,印章,Bip公司()和拼接新业务流程1mRNA水平()而ATF4和ATF6蛋白表达保持不变().
分泌的蛋白质需要适当折叠才能退出内质网，而蛋白质二硫异构酶（PDI）是内质网氧化还原酶中的一种，它以氧化状态依赖的方式催化这种反应[19]. 为了检测氧化应激是否诱导PDI表达，我们通过Western blot测定PDI水平。事实上，乙醇喂养大鼠的星状细胞对氧化环境的反应显示PDI水平增加(图S1).
为了研究内质网应激与纤维化之间的潜在联系，我们用经典内质网胁迫诱导剂衣霉素（TNC）处理小鼠肝星状细胞（JS1）。将这些细胞与TNC孵育（5 g/ml孵育6小时）后，细胞的mRNA表达显著增加第1列1,第12列, -脉冲多普勒频率以及-斯马(图S2A)。接下来，我们将这些发现扩展到一个小鼠体内模型，该模型因三种剂量的CCl导致短期肝损伤4（0.5 L/g体重）或硫代乙酰胺（TAA）（100 mg/g体重）每隔一天。从这些受损肝脏中新分离的星状细胞显示ATF4、ATF6的积聚(图S2B)和拼接新业务流程1mRNA水平，指示内质网应激信号，与经载体处理的小鼠细胞进行比较(图S2C).
内质网应激触发自噬和星状细胞激活
因为我们的发现主要涉及UPR分支中IRE1的诱导，所以我们接下来证实了它在活化的星状细胞中的重要性。为此，如前所述，使用编码IRE1显性阴性（DN）突变体的质粒（“DN IRE1细胞”）或空载体对照（“对照细胞”）生成稳定转染的JS1细胞[20]. DN IRE1的表达导致第11列、第12列, -脉冲多普勒频率以及-斯马mRNA()及其相应的蛋白质()与对照星状细胞相比。DN IRE1细胞对PDGF-BB诱导的促细胞生成和促生存Erk和Akt通路的激活也表现出降低的反应()并有迁移障碍（数据未显示）。
阻断IRE1通路导致星状细胞活化和自噬减少（A） 成纤维基因第11列、第12列, -斯马以及-脉冲多普勒频率信使RNA（q-rt rt-PCR）和（B）它们在表达DNIRE1或对照的JS1细胞中的蛋白表达。（C） 免疫印迹显示表达DN IRE1或对照的JS1细胞经PDGF-BB刺激后总ERK和AKT水平降低。（D） 乙醇喂养大鼠星状细胞和H处理的JS1细胞的免疫印迹2O（运行）2，显示LC3II转化率增加（LC3II/LC3I比率），P62降低。（E） 表达DNIRE1或对照的JS1细胞的免疫印迹显示，在基线条件下和（F）用溶酶体抑制剂CQ处理后，LC3降低。标准化为持家基因肌动蛋白的信使RNA表达为相对于对照的倍数变化（**P＜0.001：误差条表示SEM）；与面板B使用相同的螺栓，因此具有相同的载荷控制。数据表示至少3个实验的平均值。蛋白质比率（标准化为GAPDH或Gln合成酶）用于量化相对于对照的倍数变化，并显示在每个印迹下或作为绘图图（图2D）。数据表示至少3个实验的平均值（*P<0.05**P（P）< .001)
我们最近发现自噬是星状细胞激活所必需的[三]然而，揭示引发自噬和随后的纤维生成反应的上游事件仍然至关重要。细胞内活性氧的积累与人类肝细胞内自噬的增加有关，但尚不清楚纤维生成细胞中是否存在类似的联系[21]. 除了UPR激活外，从喂食乙醇的大鼠中分离的星状细胞和用H处理的JS1细胞2O（运行）2经免疫印迹测定，LC3II（LC3的共轭形式）的积累和选择性自噬适配器分子P62/SQSTM1的水平降低，表明自噬上调()。然而，阻断IRE1通路与自噬水平降低有关，表现为LC3结合形式的积累()。我们还使用溶酶体抑制剂CQ测量了自噬通量，该抑制剂通过阻止溶酶体酶解物降解货物，导致LC3II积累。CQ治疗导致对照细胞LC3II随时间增加，因为新的液泡正在形成，但不能降解，而DNIRE1细胞的水平保持不变，表明自噬受损()。总之，这些数据支持UPR反应的诱导触发自噬从而导致星状细胞激活的观点
IRE1以p38MAPK依赖的方式调节自噬
确定IRE1信号调节自噬的机制仍然很重要。丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路以前曾参与调节不同细胞（包括肝癌细胞系）的自噬[22-25]. 因此，我们评估了内质网应激的诱导是否与MAPK通路活性的改变有关。TNC治疗导致磷酸化p38水平显著升高()，在IRE1被阻止时被废除()。TNC的这种作用仅限于p38 MAPK，因为在TNC或DNIRE1过度表达后，磷酸化JNK水平没有改变，磷酸化ERK水平只有轻微改变(图S3)。为了解决内质网应激可能通过激活p38 MAP激酶途径刺激纤维化的可能性，我们用p38抑制剂SB203580培养JS1细胞。用这种化合物阻断p38模拟了阻断IRE1通路降低纤维生成活性的作用()降低自噬水平().
IRE1调节p38/MAPK通路（A，B）经TNC（A）处理的JS1细胞p38和磷酸化p38的蛋白质印迹，以及DN IRE1细胞的基线表达（B）。用P38抑制剂SB 203580处理的JS1细胞的COL 1、ASMA、LC3和P62的（C，D）蛋白印迹。以calnexin或GAPDH作为加载控制，进行了三种不同的实验。数据表示至少3个实验的平均值。蛋白质比率（标准化为calnexin或GAPDH）用于量化相对于对照组的折叠变化，如图所示在下面每个污点。数据表示至少3个实验的平均值(*P（P）< 0.05).”
氧化剂和内质网应激通过Nrf2诱导抗氧化反应
Nrf2是肝细胞防御氧化应激的关键介质[26]、和新业务流程1氧化应激条件下肝细胞中mRNA以Nrf2依赖方式诱导[27]. 此外，衣霉素也被证明可以诱导胰腺β细胞中的Nrf2，这表明Nrf2可能参与内质网应激反应[28]然而，Nrf2在星状细胞中的具体作用尚不清楚。因此，我们研究了Nrf2对从乙醇喂养大鼠或对照饮食中分离的星状细胞以及暴露于H2O（运行）2（20 M）持续10小时。氧化应激诱导Nrf2及其编码抗氧化酶Gst、Nqo1、Srxn1、Gclc和Gclm的靶基因的表达()。TNC治疗也能诱导Nrf2靶点的表达（数据未显示），而DNIRE1细胞显示ARE介导的基因表达和GST活性显著降低()，意味着通过IRE1途径控制抗氧化反应。
氧化应激诱导Nrf2依赖性抗氧化反应（A-C），Nqo1、Gstm、Gclc、Gclm、Srx和Nrf2型用q-rt rt-PCR评估H处理的（A）JS1细胞信使RNA的表达2O（运行）2（B） 从乙醇喂养大鼠分离的星状细胞和（C）表达DN IRE1的JS1细胞。（D）GST活动。（E）Nrf2、Nqo1、Gclc、Gstm Srx通过q-rt rt-PCR评估表达DN NRF2的星状细胞中信使RNA水平。（F） 第11列、第12列, -斯马, -脉冲多普勒频率和百万分之二通过q-rt rt-PCR评估表达DN NRF2的原代星状细胞中信使RNA水平。信使RNA标准化为看家基因-肌动蛋白，表示为相对于对照的折叠变化（*P<0.05，**P<0.001：误差条表示SEM）。数据表示至少3个实验的平均值。
GST酶超家族是Nrf2调节的最重要解毒酶之一。这些酶催化还原型谷胱甘肽的结合，中和其亲电位点，使产品更具水溶性。为了验证q-rt PCR检测到的GST下调，我们测量了GST总活性[18]. 事实上，慢性乙醇喂养或H2O（运行）2处理增加了培养的星状细胞中的GST活性，而DNIRE1细胞中GST活性降低().
谷胱甘肽在氧化应激条件下维持细胞内氧化还原平衡中起着关键作用。的速率限制步骤从头开始谷胱甘肽的合成由谷胱甘氨酸连接酶催化，该酶由催化亚基（GCLC）和修饰亚基（GC LM）组成[29]. 排除乙醇喂养大鼠的星状细胞和用H处理的JS1细胞之间的差异2O（运行）2由于谷胱甘肽缺乏，我们通过Western Blot评估GCLC和GCLM。然而，没有发现任何差异，这表明谷胱甘肽耗竭并没有引起Nrf2表达的变化(图S4).
确定抗氧化反应在星状细胞激活中的作用仍然至关重要。星状细胞对损伤的反应需要自噬上调，从而允许增殖和获得纤维生成表型，以包裹受损的实质。然而，这种最初的保护性反应的持续性变得有害。事实上，星状细胞选择性自噬抑制已被认为是一种抗纤维化策略[三]. ROS上调自噬以应对损伤，但也诱导Nrf2控制的抗氧化反应，然而，每种机制对星状细胞纤维化反应的贡献仍有待阐明。此外，据报道，星状细胞抗氧化反应的诱导通过自噬调节因子PI促进肌纤维母细胞转分化三K（K）[30]，表明星状细胞中这两种途径之间存在串扰。
为了解决Nrf2依赖性抗氧化反应的作用，我们通过表达显性阴性Nrf2突变体（DN Nrf2）来抑制星状细胞中的Nrf2活性[17] ()。Nrf2下调降低星状细胞的成纤维潜能(和图S5)不影响细胞存活。
这些数据支持这样的观点，即氧化剂损伤诱导Nrf2依赖的抗氧化反应，同时诱导纤维生成反应。
讨论
星状细胞活化是肝纤维化发生的核心机制，因此是开发新抗纤维化药物的一个有吸引力的靶点；然而，需要更好地理解与激活调节有关的途径。与其他组织的研究一致[31,32]我们的发现确立了内质网应激是一种新的细胞内途径，与肝脏的纤维化反应有关。
一旦激活，星状细胞会产生和分泌过量的胶原蛋白和细胞外基质，从而挑战细胞的内质网折叠能力。星状细胞激活需要内质网应激和UPR激活，特别是IRE1激活和Xbp1s表达。因此，我们假设IRE1/Xbp1通路可能对维持星状细胞活化至关重要。事实上，阻断星状细胞的IRE1通路会降低其成纤维潜能。
我们最近的工作确定了自噬作为星状细胞激活和纤维化形成的重要驱动因素的作用[三]然而，这一过程中自噬的具体触发因素尚不清楚。这里我们展示了，正如之前在其他器官中报道的那样[9,10,31,32]诱导UPR上调自噬。在肝损伤中，这会导致星状细胞活化和纤维化反应。我们还剖析了在内质网应激条件下这种反应的分子机制。在内质网应激条件下，丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）家族的诱导被激活[33-36]尤其是p38 MAPK在肝脏中起作用[37,38]和胰腺[39]星状细胞活化。我们的结果表明，p38MAPK与UPR的IRE1分支一起被激活，并通过自噬调节成纤维基因的表达。DNIRE1细胞中磷酸化p38的减少或p38抑制剂SB 203580治疗后，不仅减少了自噬，还减弱了纤维化，揭示了其对肝脏纤维化反应的贡献。类似的结果，支持在内质网应激条件下通过p38MAPK诱导自噬，已在Pompe病患者的人成纤维细胞中报道[33].
由于氧化应激经常伴随肝纤维化形成，是星形细胞活化和胶原沉积的明确决定因素[19,40]，我们假设它也可能触发UPR。如之前在其他器官中报告的那样[9,10]、乙醇或H引起的氧化应激2O（运行）2治疗刺激内质网应激并诱导UPR激活。在星状细胞中，这种反应涉及IRE1/Xbp1分支并增加自噬水平。
在肝细胞中，氧化应激通过激活转录因子Nrf2诱导抗氧化反应[26]. Nrf2在编码ROS脱毒酶和其他抗氧化蛋白的基因启动子中与ARE结合，包括Gst、Nqo1、Srxn1、Gclc和Gclm以及Nrf2本身。在肝细胞中，Nrf2诱导在不同类型的肝损伤后起到保护作用[6,41-43]，增强肝细胞的存活和再生。然而，其在星状细胞中的作用尚未得到充分研究，之前的研究也没有评估过在这种细胞类型中操纵Nrf2活性的影响。此外，尚未批准任何抗氧化剂药物用于治疗肝纤维化。我们发现氧化应激（H2O（运行）2治疗和乙醇喂养）以及内质网应激通过IRE1途径诱导肝星状细胞中Nrf2依赖性解毒酶和抗氧化蛋白的表达。以前的研究表明，与静止的HSC相比，激活的HSC增加了ARE信号通路的激活[44]这可能为肝星状细胞抵抗肝损伤期间的氧化损伤提供了抵抗力。然而，这种耐药性可能通过刺激自噬促进其增殖和细胞外基质的生成。在另一项星状细胞研究中[30]叔丁基对苯二酚（tBHQ），一种已知的ARE基因诱导物，通过Nrf2刺激抗氧化反应和肌成纤维细胞转分化，增加成纤维基因表达。有趣的是，当tBHQ与自噬抑制剂LY294002合用时，这种作用被消除了[30]. 在我们当前的研究中，阻断IRE1通路可显著降低纤维生成并下调Nrf2介导的反应。此外，DNNrf2细胞显示ARE基因的mRNA表达降低。总之，这些数据表明，星状细胞ARE反应的激活可能通过其自噬的初级刺激而增强成纤维反应，而不受其对氧化应激的影响。
总之，我们的数据支持这样的观点，即氧化应激扰乱内质网稳态，激活星状细胞中的UPR，从而促进细胞激活。IRE1-Xbp1通路的激活以p38依赖性的方式触发自噬和Nrf2依赖性抗氧化反应，以应对损伤，但其长期激活可能通过自噬调节促进纤维化反应和肝纤维化。这一证据为探索特异性阻断星状细胞IRE1作为抗纤维化策略提供了理论基础。
鸣谢
基金美国国立卫生研究院资助DK56621、AA020709、P20AA017067和1K05AA018408。莫伊拉·希尔舍尔（Moira Hilscher）得到霍华德·休斯医学院医学生研究奖学金（Howard Hughes Medical Institute Medical Student Research Fellowship）的支持。
脚注
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[3]Hernandez-Gea V、Ghiassi-Nejad Z、Rozenfeld R、Gordon R、Fiel MI、Yue Z等。自噬释放脂质，通过激活小鼠和人体组织中的肝星状细胞促进纤维化。胃肠病学。2012;142:938–946. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [4]Yoon YH，Yi HY.输入：监测报告75：1970年至2003年美国肝硬化死亡率。NIAAA，编辑。Bethesda，医学博士：2003年。2003[谷歌学者] [5]Purohit V，Brenner DA。酒精诱导肝纤维化的机制：罗恩·瑟曼研讨会综述。肝病学。2006;43:872–878.[公共医学][谷歌学者] [6]在啮齿动物肝脏和HepG2细胞中，CYP2E1增加了Gong P，Cederbaum AI.Nrf2，并保护其免受CYP2E1引起的氧化应激。肝病学。2006;43:144–153.[公共医学][谷歌学者] [7]Keum YS，Han YH，Liew C，Kim JH，Xu C，Yuan X，等。酚类抗氧化剂丁基羟基茴香醚（BHA）及其代谢物叔丁基对苯二酚（tBHQ）对人和大鼠原代培养肝细胞中血红素氧化酶-1（HO-1）和NAD[P]H:醌氧化还原酶1（NQO1）的诱导作用。药物研究。2006;23:2586–2594.[公共医学][谷歌学者] [8]Nguyen T、Nioi P、Pickett CB。Nrf2-抗氧化反应元件信号通路及其氧化应激激活。生物化学杂志。2009;284:13291–13295. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [9]Chen G，Ma C，Bower KA，Shi X，Ke Z，Luo J.乙醇促进内质网应激诱导的神经元死亡：氧化应激的参与。神经科学研究杂志。2008;86:937–946. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [10]Lugea A，Tischler D，Nguyen J，Gong J，Gukovsky I，French SW等。适应性未折叠蛋白反应减轻酒精诱导的胰腺损伤。胃肠病学。2011;140:987–997. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [11]Schroder M，Kaufman RJ。哺乳动物展开蛋白质反应。生物化学年度收益。2005;74：739–789。[公共医学][谷歌学者] [12]Tirasophon W，Welihinda AA，Kaufman RJ。从内质网到细胞核的应激反应途径需要哺乳动物细胞中的新型双功能蛋白激酶/内核糖核酸酶（Ire1p）。基因发育。1998;12:1812–1824. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [13]Blomhoff R，Berg T.大鼠肝星状细胞的分离和培养。方法酶制剂。1990;190:58–71.[公共医学][谷歌学者] [14]郭J，洛克J，郑F，洪F，Yea S，Fukata M，等。肝硬变患者Toll样受体4单核苷酸多态性与肝星状细胞反应的功能联系。肝病学。2009;49：960–968。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [15]Urtasun R，Cubero FJ，Nieto N.氧化应激调节KLF6（Full）及其拼接变体。酒精临床实验研究。2012 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [16]Lieber CS，DeCarli LM公司。乙醇给药的液体饮食技术：1989年更新。酒精酒精。1989;24:197–211.[公共医学][谷歌学者] [17]auf dem Keller U、Huber M、Beyer TA、Kumin A、Siemes C、Braun S等。角质形成细胞中的Nrf转录因子对皮肤肿瘤的预防至关重要，但对伤口愈合却不重要。分子细胞生物学。2006;26:3773–3784. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [18]Habig WH、Pabst MJ、Jakoby WB。谷胱甘肽S-转移酶。巯基酸形成的第一个酶步骤。生物化学杂志。1974;249:7130–7139.[公共医学][谷歌学者] [19]Shimizu Y，Hendershot LM。氧化折叠：处理生成的活性氧物种等摩尔生成的细胞策略。抗氧化剂氧化还原信号。2009;11:2317–2331. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [20]Lim MP、Devi LA、Rozenfeld R.Cannabidiol通过内质网应激诱导凋亡的机制导致活化的肝星状细胞死亡。细胞死亡疾病。2011;2：e170。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [21]Bhogal RH、Weston CJ、Curbishley SM、Adams DH、Afford SC。自噬：一种细胞保护机制，可在氧化应激期间防止人类原代肝细胞凋亡。自噬。2012;8 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [22]Ogata M、Hino S、Saito A、Morikawa K、Kondo S、Kanemoto S等。内质网应激后，细胞存活激活自噬。分子细胞生物学。2006;26:9220–9231. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [23]Wang J、Whiteman MW、Lian H、Wang G、Singh A、Huang D等。非规范MEK/ERK信号通路通过调节Beclin 1调节自噬。生物化学杂志。2009;284:21412–21424. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [24]Xu P，Das M，Reilly J，Davis RJ。JNK调节神经元中FoxO依赖性自噬。基因发育。2011;25:310–322. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [25]Chen KL，Chang WS，Cheung CH，Lin CC，Huang CC，Yang YN，等。靶向组织蛋白酶S通过EGFR-ERK信号通路诱导肿瘤细胞自噬。癌症快报。2012;317:89–98.[公共医学][谷歌学者] [26]Xu W，Hellerbrand C，Kohler UA，Bugnon P，Kan YW，Werner S，等。Nrf2转录因子可防止毒素诱导的肝损伤和纤维化。实验室投资。2008;88:1068–1078.[公共医学][谷歌学者] [27]Kwak MK、Wakabayashi N、Itoh K、Motohashi H、Yamamoto M、Kensler TW。癌症化学预防性二硫醚通过Keap1-Nrf2途径调节基因表达。用于细胞存活的新型基因簇的鉴定。生物化学杂志。2003;278:8135–8145.[公共医学][谷歌学者] [28]Lee S、Hur EG、Ryoo IG、Jung KA、Kwak J和Kwak MK。Nrf2-蛋白酶体途径参与胰腺β细胞内质网应激反应。毒理学应用药理学。2012;264：431–438。[公共医学][谷歌学者] [29]Wu G、Fang YZ、Yang S、Lupton JR、Turner ND。谷胱甘肽代谢及其对健康的影响。营养学杂志。2004;134:489–492.[公共医学][谷歌学者] [30]Reichard JF，Petersen DR。磷脂酰肌醇3-激酶和细胞外调节激酶在肝星状细胞抗氧化反应和肌纤维母细胞转分化中的作用。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2006;446:111–118.[公共医学][谷歌学者] [31]Lawson WE、Cheng DS、Degrese AL、Tanjore H、Polosukhin VV、Xu XC等。内质网应激促进肺纤维化重塑。美国科学院学报。2011;108：10562–10567。 [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [32]Baek HA、Kim do S、Park HS、Jang KY、Kang MJ、Lee DG等。内质网应激在肺成纤维细胞肌纤维母细胞分化中的作用。美国呼吸细胞分子生物学杂志。2012;46:731–739.[公共医学][谷歌学者] [33]Shimada Y、Kobayashi H、Kawagoe S、Aoki K、Kaneshiro E、Shimizu H等。内质网应激通过激活携带c.546G>T突变的蓬贝病患者成纤维细胞中的p38 MAPK诱导自噬。分子遗传学。2011;104:566–573.[公共医学][谷歌学者] [34]Kim DS、Kim JH、Lee GH、Kim HT、Lim JM、Chae SW等。p38有丝分裂原激活蛋白激酶参与内质网应激诱导的人牙龈成纤维细胞的细胞死亡和自噬。生物制药牛。2010;33:545–549.[公共医学][谷歌学者] [35]Kawakami T、Inagi R、Takano H、Sato S、Ingelfinger JR、Fujita T等。内质网应激诱导肾近端小管细胞自噬。肾拨号移植。2009;24:2665–2672.[公共医学][谷歌学者] [36]Hamamura K，Goldring MB，Yokota H。p38 MAPK参与调节软骨细胞中MMP13 mRNA，以应对内质网生存应激。口腔生物学Arch。2009;54:279–286. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [37]Reeves HL，Dack CL，Peak M，Burt AD，Day CP。培养中大鼠肝星状细胞激活中的应激激活蛋白激酶。《国际肝病杂志》。2000;32:465–472.[公共医学][谷歌学者] [38]Furukawa F、Matsuzaki K、Mori S、Tahashi Y、Yoshida K、Sugano Y等。p38 MAPK通过大鼠肌成纤维细胞中Smad3磷酸化介导成纤维信号。肝病学。2003;38:879–889.[公共医学][谷歌学者] [39]Masamune A、Satoh M、Kikuta K、Sakai Y、Satoh-A、Shimosegawa T。抑制p38有丝分裂原活化蛋白激酶可阻断大鼠胰腺星状细胞的活化。药理学实验与治疗杂志。2003;304:8–14.[公共医学][谷歌学者] [40]Svegliati-Baroni G、Ridolfi F、Di Sario A、Saccomanno S、Bendia E、Benedetti A等。人体肝星状细胞中乙醛诱导胶原和纤维连接蛋白基因表达的细胞内信号通路。肝病学。2001;33:1130–1140.[公共医学][谷歌学者] [41]Chan K、Han XD、Kan YW。Nrf2在对抗氧化应激中的一个重要功能：对乙酰氨基酚的解毒。美国国家科学院院刊。2001;98:4611–4616. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [42]Tan KP，Yang M，Ito S.有毒胆汁酸激活核因子（类红细胞2）因子2可激发适应性防御反应，以提高氧化应激出现时的细胞存活率。摩尔药理学。2007;72:1380–1390.[公共医学][谷歌学者] [43]Beyer TA、Xu W、Teupser D、auf dem Keller U、Bugnon P、Hildt E等。Nrf2基因敲除小鼠肝再生受损：ROS介导的胰岛素/IGF-1抵抗的作用。EMBO J。2008;27:212–223. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] [44]Vasiliou V，Qamar L，Pappa A，Sophos NA，Petersen DR。电泳反应元件和p53参与肝星状细胞的活化，作为电泳甲萘醌的反应。生物化学与生物物理学Arch Biochem Biophys。2003;413：164–171。[公共医学][谷歌学者] 
