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癌症研究。作者手稿；PMC 2014年5月15日提供。
以最终编辑形式发布为：
癌症研究，2013年5月15日；73(10): 2998–3006.
2013年4月12日在线发布。 数字对象标识：10.1158/0008-5472.CAN-12-4402
预防性维修识别码：项目经理3684066
NIHMSID公司：美国国立卫生研究院458944
PMID：23585457

脂肪细胞通过释放谷氨酰胺引起白血病细胞对L-天门冬氨酸酶的耐药性

Ehsan A.Ehsanipour公司,1 夏胜,1 詹姆斯·比汉,1 王兴超,2 安娜·布图里尼,三 Vassilios I.Avramis公司,三，4,5,6和史蒂文·米特尔曼1,4,5,6,7
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

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摘要

肥胖是癌症的重要危险因素。肥胖与儿童癌症之间的联系已被确定：被诊断为高危急性淋巴细胞白血病（ALL）的肥胖儿童的复发风险比瘦弱儿童高50%。L-天冬酰胺酶（ASNase）是一种一线治疗ALL的药物，它可以分解天冬酰胺和谷氨酰胺，利用ALL细胞比其他细胞更依赖这些氨基酸的事实。在本研究中，我们研究了产生大量谷氨酰胺的脂肪细胞是否可以抵消ASNase的作用。在接受高危ALL治疗的儿童中，肥胖与血浆天冬酰胺或谷氨酰胺水平的改变无关。然而，诱导化疗后，骨髓脂肪细胞中谷氨酰胺合成酶显著增加。肥胖严重损害了移植有同基因ALL细胞的小鼠的ASNase疗效，与人类一样，不会影响血浆天冬酰胺或谷氨酰胺水平。在共培养中，脂肪细胞抑制ASNase诱导的白血病细胞毒性，这种保护依赖于谷氨酰胺分泌。这些发现表明，脂肪细胞与白血病微环境中的其他细胞协同工作，在ASNase治疗期间保护白血病细胞。

关键词：淋巴母细胞白血病、肥胖、肿瘤微环境、DIO小鼠模型、脂肪细胞

介绍

肥胖与全球癌症发病率和死亡率的大幅增加有关(1)据估计，美国20%的癌症是由肥胖引起的(2). 除了癌症发病率增加外，肥胖似乎还降低了一些癌症的生存率，包括急性淋巴细胞白血病（ALL）(三,4). 这种生存率受损似乎是肥胖的直接影响，而不是由于治疗并发症或毒性风险增加(三). 肥胖与癌症之间的联系机制仍不清楚(5).体内和在体外我们实验室开发的模型(6)已经证明肥胖损害了化疗药物对ALL细胞的疗效，可能是由脂肪细胞介导的。因为白血病影响了2000名儿童(7)美国每年有超过40000名成年人(8)了解并逆转肥胖与白血病复发之间的关系可以预防显著的癌症死亡率。

L-天冬酰胺酶（ASNase）是儿童ALL治疗的基石(9)，在成人化疗方案中的应用越来越多(10). ASNase将氨基酸天冬酰胺（ASN）和谷氨酰胺（GLN）分别水解为天冬氨酸和谷氨酸(11). 在美国，最常用的酶形式是大肠杆菌，ASN的底物特异性是GLN的100倍(12). 由于ALL细胞依赖ASN和GLN生存和增殖(11,13)，ASNase的疗效取决于白血病微环境中ASN和GLN的耗竭(14,15). 由于脂肪组织是全身GLN库的主要贡献者(16)，肥胖可能损害GLN消耗。此外，有人提出，在ASNase治疗期间，非恶性细胞可能通过局部分泌氨基酸支持白血病细胞(17)，一个最近被进一步探讨的想法(18–21).

在此，我们报告了脂肪细胞，它们在骨髓中丰富，有助于保护白血病微环境(6)产生ASN和GLN，可以保护附近的白血病细胞免受ASNase的侵袭。

材料和方法

人体受试者

在高危白血病治疗前和治疗期间，对19名10–18岁的患者进行了骨髓活检和血样采集。肥胖被定义为BMI大于或等于95第个百分位数符合CDC指南。所有患者均按照高危CCG/COG方案进行治疗，包括四种药物诱导方案，包括4周的类固醇和PEG ASNase（25000 IU/m）2单次肌肉注射或静脉注射）。根据CHLA临床调查委员会（机构审查委员会）批准的方案，在获得书面知情同意和同意后获取样本。研究人群的特征见表S1.

细胞系和培养

如前所述，将3T3-L1细胞（ATCC、Manassas、VA）分化为脂肪细胞(6)，用于分化第+7天和第+14天之间的实验。对未分化的3T3-L1成纤维细胞进行照射，并在汇合处进行铺板。骨髓来源的间充质细胞系OP9以类似的方式分化为脂肪细胞。

之前从BCR/ABL转基因小鼠（“8093细胞”）中分离出小鼠前B ALL细胞(22). 人白血病细胞系来源于ATCC和DSMZ，包括BV173（Pre-B Ph+ALL）、K562（慢性粒细胞白血病）、Molt-4（T细胞白血病），Nalm-6（B细胞前体白血病）、RCH-ACV（Pre-B-ALL与E2A-PBX1融合蛋白）、RS4；11（前B t（4；11）ALL）、SD-1（前B Ph+ALL），EM（B细胞前体）和SupB15（B细胞后体）。

原代人白血病细胞在（NOD.Cg）中传代-Prkdc公司科学情报部Il2rg公司tm1Wjll公司/SzJ小鼠（Jackson Laboratories），从这些小鼠的脾脏中提取，并在所有实验中培养在辐照过的OP9饲养层上。这些细胞由Markus Müschen、Yong Mi Kim和Nora Heisterkamp好心提供(23). 这些细胞以下称为人类白血病细胞。US7和US7R来自一名Ph阴性患者，在患者复发之前。TXL-2和BLQ-1 ALL细胞为Ph阳性，在诊断时取自患者。

用DMEM和10%透析过的FBS制备天门冬氨酸/无谷氨酰胺（AGF）培养基。使用3kDa SnakeSkin透析管（Thermo Fisher Scientific）将FBS与100体积的PBS进行三次透析。HPLC分析证实去除了所有氨基酸。

为了确定ASN或GLN依赖性，将细胞在单独的AGF培养基、2mM GLN、400uM ASN或两种氨基酸中接种到96孔板上。72小时后，使用瑞舒林（R&D Systems，MN）测量细胞生长。在OP9饲养层上对人类白血病细胞进行实验，并由盲法观察者在剧烈研磨后使用台盼蓝对饲养层内和下方的细胞进行计数。

体内白血病模型

将10000个8093细胞逆向注射到46只饮食诱导肥胖（DIO；从脂肪饮食中摄取60%的热量）和42只非肥胖（从脂肪中摄取10%的热量）C57Bl6/j小鼠（Jackson Laboratories）中。植入后7至10天，小鼠接受ASNase或载体治疗，与体重成比例（3000 IU/kg/天，5天/周，通过腹腔注射×3周，Elspar，Ovation Pharmaceuticals）。使用聚乙二醇化ASNase（3000 IU/kg/周×3周，Enzon Pharmaceuticals，NJ）进行其他实验。在患上进行性白血病（体重减轻>10%、瘫痪、驼背或可触及肿块>1cm）时，对动物实施安乐死。在氯胺酮/噻嗪麻醉下，用肝素化生理盐水对其他移植和治疗小鼠进行心脏灌注，以分析组织ASNS和GS水平。收集脂肪垫，称重，在液氮中速冻，并在−80°C下储存。所有动物研究均由动物护理和使用委员会批准。

共培养实验

白血病细胞与成纤维细胞、脂肪细胞或无饲养层培养。在耐药性实验中，添加ASNase以获得近似IC5072小时后，按上述方法对细胞进行计数。在其他实验中，将8093个细胞培养在与饲养层分离的0.4μm孔径TransWells（Corning，Inc.，Lowell，MA）中。为了抑制谷氨酰胺合成酶（GS），用1.5 mM蛋氨酸亚砜胺（MSO）处理脂肪细胞过夜，并在实验前清洗三次。通过高效液相色谱法测定GLN分泌，证实GS完全抑制。Paul Plourde博士（宾夕法尼亚州朗霍恩Jazz Pharmaceuticals公司）为实验评估提供了Erwinase试验药物，并按照Nessler反应确定的具有等效天冬酰胺脱氨活性的剂量使用(24). 在FACScan（BD Biosciences，CellQuest软件）上通过BrdU掺入（BD bioscience，San Jose，CA）对TransWells中的8093个细胞进行培养48小时后的细胞周期和凋亡分析。

氨基酸分析和样品制备

为了测量氨基酸分泌，饲养层在上述24孔板中培养，用PBS洗涤两次，然后在每孔AGF培养基中培养1 mL。收集培养基，通过0.45μm注射器过滤器过滤，并快速冷冻。所有样品均在−80°C下储存，直至检测。

用灌注小鼠的脂肪垫测量组织外植体氨基酸的生成。将脂肪切成约50 mg块，用PBS彻底清洗，并放置在24孔培养板中，用1mL AGF培养基进行调节。

从未麻醉小鼠的下颌下神经丛中采集血液，放入BD-EDTA涂层的Microtainer管中，冷却至4°C以防止体外脱氨，在13000g下旋转，然后快速冷冻血浆。

如前所述，进行小鼠血浆和条件培养基氨基酸测量(25)稍作修改。使用含有1.0 mM L-去甲亮氨酸（内标物，Sigma）的20%5-磺基水杨酸对样品进行脱蛋白。样品在speedvac中干燥，用衍生试剂（甲醇、TEA、H20和PITC，比例为7:1:1:1）再次悬浮，然后再次干燥。使用Waters 1525 Binary HPLC泵测量样品，并在254nm处检测吸光度。

临床血浆氨基酸样品在临床实验室进行测定。简单地说，样品用5-磺基水杨酸脱蛋白，然后添加N克-甲基精氨酸。使用邻苯二甲醛（OPA）和3-巯基丙酸（MPA）的混合溶液进行在线衍生。衍生化和中和后，将5μl注入HPLC。在Synergi 4U Fusion RP80A C18柱（110×4.6mM）和保护柱（2 Fusion RP 4.0×3.0mm）（均来自Phenomenex，Torrance，CA，USA）上进行分离，使用荧光检测器通过其在λ前任：340 nm，λ相对长度单位：455纳米

蛋白质印迹

如前所述，从白血病细胞、培养的脂肪细胞和灌注小鼠的脂肪组织中提取蛋白质(6)细胞裂解物在NovexR三甘氨酸预制凝胶（Invitrogen）上分离，并转移到0.2μm硝化纤维素膜（Invit罗gen）。然后将膜与小鼠抗GS单克隆抗体（Abcam）、兔抗ASNS多克隆抗体（Abcam）或兔抗GAPDH抗体（细胞信号技术）以及来自细胞信号技术的适当辣根过氧化物酶偶联二级抗体孵育。使用HyGLO HRP检测试剂盒（Denville）开发膜。为了进行脂肪垫蛋白印迹的组间比较，在所有凝胶上运行K562细胞裂解物（ASNS、GS和GAPDH阳性），并用于校正暴露时间和运行差异。使用ImageJ软件量化波段强度(网址：http://rsb.info.nih.gov/ij/).

免疫组织化学

多聚甲醛固定的骨髓样本用石蜡包埋，切片，并由CHLA病理核心安装。切片用Tris-EDTA进行抗原回收，pH 8.0，蒸汽30分钟。用3%H灭活内源性过氧化物酶2O（运行）2用2.5%的正常山羊血清阻断非特异性染色，然后用兔抗鼠GS或ASNS（Abcam，Cambridge，MA）染色，并用含有聚合过氧化物酶标记的山羊抗兔免疫球蛋白（小鼠吸附）的ImmPRESS试剂（Vector Laboratories Inc.，Burlingame，CA）进行检测。用ImmPACT DAB（Vector Laboratories Inc.）检测反应，并用迈尔苏木精进行复染。图像由蔡司Axioplan显微镜（40x/1.3）和SPOT QE彩色数码相机采集。

计算和统计

体重与未配对的双侧t检验进行比较。生存曲线由Kaplan-Meier生命表生成，并使用Cox比例危害进行比较。每个共培养实验在不同的日子或使用不同的细胞解冻进行，并计算每个实验中每个条件下三个三重微孔的平均值。配对t检验用于比较不同饲养层中存活白血病细胞的数量。小于0.05的p值被认为是显著的。

结果

白血病微环境中的脂肪细胞产生谷氨酰胺

我们和其他人之前发现，肥胖会使高危ALL青少年的治疗结果恶化(三,4). 为了测试肥胖是否会损害ASNase的疗效，我们测量了高危ALL诱导化疗前后青少年的血浆氨基酸水平，其中包括单剂量PEG-ASNase。肥胖和消瘦受试者的氨基酸水平没有显著差异，ASN被ASNase完全抑制，GLN在两组中基本上未受影响(图1A).

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L-天冬酰胺酶治疗后肥胖对患者血浆和骨髓天冬酰胺和谷氨酰胺的影响

（A） 在CCG1961治疗的新诊断高危急性淋巴细胞白血病（ALL）诱导化疗期间，瘦削和肥胖患者血浆ASN（左）和GLN（右）的氨基酸测量，包括单剂量2500 IU/m2聚乙二醇化L-天冬酰胺酶。（B） 诱导化疗前后取4名瘦弱（Pt1-4）和4名肥胖（Pt5-8）儿童骨髓进行ASN合成酶（ASNS，左）和GLN合成蛋白酶（GS，右）染色。图像由蔡司Axioplan显微镜（40x/1.3）和SPOT QE彩色数码相机采集。校准条（右上图像）为50μm。

由于血浆氨基酸水平可能无法反映白血病微环境的状况，我们检查了四名肥胖和四名瘦弱青少年白血病患者的骨髓活检标本，以检测ASN合成酶（ASNS）和GLN合酶（GS）的表达，这是ASN和GLN产生的限速步骤。在整个骨髓中发现ASNS阳性细胞，治疗后表达似乎没有变化(图1B). 治疗前，GS表达较低，似乎局限于分散的脂肪细胞。如前所示，治疗后脂肪细胞所占面积大幅增加(26)以及这些细胞中GS的明显增加。

肥胖损害小鼠L-天门冬氨酸酶的功效

测试是否肥胖本身我们在20±2周龄时用同基因白血病细胞移植饮食诱导肥胖（DIO，41.5±4.4 g）和非肥胖（30.4±2.0 g，p<0.001）雄性小鼠(6). 与体重成比例地服用ASNase，非肥胖小鼠的存活时间比载体延长（33.4±12.0 vs 26.6±5.6天，p<0.01），但对肥胖小鼠没有明显的存活益处（26.4±7.5天，p<0.0001 vs.非肥胖，p=n.s.vs.载体，图2A). 经溶媒治疗的非肥胖小鼠和肥胖小鼠的存活率没有差异（28±4.5 vs 26±4.2，数据未显示）。在使用更稳定的聚乙二醇化形式的ASNase治疗后，肥胖同样会降低生存率（p<0.05，肥胖与非肥胖，图2B). 血浆氨基酸水平显示出与人类相似的模式，饮食组之间没有差异(图2C). 饮食组之间单剂量服用大肠杆菌ASNase后血浆ASNase活性也没有显著差异，尽管肥胖小鼠的ASNase水平往往高于非肥胖小鼠(图2D). 因此，与人类相似，肥胖小鼠表现出受损的白血病结局，血浆ASN或GLN没有显著差异。

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饮食诱导的肥胖损害白血病小鼠的L-天门冬氨酸酶治疗

（A） 移植8093白血病细胞并用ASNase治疗的小鼠存活率。实线，肥胖小鼠（n=28）；黑色虚线、非肥胖小鼠（n=31）、灰色虚线、车辆治疗小鼠（n=10）。灰色条表示治疗期。p<0.001肥胖与非肥胖。（B） 聚乙二醇化L-天门冬氨酸酶治疗的移植小鼠存活率（n=5），肥胖组与非肥胖组相比p<0.01。（C） 用上述剂量的ASNase治疗前后白血病性肥胖或非肥胖小鼠的血浆ASN和GLN浓度。（D） 单剂量3000 IU/kg的大肠杆菌L-天门冬酰胺酶治疗白血病肥胖小鼠和对照小鼠后的血浆天门冬氨酸酶活性。（E）辐照3T3-L1成纤维细胞（通道1）和3T3-LI脂肪细胞（通道2-4）的代表性western blot。在不进行额外处理的情况下（第2道）或在暴露于无ASN/GLN培养基（第3道）、1 IU/mL ASNase（第4道）或125nM地塞米松（第5道）72小时后收集脂肪细胞。（F） 用L-天冬酰胺酶治疗肥胖白血病小鼠之前（前）和之后（后）5天脂肪组织中ASNS和GS水平的Western blot。

与人类不同，我们没有观察到ASNase治疗小鼠骨髓GS表达的变化(图S1). 同样，尽管如前所示，3T3-L1脂肪细胞中的GS显著高于未分化的3T3-LI细胞(27)，在ASN和GLN耗竭（AGF）培养基中培养72小时后，ASNS和GS的表达似乎降低(图2E). 因此，我们考虑了在人类样本中发现的GS增加是否可能是由诱导期间的另一种化疗引起的。事实上，地塞米松使3T3-L1脂肪细胞GS水平增加了2倍，如其他研究所示(28).

因为我们已经证明，在治疗过程中，ALL细胞浸润脂肪组织(6)，我们接下来研究了GS在脂肪组织中的表达。通过western blot分析，小鼠脂肪组织表达可检测到的GS，但不表达ASNS(图2F). 此外，野生型C57小鼠的脂肪组织外植体向培养基中分泌GLN（105.69±53.00 nmol/100 mg组织/24小时），但不分泌ASN(表1). 连续五天每天给肥胖小鼠服用ASNase，导致皮下脂肪中GS表达增加约50%(图2F)，但对其他脂肪垫没有总体影响(图S2). 我们观察到肥胖和瘦小鼠脂肪垫中GS的表达没有显著差异(图S3). ASNase给药也没有导致脂肪垫中可检测的ASNS蛋白表达（未显示）。

表1

72小时以上细胞分泌的ASN和GLN

单元格类型ASN，nmol/mLGLN（毫摩尔/毫升）
3T3-L1纤维<0.00523±27
3T3-L1阿迪波（AGF）23±13417±176
3T3-L1阿迪波（+ASP、GLU、GLN）一87±15-
3T3-L1 Adipo（MSO处理）1.6±2.656±50
脂肪外植体（100mg）<0.005247±43
一补充400uM天冬氨酸、400uM谷氨酸和2000uM谷氨酰胺。

体外，3T3-L1脂肪细胞分泌少量ASN。用ASN合成所需的底物、天冬氨酸和GLN以及GLN前体谷氨酸补充培养基，可增加脂肪细胞的ASN分泌(表1). 脂肪细胞分泌大量GLN，约为未分化3T3-L1细胞的18倍。

脂肪细胞通过产生GLN保护白血病细胞免受ASNase的侵袭

为了确定脂肪细胞是否能够保护ALL细胞免受ASNase的侵袭，我们在含有1IU/mL ASNase培养基中，将8093只小鼠ALL细胞培养在辐照的3T3-L1成纤维细胞样细胞或分化的3T3_L1脂肪细胞上。3T3-L1脂肪细胞保护ALL细胞免受ASNase的直接接触和非直接接触(图3A). 从OP9骨髓间充质细胞分化的脂肪细胞也观察到类似的模式(图3B). ASNase暴露期间，脂肪细胞保护与凋亡减少和细胞周期增加相关(图3C和第3章).

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脂肪细胞保护白血病免受ASNase感染在体外

（A） 8093个白血病细胞在1 IU/mL ASNase中与3T3-L1成纤维细胞（阴影条）或脂肪细胞（实心条）直接（左侧，n=5）或TransWell分离（右侧，n=6）共培养72小时，而不是单独培养（灰色条）。虚线表示以骨髓源性OP9成纤维细胞或脂肪细胞作为饲养层（n=4），如上所述电镀8093个细胞的初始细胞数。（C） 在不同饲养层上的TransWells中共同培养48小时后，通过流式细胞仪在8093个细胞中测量BrdU掺入量，包括或不包括ASNase处理（n=4）。*，与无药物配对t检验相比P<0.05

由于脂肪细胞同时产生ASN和GLN，我们接下来测试这两种氨基酸是否对脂肪细胞保护ALL细胞免受ASNase的伤害负责。每天两次添加ASN对ASNase细胞毒性没有影响(图4A)而补充GLN部分阻断了ASNase的细胞毒性(图4B). MSO是一种不可逆的GS抑制剂，预处理使脂肪细胞无法保护ALL细胞免受ASNase的侵袭(图4C). 同样，使用Erwinase，一种天冬酰胺酶，其谷氨酰胺酶活性比大肠杆菌ASNase公司(12)，能够抑制脂肪细胞的保护作用(图4D).

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脂肪细胞的保护依赖于谷氨酰胺的产生

（A+B）8093细胞与1 IU/mL ASNase培养72小时，每12小时添加ASN（A，n=3）或GLN（B，n=4）。*与不添加相比，P<0.05。（C） 在1 IU/mL ASNase存在下，将8093个细胞接种在无饲养者（N）、3T3-L1脂肪细胞（A）或MSO处理的脂肪细胞（A-MSO）上。（D） 8093白血病细胞在1 IU/mL ASNase或Erwinase中培养72小时，无饲养层（灰色条）、3T3-L1成纤维细胞（阴影条）或脂肪细胞（实心条）。n=3；*，与无药物配对t检验相比，P<0.05。（E） 人类白血病细胞系在脂肪细胞（黑色柱）、成纤维细胞（阴影柱）或无饲养层（灰色柱；n=4）的Transwells中缺乏ASN和GLN的培养基中培养72小时后的存活率。虚线表示电镀电池的初始数量。

脂肪细胞还保护人类白血病细胞株免受ASNase（未显示）和缺乏ASN和GLN的培养基（AGF培养基，图4E). 为了确定人类白血病细胞对哪些氨基酸敏感，我们在缺乏ASN、GLN或两者都缺乏的培养基中培养了10个白血病细胞系(图5A). 10个人类白血病细胞系中只有3个对从培养基中去除ASN敏感，而10个细胞系中有8个对去除GLN敏感。所有被测品系对这两种氨基酸的去除最敏感。在四个人类白血病细胞（BLQ1、Txl2、US7、US7R）的类似试验中(23)，一条线对ASN的去除敏感，三条线对GLN的去除灵敏，四条线对两种氨基酸的去除都敏感(图5B). ASNS或GS表达不能解释对任一氨基酸的敏感性(图5C) (29).

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白血病细胞对谷氨酰胺的依赖性高于天冬酰胺

（A） 与完全培养基（垂直线条，n=4）相比，在无天冬氨酸培养基（白色条）、无谷氨酰胺培养基（水平线条）或缺乏两种氨基酸的培养基（阴影黑色条）中培养时，一个小鼠和九个人类白血病细胞系的增殖。（B） 在培养基中与OP9饲养层直接共培养的四个人类白血病细胞的增殖，如（A）所示（n=4）。（C） EC前后ASNS和GS蛋白表达的代表性western blot50四种人类细胞系中ASNase的剂量。*，P<0.05

讨论

尽管肥胖被认为是白血病进展和复发的主要因素，但肥胖损害治疗结果的确切机制尚不清楚。为了阐明肥胖在白血病治疗中的作用，我们调查了一线化疗药物L-天门冬氨酸酶的使用情况，尽管它在临床上使用了50多年，但仍在研究中，以确定理想的治疗策略。几项研究表明，ASNase强化治疗或更长时间治疗可改善患者预后(30,31)虽然药物接触不足，如无症状超敏反应，与复发风险较高相关(32). ASNase的细胞毒性依赖于其从血浆中消耗ASN和GLN的能力。这有效地使淋巴细胞挨饿，而淋巴细胞与大多数其他细胞不同，无法通过重新生成维持自身(11). ASNase的有效使用传统上是通过血浆ASN和GLN或其替代物血浆天冬酰胺酶活性的耗竭来衡量的(33).

在我们的小鼠白血病模型中，ASNase对肥胖小鼠的治疗效果不如非肥胖小鼠。值得注意的是，肥胖和非肥胖小鼠在任何时间点的血浆氨基酸水平都没有显著差异，尽管存活率有显著差异。无论饮食组，血浆ASN仍被抑制，而GLN在12小时内开始恢复。同样，在患者样本中，GLN也没有受到抑制，尽管本研究没有对早期时间点进行采样。尽管在其他研究中发现了反弹效应(34)其机制尚不清楚，可能是恶病质期间内源性GLN合成增加或组织GLN释放增加的结果。我们记录了诱导结束时从ALL患者收集的骨髓中GS的显著增加，但在ASNase治疗小鼠后脂肪组织或骨髓中没有GS的明显增加。虽然这种差异可能是由于物种对血浆中ASN和/或GLN耗竭的特异性反应造成的，但更可能是由于在人类ALL中使用联合化疗造成的。特别是，糖皮质激素已被证明在一些组织中诱导GS(28)我们发现地塞米松治疗导致3T3-L1脂肪细胞中GS蛋白水平升高。糖皮质激素诱导GS损害ASNase疗效的可能性，特别是在肿瘤微环境中，可能是未来研究的目标。

GLN是血浆中最丰富的氨基酸，是核苷酸和氨基酸合成所必需的。虽然是一种非必需氨基酸，但包括胰腺癌、结肠癌、小细胞肺癌和白血病在内的多种人类癌症细胞系的增殖和生存高度依赖GLN(35). GLN耗竭可诱导癌细胞凋亡，其选择性高于葡萄糖耗竭(36). 此外，白血病细胞通过增加GLN的合成和转运来适应ASNase治疗，GS的抑制已被证明可以使耐药白血病细胞对ASNase重新敏感(37). 这些研究强调了以GLN代谢为靶点对抗ASNase耐药性的可能性。然而，由于毒性，旨在系统抑制GLN代谢的研究受到限制(38,39).

使用我们的在体外我们发现脂肪细胞主要通过分泌GLN来保护白血病细胞免受L-天冬酰胺酶和ASN/GLN饥饿。脂肪组织向间质液中分泌大量GLN(40)如前所述，白血病细胞浸润脂肪组织(6)脂肪组织可能是ALL细胞免受ASNase活性保护的避难所。这也可能发生在化疗开始后的骨髓中，此时脂肪细胞的数量及其GS的表达均显著增加。由于肥胖患者体内有大量脂肪，这可能会增加脂肪细胞介导的ASNase保护可能与临床相关的可能性，并且是导致肥胖ALL患者复发率增加的因素之一。

我们的结果补充了最近的发现，即骨髓间充质细胞（MSCs）通过分泌ASN保护白血病免受ASNase治疗(19–21). Laranjeira等人表明，白血病细胞分泌IGFBP-7可增加基质细胞合成ASN(21). 有趣的是，胰岛素和IGF-1的添加进一步增强了这种作用，这两种物质在肥胖中都会升高(41).

最近的两份出版物质疑骨髓间充质干细胞在ASNase治疗患者期间作为ASN来源的作用(42,43). 这些论文发现，在治疗后，骨髓和外周血中ASN和GLN的耗竭程度相似。有趣的是，这两项研究均显示骨髓中的天冬氨酸浓度高于外周血，这可能表明骨髓中天冬氨酸类物质的比例较高从头开始天冬氨酸的产生或ASN在微环境中的更大周转。应进一步调查已知的避难所可以在多大程度上抵消血液中ASN和GLN的消耗。特别是，毛细血管化不良的组织，如肥胖患者的脂肪组织，可能(44)，可以提供一个更远离ASNase治疗的环境。

几个小组一直在开发具有较低谷氨酰胺酶活性的替代ASNase制剂(45–47). 目标是最大限度地减少与GLN饥饿相关的副作用，如免疫抑制和胰腺炎。一项研究探讨了用丙氨酸谷氨酰胺补充ASNase治疗的大鼠的饮食以抵消GLN缺乏的免疫抑制作用的可能性(34). 在我们的研究中，9个商业细胞系中有8个和4个人类白血病细胞中有4个对GLN的敏感性高于ASN饥饿，并且在几乎所有情况下，两种氨基酸的缺失都比任何一种单独的氨基酸产生更强的影响。这些结果与Offman进行的研究一致(47)他表示，在他们的重组ASNase中，一些细胞系对野生型ASNase的反应优于谷氨酰胺酶活性降低的天冬酰胺酶。此外，我们在这里展示了Erwinase，一种具有较高谷氨酰胺酶活性的左旋天冬酰胺酶，通常用于对大肠杆菌左旋天冬酰胺酶能够削弱脂肪细胞保护白血病细胞的能力体外试验。这些发现表明，开发具有较低谷氨酰胺酶活性的替代性ASNase制剂的策略实际上可能有害于ASNase的细胞毒性，应谨慎进行。

我们的研究结果强调，使用ASNase制剂的新治疗方案不仅应注重抑制血浆ASN和GLN水平，还应注重药物对癌症微环境的有效性。脂肪组织可能在ASNase治疗期间对维持白血病细胞群起着关键作用。鉴于肥胖在全球范围内的患病率不断上升，旨在调节脂肪细胞对恶性细胞影响的药物策略可能在癌症治疗中变得重要。

补充材料

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致谢

作者感谢Markus M€uschen博士、Nora Heisterkamp博士和Yong-Mi Kim博士提供人类白血病细胞，感谢Paul Plourde博士慷慨提供Erwinase试验药物，感谢Rebecca Paszkiewicz博士在进行实验时提供的帮助。

赠款支持

这项工作得到了加布里埃尔天使基金会、NIH/NCI（CA139060）和NIH NCRR CTSI拨款1UL1RR031986的支持，并在洛杉矶儿童医院CTSI进行。

脚注

利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。

贡献：E.A.E.、J.W.B.和S.D.M.设计了实验；E.A.E、X.S.、J.W.B.和X.W.进行了实验；A.B.设计并执行临床实验；E.A.E.分析结果并制作数字；E.A.E.、V.I.A.和S.D.M.设计了总体研究；E.A.E.、A.B.、V.I.A.和S.D.M撰写了手稿。所有作者都批准了手稿和提交文件的最终版本。

工具书类

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