靶向酯酶诱导染料负载（TED）直接成像内质网钙

内质网钙的功能和信号转导

钙信号存在于不同的细胞类型中，例如肌细胞、神经元和神经胶质细胞及其功能从调节肌肉收缩到参与学习和记忆中的突触传递^1,2游离钙浓度的变化具有很高的科学价值，因为钙参与基因转录、细胞增殖、神经元兴奋性、细胞死亡和其他细胞信号事件的调节^1-7所有这些细胞钙信号在功能上相互关联，并有助于细胞内钙储存动力学^8-10.

所有钙信号中的一个共同特征是钙在细胞外间隙、胞浆和细胞器（主要是内质网和线粒体）之间的流动。这会导致这些细胞器内钙浓度的动态变化，这些变化由不同的信号成分感应。一般来说，内质网中的钙浓度在100至800μM之间，细胞溶质中的钙含量接近100 nM，细胞外空间中的浓度约为1-2 mM。因此，钙流向细胞溶质的化学驱动力很高^2,9,10.

最常见的ER-衍生钙信号依赖于G蛋白偶联受体（GpcR）的刺激，后者随后激活磷脂酶C（PLC）。PLC反过来产生肌醇1,4,5-三磷酸（IP_三)¹IP绑定后_三至其受体（IP_三-Rec中，图1)在内质网膜中，钙离子从内质网腔中释放出来。历史上，IP_三-Streb首次在腺泡胰腺细胞中间接测量了内质网介导的钙释放等。1983年¹¹该出版物首次提出了涉及乙酰胆碱、磷脂酶C和IP的信号级联_三这种钙释放方式通常称为IP_三-诱导钙释放(图1). 受体酪氨酸激酶对磷脂酶Cγ的激酶依赖性激活将生长因子和神经营养因子的作用与IP后ER钙信号传导联系起来_三高程¹²除IiCR外，钙升高可能由离子性钙进入介导，例如通过电压门控钙通道（Ca_五)以及随后由ryanodine受体（RyR）引起的钙诱导钙释放（CiCR）。IiCR和CiCR在生理上与存储操作钙输入（SOCE）有关。SOCE包括STIM（基质相互作用分子）的作用，STIM是ER钙释放的传感器。STIM已被证明通过瞬时受体电位通道（Trp）刺激细胞外钙进入¹³、Orai钙通道¹⁴甚至电压门控钙通道¹⁵(图1) . 内质网钙ATP酶（SERCA）的作用可以动态地修复内质网中钙的丢失，该酶可以主动地将钙泵入内质网。用thapsigargin等药物阻断SERCA，可以揭示内质网的钙持续丢失到细胞溶质室。这种内质网钙“渗漏”是由内质网膜内孔复合物如Sec61蛋白复合物引起的^16,17(图1).

1998年，Berridge发表了一个模型，即“神经元中的神经元模型”，它表明ER在整合神经元钙方面的主要生理作用⁵该模型考虑了连续内质网膜系统的存在，该系统形成了神经元质膜的细胞内“图像”⁵这种二元真核细胞膜系统被认为是神经元快速和缓慢钙信号时空整合的基本前提。伴随或随后发生在同一神经元不同棘或树突中的钙信号通过内质网传递给细胞体或细胞核，并在内质网中进行汇总^5,18那么，它们的总和可能会对神经元的兴奋性、基因转录的调节或信号级联的整合产生影响。因此，ER支持钙信号的整合。这一概念的一个先决条件是单个细胞内质网的连续性，这一点已被多项研究所证实，至少在体树突状区和短距离轴突投射方面得到了证实^19-21长轴突投射中是否存在内质网连续性尚存在争议。

测量ER膜上游离钙流量的策略

钙信号在胞浆中最常见^22,23因此，很难区分Ca²⁺从细胞外或细胞内储存流入胞浆^6,24为了克服这一局限性，已开发出直接ER钙显像的方法学策略。总之，使用了以下策略：(1)ER靶向基因工程蛋白诱导物^25-27.基于蛋白质的低亲和力Ca²⁺指示剂使用生物发光蛋白aequorin或GFP结合钙敏感蛋白。这些基因工程钙²⁺指示物（GECI）可以在信号肽的帮助下靶向内质网，并通过保留和检索基序在内质网中积极保持。普通ER Ca²⁺指示器基于卡梅隆原理，是卡梅隆YC4.3^26,28; Cameleon分体式YC7.3ER²⁹，和Cameleon D1³⁰. (2)AM-ester低亲和力的直接酯酶染料负载钙²⁺ 指标^31,32.指示染料的AM衍生物（Mag-Fura2-AM、Mag-Fluo4-AM或Fluo5N-AM）以亲脂、钙不敏感的状态通过生物膜。然后，在胞浆和内质网中，内源性酯酶裂解AM-ester基团并释放Ca²⁺指示剂，在胞浆和内质网中留下一定量的活性染料。因此，只要胞浆钙浓度远低于低亲和力指示剂的检测限，特别是在特征钙信号期间，这种方法在内质网钙浓度高的情况下是有用的(例如nM至低μM）。(三)AM-酯类负荷与质膜渗透相结合³².任何剩余的胞质钙²⁺使用少量“温和”清洁剂通过质膜渗透去除指示剂(例如皂苷）在人工细胞内缓冲液中。因此，细胞膜可能受到刺激，例如带IP_三在细胞内缓冲液中，直接通过质膜中的“孔”。(4)全细胞形态下细胞溶质的透析及钙的同时测定²⁺内质网腔和胞浆中 ^32,33.细胞首先装载低亲和力钙²⁺指示器(例如Mag-Fura2-AM，比例，紫外线）。然后，在贴片吸管的帮助下，任何剩余的细胞溶质低亲和力钙²⁺指示剂通过含有高亲和力钙的缓冲液从细胞溶质中透析出来²⁺指示器(例如Fluo-3，可见光）。这种策略可以同时记录细胞溶质和ER衍生信号。(5)靶向酯酶诱导的染料负载^8,34羧酸酯酶（CES）靶向内质网腔，并提供高酯酶活性，以有效捕获AM-酯类形式的低亲和力钙²⁺指标。

1.溶液的制备

以下溶液应在启动前准备好，并可按指示储存。我们通常使用消毒玻璃和塑料材料以及高压水。

1. 制备HEPES-指状物（单位：mM）：125 NaCl，3 KCl，25 HEPES，2 MgSO₄.7小时₂O、 2氯化钙₂，1.25 NaH₂人事军官₄.H型₂O、 10葡萄糖。H（H）₂O.无钙HEPES-指状物包括（单位：mM）：127 NaCl、3 KCl、25 HEPES、2 MgSO₄.7小时₂O、 1.25 NaH₂人事军官₄.H型₂O、 10葡萄糖。H（H）₂O和0.1EGTA。如果没有葡萄糖，这些成像溶液可以保存在4°C。在使用之前，新鲜添加所需量的D-葡萄糖。
2. 对于海马神经元的TED分析，建议使用人工脑脊液（ACSF）。ACSF由以下成分组成（单位：mM）：127 NaCl，23 NaHCO_三，3 KCl，2.5 NaHPO₄.H型₂O、 25 D-葡萄糖。H（H）₂O、 2氯化钙₂，2氯化镁₂.7小时₂ddH中的0₂0
3. 制备浓度为5 mM的Fluo5N-AM。为了有助于溶解，将8.9μl 20%Pluronic F-127（在DMSO中，室温下储存，防潮避光）添加到50μg冻干的FluoSN-AM中。然后通过水浴声波仪溶解Fluo5-AM至少2分钟。将0.5μl等分样品储存在-20°C下，避光防潮。
4. 根据需要准备拮抗剂和激动剂储备。例如：a）10 mM ATP或ADP（单位：H₂O、 嘌呤能受体的代谢激活），b）H中10 mM卡巴胆碱₂O（毒蕈碱型乙酰胆碱受体激动剂），c）DMSO中的30 mM环硫腙酸（CPA）（SERCA的阻断剂），d）PBS中的50 mM DHPG（mGluR代谢型谷氨酸受体激动剂_我和mGluR₅)，e）H中的10 mM谷氨酸₂O、 f）DMSO中的1 mM离子霉素（离子载体），DMSO（SERCA的高亲和力阻滞剂）中的5 mM thapsigargin。将等分样品储存在-20°C下。
5. 慢病毒载体：本协议包括慢病毒TED表达载体颗粒的使用。它们的生产和存储不属于本协议的一部分。我们使用第二代慢病毒载体将重组羧酸酯酶转移到细胞系、胶质细胞和神经元。我们的慢病毒系统基于表达载体FUGW³⁷、包装质粒pCMVΔR8.91或psPAX2和假分型质粒pMD2.G^38,39.注意：考虑到重组自激活慢病毒载体的工作需要仔细考虑生物安全指南。在许多国家，这些病媒被归类为生物危害风险类别2。有关更多信息，请参阅http://www.addgene.org/慢病毒/.

2.小鼠海马神经元的制备及病毒感染

1. 在直径为20 cm的玻璃皮氏培养皿中清洗玻璃盖玻片（每皿100个盖玻片），1x加入70%乙醇中约30分钟。最后，添加100%乙醇（每年）2分钟。去除残留乙醇，并在无菌罩下干燥盖玻片。
2. 制备两种不同的海马神经元培养基：（a）B27 1:50的神经基底培养基；（b） 全培养基：神经基础培养基，B27 1:50，谷氨酰胺1:100，N2补充1:100。无菌过滤培养基，并将其保存在细胞培养箱中，直至使用。
3. 在解剖前一天，首先在4孔细胞培养皿的每个孔中放置一个无菌的10mm盖玻片，以制备盖玻片。然后，在每张盖玻片上仔细涂上80-100μl 0.1%聚-l-赖氨酸，并将培养皿存放在培养箱中过夜。
4. 在解剖和细胞培养当天，首先用100μl HBSS清洗盖玻片三次，并将100μl神经基底培养基转移到每个盖玻片中。将盘子放入培养箱中进行平衡(例如在解剖小鼠时）。

解剖

我们按照欧盟的指导方针进行小鼠实验，该指导方针得到了我们机构动物护理和利用委员会的批准。

1. 取出整个大脑，双侧解剖海马。
2. 小心移除除海马体以外的所有脑膜和组织，并将每个海马体放在一个1.5 ml的含有450μl HBSS的试管中。将组织保存在冰上，直到分离出足够数量的海马。

细胞培养

1. 向每个试管中添加50μl 1%胰蛋白酶（沃辛顿），并在37°C水浴中培养15分钟。偶尔摇晃试管。为了停止消化反应，向每根试管中添加50μl 1%胰蛋白酶抑制剂，并翻转试管数次。
2. 将多达5个海马的所有组织转移到一个15毫升的猎鹰管中，避免转移液体。添加B27-培养基（a）至最终体积为5 ml。
3. 使用经过火抛光的巴斯德玻璃吸管，小心地上下吸液，将纸巾搅碎。注意：避免气泡！
4. 用400 x g旋转3分钟，吸取上清液并将细胞颗粒重新悬浮在5 ml B27-培养基（a）中。
5. 用玻璃吸管再次将组织Triturate，然后在1000μl塑料滤嘴的帮助下两次。按照步骤2.9和2.10中的说明执行此操作。
6. 最后一次离心后，将细胞颗粒重新悬浮在2 ml全培养基（b）中，并用200μl塑料滤嘴研磨细胞。为了将剩余的细胞团从单细胞悬浮液中分离出来，让细胞团静置1-2分钟。
7. 计数细胞并计算病毒感染所需的细胞总数。对于TED成像，每10 mm盖玻片使用25000个细胞。
8. 此时建议额外镀25000个非转导细胞作为对照。

病毒感染

1. 将病毒感染的细胞悬液转移到一个新鲜的15毫升猎鹰试管中，在400 x g的条件下离心3分钟。
2. 吸取上清液并将细胞重新悬浮在300μl培养基中（b）
3. 添加适量感染性慢病毒TED表达载体颗粒，将猎鹰管在室温下放置10分钟。
4. 将试管装满培养基（b）至电镀所需的最终体积（每10 mm盖玻片100μl），从盖玻片中吸取培养基，并立即将100μl细胞悬浮液置于每个盖玻片上。
5. 将培养皿放入培养箱中，直到所有细胞都沉淀下来（约2小时），然后小心地将培养皿装满，直到它们含有2毫升培养基（b）。
6. 让神经元至少生长一周。每周更换50%的介质。

3.小鼠皮层神经胶质细胞的培养和病毒感染

准备

1. 首先制备基础胶质细胞培养基（DMEM/F12与10%FCS、5%HS、1%青霉素/链霉素、0.45%葡萄糖的1:1混合物），并用4 ml 0.5 ng/ml聚-DL-鸟氨酸氢溴酸盐（PORN）（在150 mM硼酸溶液中稀释，pH 8.35）覆盖T75细胞培养瓶。在37°C下培养2小时或过夜后，用HBSS清洗细胞培养瓶三次，并添加含有B27 1:50和10 ng/ml EGF的18 ml基底胶质细胞培养基。在培养箱中平衡细胞培养瓶（最多3小时）。

解剖

1. 我们按照欧盟的指导方针进行小鼠实验，该指导方针得到了我们机构动物护理和利用委员会的批准。
2. 如2.5所述，解剖一只P5-P7小鼠的大脑，并从两侧大脑半球移除海马和脑膜。
3. 解剖额叶皮层，将其切成几小块，并将其收集在含有HBSS的1.5毫升试管中。将试管储存在冰上，然后进入细胞培养部分。

细胞培养

1. 使用火焰抛光玻璃吸管将试管中的所有组织转移到15毫升猎鹰试管中。
2. 添加基本培养基至最终体积为5 ml，用火焰抛光玻璃吸管上下吸管数次，研磨组织。在300 x g离心3分钟后，抽吸培养基，并在5 ml基础培养基中重新悬浮细胞颗粒。
3. 重复步骤3.5两次。
4. 第三次离心后，将细胞颗粒重新悬浮在含有B27（1:50）和10 ng/ml EGF的2 ml基底胶质培养基中。
5. 再次滴定，将细胞悬液转移到准备好的T75细胞培养瓶中，让细胞生长3-4天。

清洗胶质细胞（培养3-4天后）：

1. 用10毫升PBS清洗细胞一次，用手用力轻敲或轻轻敲打烧瓶几次，同时用另一只手紧紧握住烧瓶。通过这一步骤，细胞碎片和细胞簇从培养物中清除。
2. 吸入PBS，并添加含有B27（1:50）和10 ng/ml EGF的新鲜基底胶质培养基。继续培养5-7天，直到细胞达到80%的融合。

胶质细胞的分裂、转导和最终播种：

1. 在10 mm盖玻片上涂上100μl聚-D-赖氨酸（储备溶液：0.1%，在PBS或HBSS中稀释1/50和20μg/ml），并在培养箱中培养一夜。用HBSS清洗盖玻片三次，并添加100μl基底胶质培养基。平衡培养箱中的盖玻片（3小时）。
2. 用10 ml PBS清洗胶质细胞两次，抽吸PBS，并添加3 ml胰蛋白酶（未稀释的胰蛋白酶）。胰蛋白酶化细胞长达1分钟。注意：避免过度胰蛋白酶化。正常情况下，超过80%的细胞在1分钟后脱落，这足以产生数百万个健康细胞。
3. 通过添加10 ml基础胶质培养基停止反应，将细胞悬液转移到15 ml猎鹰管中，以300 x g离心3分钟。吸取上清液，并将细胞颗粒重新悬浮在5 ml基础胶质介质中。
4. 再次按照步骤3.15所述进行旋转和抽吸，然后将细胞重新悬浮在5 ml基底胶质细胞培养基中。
5. 将所需数量的细胞转移到1.5 ml试管中。10⁴-2x10个⁴胶质细胞足够一张10毫米的盖玻片。通常，一个4孔培养皿用于传感器细胞的悬浮液体积小于200μl。向细胞中添加适量慢病毒TED表达载体颗粒，并在室温下培养10分钟。然后用基本胶质细胞培养基填充悬浮液至播种体积（每张盖玻片100μl）。
6. 每个盖玻片种100μl受感染细胞并孵育约2小时，然后添加含有B27 1:50和10 ng/ml EGF的基底胶质培养基至最终体积为2 ml。
7. 为了获得理想的培养条件，在电镀后第3-7天使用细胞进行实验。

4.报告细胞系的产生和培养

在HeLa、BHK21、Hek293和SH-SY5Y的基础上建立了TED报告细胞系。这里我们提供了HeLa细胞的协议，但该协议也可以传输到任何其他细胞系。

稳定HeLa细胞系的建立

1. 分离野生型HeLa细胞系，将体积为200μl的100000个细胞转移到1.5 ml试管中。
2. 向试管中添加适量慢病毒TED表达载体颗粒，并在室温下培养细胞-病毒悬浮液10分钟。然后将细胞接种在总体积为2 ml的培养基（DMEM、10%FCS、1%青霉素/链霉素）中的30 mm培养皿中，并培养3天。
3. 用PBS洗涤一次后，抽吸培养基并添加500μl胰蛋白酶（TrypLE，PBS中2:3）。培养约3分钟，然后通过添加3 ml培养基停止反应。将悬浮液转移到15 ml falcon试管中，并以400 x g离心3分钟。
4. 在200μl培养基中重新悬浮细胞颗粒，并再次用慢病毒颗粒感染细胞，如4.2所述。然后，将种子细胞置于10 ml培养基中的T25细胞培养瓶中。
5. 培养细胞，直至达到60-80%的汇合点。然后分裂文化。

TED报告细胞系

1. TED报告细胞系可以保存在任何标准介质中，例如使用含有5%或10%FCS和1%青霉素/链霉素的DMEM。
2. 在含有无菌10 mm盖玻片（见上文）的4孔培养皿中培养适当数量的细胞，例如每个盖玻片10000到20000个电池。
3. 在将细胞用于TED成像之前，请将其培养至少两天。

5.倒置显微镜实时成像程序的准备

1. 1. 将HEPES-手指预热至室温并添加D-葡萄糖。
   2. 预热ACSF（不含Ca²⁺和镁²⁺⁾至室温并添加D-葡萄糖。给ACSF通入碳水化合物5分钟。然后添加1 M CaCl储备溶液₂和氯化镁₂最终浓度为2 mM。
2. 启动实时成像显微镜和所有计算机程序。
3. 在“虚拟”成像室上开始灌注，并平衡管道系统。
4. 预热显微镜载物台中的内联溶液加热器和成像室。将成像室固定在加热插件中。
5. 在开始染料加载程序之前，将系统平衡至32-37°C。注意：为了避免灌注溶液意外流入显微镜系统，我们在物镜周围使用发带和弹性硅胶板（1mm）来保护显微镜载物台。

6.任何一种电池类型的染料负载

1. 将1等分Fluo5N-AM（见1.3）重新悬浮在100μl预热成像溶液（HEPES-指状物或ACSF）中。
2. 将Fluo5N-AM溶解在水浴式声波发生器中的成像溶液（HEPES-指环或ACSF）中90秒。
3. 使用新鲜的4孔或24孔板，将400μl预热的成像溶液转移到一个孔中。将染料溶液加入同一个孔中，得到500μl的5μM溶液。
4. 小心地放置一张带有电池的盖玻片(例如直径10-18 mm），电池面朝上。
5. 在37°C的细胞培养箱中培养一段合适的时间（同时在显微镜台上准备成像设置）。神经元和胶质细胞的典型染色时间为7-15分钟，细胞系为10-20分钟。

关键的：染料装载时间和染料浓度取决于细胞类型、细胞密度和实验特定需求！染料存在下的长时间孵育可能会伤害细胞，尤其是原代神经元和原代神经胶质细胞，这对生理刺激的反应性至关重要。潜伏期长(例如30分钟）将仅用于ER钙定位实验，以研究ER钙在小亚细胞结构中的分布，例如细神经突或棘。在一些实验中，1/3生长介质与成像溶液的混合物可能有助于在Fluo5N-AM加载期间保护细胞。

1. 立即将盖玻片转移到另一个含有成像溶液的细胞培养皿中（HEPES-手指或ACSF），并开始将细胞安装到成像室中。

7.利用倒置激光扫描共焦显微镜进行ER-calcium活细胞成像

1. 使用油漆刷在成像室上涂抹高真空润滑脂。将盖玻片固定在灌注室底部需要润滑脂。我们使用自制成像室制作10-12毫米的盖玻片，体积较小，因此可以实现高达每分钟15倍缓冲液交换的高灌注速度。可从华纳仪器公司（RC-49FS）购买用于放置18 mm盖玻片的商用灌注室。这个腔室还可以对神经元进行场刺激。
2. 拿起装有Fluo5N的细胞的盖玻片，在细胞上滴上一小滴成像溶液（50-100μl），使细胞覆盖成像溶液。将盖玻片倒置，将试管装入成像室。要将盖玻片压入硅胶中，请使用棉签(例如Q-提示）。
3. 用棉球擦去玻璃盖玻片底部残留的缓冲液。注意：使用具有高数值孔径的油物镜进行高分辨率成像时，请小心擦掉残留水分。残留的盐最好用水去除。可使用丙酮或纯乙醇清除润滑脂的意外涂抹。
4. 将“虚拟”成像室与实验成像室互换。通过连续灌注清洗细胞5-10分钟。
5. 通过连续灌注清洗细胞5-10分钟。
6. 对于细胞选择，使用最少的激光照明、高扫描速率（2-4 Hz）、较小的图像尺寸和高增益。
7. 注意：在选择Fluo5N标记的细胞时，不要使用过多的光或外荧光灯直接照射。Fluo5N/Ca的明亮照明²⁺配合物会在2-4秒内完全失去ER特异荧光(图5).
8. 根据计划的实验设置显微镜。对于定向，不同TED矢量成像的代表性设置如所示表1对于反向激光扫描共聚焦显微镜，我们使用奥林巴斯IX81显微镜和配备二极管激光器（473 nm，15 mW；559 nm，20 mW）的Fluoview 1000共聚焦系统以及光谱检测器系统。
9. 在实验开始时，通过高分辨率x，y-z图像堆栈记录感兴趣的细胞。
10. 在特定的实验条件下进行x，y-t成像以监测ER钙动力学。我们系统的典型设置列于表2.
11. 用显像液连续灌注监测ER钙的变化。典型的缓冲液交换率示例如下：（a）通过SERCA块进行细胞清洗和储存完成：1.5 ml/min；（b） ATP/DHPG刺激：3 ml/min。
12. 优先获取12位（4096灰度值）的数字图像。用于Fluo5N/Ca的并行成像²⁺和RFP，8位图像（256个灰度值）可能会将您的系统从数据溢出中拯救出来。
13. 存储活细胞时间序列图像（x，y-t）或3D图像堆栈（x，y-z）（用于Fluo5N/Ca的细胞分布²⁺Complex）兼容ImageJ格式(例如tiff）。

TED的单元类型

该方法的可行性已在BHK21、HEK293细胞系中证明³⁴、希拉¹⁷，SH-SY5Y，培养的星形胶质细胞^8,40初级海马和皮层神经元^8、34、41在我们的实验中，当TED构建体稳定表达时，TED工作良好，优先通过自失活慢病毒载体^37,39使用相对较弱的启动子(例如泛素启动子）³⁵其他实力更强的推广人正在接受调查。

TED标签的ER特异性

用Fluo5N成功加载TED，可使ER管腔清晰明亮地染色，而ER管腔不在核区内^34,41在休息状态下，Fluo5N/Ca²⁺复合标记代表钙在与Fluo5N结合时的定位，因此，它代表了ER管腔中游离钙的区域分布。在图6，Fluo5N/Ca的共焦图像²⁺-在HeLa细胞、皮质星形胶质细胞和海马神经元中显示Red-CES2的复合物和Tag-RFP-T2标记。图6C显示荧光钙²⁺海马神经元胞体和轴突中的指示复合物。这样可以检测钙²⁺较小进程中的信号（另请参阅^34,35).

需要一些经验来区分典型的ER标记和细胞溶质标记，当细胞受损或不健康时会观察到这种标记。细胞质内生酯酶也会释放Fluo5N，当钙通过质膜渗漏时，这会导致细胞质和细胞核染色非常明亮。Fluo5N/Ca的细胞溶胶染色²⁺当TED标记的细胞在细胞外钙的存在下用离子载体离子霉素处理时也能观察到(图7).

1.TED向量构造

图3总结了TED向量结构的发展。TED是在CES家族蛋白的基础上开发的（酶代码EC3.1.1.1）。这些蛋白质是内质网腔中的常驻成员。对于在体外研究表明，CES蛋白的重组给药在稳定表达该蛋白或以中等表达水平感染病毒后效果最佳。目前，尚不清楚其他具有酯酶活性的蛋白质能否取代CES蛋白质用于TED成像。不建议使用TED载体的瞬时转染进行动态ER钙分析，因为转染后细胞的反应性较差。CES蛋白需要正确靶向内质网腔，而这一步需要有效切割内质网信号肽。此外，CES蛋白在内质网腔中的保留和恢复由其氨基末端KDEL样基序介导。当瞬时转染后TED载体产生高表达水平时，这些机制可能会饱和。这可能导致CES蛋白的错误定位，并支持蛋白质聚集体的形成。

2.低亲和力钙²⁺TED指标

TED最重要的缺点是可用指示染料对ER钙进行无破坏性分析的局限性。TED的ER钙成像需要高K的指示染料_D类（意思是亲和力低）和缺乏钙时荧光低。根据我们的经验，Fluo5N-AM效果最好，但这种指示剂染料不耐漂白。低亲和力钙²⁺指示器Mag-Fura2-AM（K_D类~25-50μM）³⁴和Mag-Fluo4（K_D类约20-25μM）。TED将这两种染料很好地装入内质网结构中，但在刺激内质网释放时产生“混合信号”的风险很高。“混合信号”首先表示胞浆中荧光的快速增加，然后是ER中荧光的减少。为了克服这一限制，ER钙成像的破坏性方法可能有助于^32,35.磁流体4（K_D类约20-25μM）显示了高尔基体池强烈的TED介导标记，当使用Fluo5N-AM时，这种标记不太明显。

这项工作得到了德国Forschungsgemeinschaft（DFG）BL567/3-1和Friedrich-Baur-Stiftung的资助。我们要感谢加州大学圣地亚哥分校霍华德·休斯医学研究所实验室的Roger Y.Tsien为我们提供Tag-RFP-T2。我们感谢帕萨迪纳加州理工学院的David Baltimore和日内瓦大学的Didier Trono为我们提供慢病毒质粒FUGW和psPAX2/pMD2.G。