EGFR突变诱导的Max选择性剪接对脑癌糖酵解肿瘤生长的影响

EGFRvIII下游HnRNPA1剪接因子调节糖酵解基因表达

编码糖酵解酶的转录物的选择性剪接，包括丙酮酸激酶亚型PKM2(Christof k等人，2008年a;Christof k等人，2008b)至少部分由异质核核糖核蛋白（hnRNP）A1和A2以及聚嘧啶束结合蛋白（PTB）介导（David等人，2009；Clower等人，2010年;Sun等人，2011年). 表达EGFRvIII的异种移植物中HnRNPA1表达增加，而在hnRNPA2或PTB亚型4中没有检测到一致的差异，尽管PTB亚形1表达有微小变化(图2A). 因此，我们重点研究了hnRNPA1在介导EGFRvIII剪接相关糖酵解变化中的潜在作用。

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图2

EGFRvIII调节Myc和hnRNPA1剪接因子的表达，促进糖酵解、增殖和缩短患者生存期

（A） 来自三种U87异种移植物肿瘤裂解物和三种U87EGFRvIII异种移植物肿瘤裂解物的Myc和下游剪接因子的免疫印迹分析。HnRNPA1和Myc印迹（黑色箭头）下方的数值是归一化为微管蛋白的条带的密度定量。

（B） （左）使用多西环素调节EGFRvIII表达的U373裂解物的免疫印迹分析，以及（右）EGFRvII急性缺失时GLUT1、GLUT3、HK2和PDK1的相对mRNA转录水平（n=4；显示为平均值±SD；*p<0.05）。

（C） 低EGFR表达或EGFR扩增和EGFRvIII表达患者GBM活检样本的免疫印迹分析。

（D） 131例原发性GBM患者的Kaplan-Meier总体生存图，按hnRNPA1表达的生存图分层。单个p值基于两条曲线的差异，并使用对数秩检验进行计算。

（E） hnRNPA1敲低的U87 EGFRvIII细胞的细胞增殖（n=3；显示为平均值±SD；**p<0.01）。

（F） 在转染有指示siRNA的U87-EGFRvIII细胞中，1小时后摄取荧光素结合葡萄糖（2NBDG）。未染色的是没有2NBADG的细胞。

（G） 对含有hnRNPA1敲除的U87-EGFRvIII细胞糖酵解基因表达进行RT-qPCR分析（n=3；显示为平均值±SD；*p<0.05）。

为了检测EGFRvIII对急性期hnRNPA1表达的影响，我们分析了在强力霉素调节启动子（tet-off）下表达EGFRvII的U373 GBM细胞(Mukasa等人，2010年). Myc和hnRNPA1水平与EGFRvIII密切相关(图2A和2B). 急性环境中EGFRvIII的诱导缺失导致hnRNPA1减少，糖酵解基因GLUT1、GLUT3、HK2和PDK1的表达降低(图2B). 重要的是，在GBM患者获得的肿瘤裂解物中，hnRNPA1表达水平与EGFRvIII表达水平相关(图2C). 为了评估这些发现的临床相关性，我们确定了hnRNPA1表达与GBM患者生存期之间的相关性。加州大学洛杉矶分校脑肿瘤基因表达数据库中131例原发性GBM患者的分层(http://www.probesetanalyzer.com/)通过hnRNPA1基因表达水平，揭示了hnRNPAl表达升高与总生存期短之间的高度显著相关性（p=0.0028）(图2D). 综上所述，这些结果将EGFRvIII的剪接因子hnRNPA1置于GBM的下游，并证明hnRNPAl的高水平表达与脑癌患者的侵袭性肿瘤相关。

药物抑制EGFRvIII下游的mTOR，或联合抑制EGFRv III和MAPK通路，抑制胶质瘤细胞中hnRNPA1的表达(图S2A-S2C). 通过单独或联合敲除猛禽和蓖麻的siRNA对mTOR复合物1和mTOR复合体2的遗传抑制，进一步证实了mTOR依赖于hnRNPA1的诱导，这与以前的发现一致(Sun等人，2011年) (图S2B). 然后我们研究了hnRNPA1对细胞增殖、葡萄糖摄取和糖酵解基因表达的功能影响。两种独立的hnRNPA1敲除结构显著抑制细胞增殖(图2E). 令人惊讶的是，hnRNPA1的缺失抑制了葡萄糖摄取(图2F)伴随着糖酵解基因GLUT1、GLUT3、HK2和PDK1的表达降低(图2G).

HnRNPA1促进转录编码Myc-binding伴侣Max的剪接

然后，我们寻找与EGFRvIII发病机制相关的潜在hnRNPA1依赖性交替剪接转录物。生物信息学分析在外显子上游或下游200bp范围内鉴定出40个具有最佳hnRNPA1结合位点（UAGGGA/U）的差异剪接外显子。在最热门的研究中，我们发现了Myc相互作用蛋白Max的一种选择性剪接形式，这是一种调节Myc功能的专性异二聚体c-Myc结合伙伴(Blackwood等人，1991年;Hurlin等人，2006年). Max第5外显子上游的内含子区域包含一个高度保守的潜在hnRNPA1结合位点，表明其具有进化意义(图S3A). 外显子5的内含物产生一个截短的Max蛋白，称为Delta Max(Makela等人，1992年;Vastrik等人，1993年;Hirvonen等人，1994年) (图S3B和S3C). 虽然Delta Max先前被证明能增强Myc和Ras依赖性转化，但其在人类癌症中的作用尚未确定(Makela等人，1992年). 为了获得hnRNPA1与Max第5外显子上游内含子区域之间物理联系的直接证据，我们进行了交联和免疫沉淀（CLIP）分析。含有潜在hnRNPA1结合位点的内含子区与hnRNPA1进行免疫沉淀(图3A). 在患者衍生的GBM神经球中，外显子5的内含程度与hnRNPA1的表达水平紧密相关(图3B). 然后，我们确定hnRNPA1是否可以介导Max的选择性剪接以产生Delta Max转录物和蛋白质。HnRNPA1敲除显著降低GBM细胞中Delta Max mRNA和蛋白的表达(图3C和3D). 我们证实了一组GBM肿瘤裂解物中Delta Max的表达与EGFRvIII相关(图3E). 综上所述，这些结果表明EGFRvIII通过hnRNPA1促进Delta Max剪接。

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图3

Myc-异构化伙伴Max的HnRNPA1-dependent剪接导致截断变量Delta Max

（A） 使用从U87-EGFRvIII细胞经紫外线交联（CLIP）后免疫沉淀的hnRNPA1中提取的RNA，对第5外显子上游的Max内含子进行RT-PCR，如补充实验程序.

（B） 患者GBM活检建立的神经球中Max外显子5的RT-PCR剪接分析和hnRNPA1的免疫印迹分析。

（C） hnRNPA1基因敲除细胞中Max外显子5的RT-PCR剪接分析图2E.

（D） 转染siRNAs至hnRNPA1的U87-EGFRvIII细胞裂解物的最大免疫印迹。

（E） 患者最大GBM活检免疫印迹图2C.

Delta Max促进糖酵解基因表达并促进EGFRvIII介导的GBM肿瘤生长

Delta Max预计将通过Myc调节其影响(Makela等人，1992年)它通过增加葡萄糖的吸收和代谢，至少部分地调节癌细胞的生长和增殖(党，2012;党，2011). 因此，我们试图确定Delta Max是否能促进GBM细胞增殖；是否需要葡萄糖；无论是Myc-依赖性，还是对这种选择性剪接形式的Max具有特异性。Delta Max过度表达，而非野生型Max，增加了GBM细胞在含糖培养基中的增殖，但不增加半乳糖培养基的增殖，这表明对增殖的影响是葡萄糖依赖性的，并且对Max的选择性剪接形式具有特异性(图4A). 同时，Delta Max（而非野生型Max）增加了U87胶质瘤细胞中葡萄糖转运蛋白GLUT3和HK2的表达，这被Myc敲除而消除(图S4A和S4B). 综上所述，这些结果表明Delta Max以Myc依赖的方式促进糖酵解基因表达。

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图4

Delta Max在体内外促进糖酵解基因表达和肿瘤生长

（A） 用空载体（EV）、野生型（WT）Max或Delta Max（n=4；所示为平均值±SD；***p<0.001）转染后，U87细胞在含葡萄糖或半乳糖的培养基上增殖。

（B） EGFRvIII急性缺失时GLUT1、GLUT3、HK2和PDK1的相对mRNA转录水平，伴有或不伴有Delta Max或野生型（WT）Max过表达（n=3；显示为平均值±SD；*p<0.05；n.S.不显著）。

（C） 通过肿瘤体积测量，稳定敲除Delta Max的U87-EGFRvIII细胞的异种移植瘤生长速度较慢于对照（Sh Scrambled）细胞（n=4；所示为平均值±SD；**p<0.01）。

（D） RT-qPCR分析Delta Max击倒U87-EGFRvIII细胞中糖酵解基因的表达（n=3；所示为平均值±SD；*p<0.05）。

（E） 图示了mTOR的EGFRvIII激活上调Myc，Myc刺激hnRNPA1表达，并促进生成Max的Delta Max的剪接，从而增强Myc活性并增加有氧糖酵解。

为了确定EGFRvIII是否通过Delta Max对糖酵解代谢的依赖性效应介导GBM细胞增殖，我们检测了Delta Max对于U373 GBM细胞糖酵化基因表达的影响，其中EGFRvII受强力霉素调节启动子（tet-off）控制(Mukasa等人，2010年). EGFRvIII的沉默抑制了糖酵解基因GLUT1、GLUT3、HK2和PDK1的表达，这与其对促进糖酵解代谢的已知作用一致(郭等人，2009). 重要的是，Delta Max而非野生型Max的过表达在EGFRvIII信号缺失的情况下维持了糖酵解基因的表达(图4B). 这些结果表明EGFRvIII通过Delta Max调节GBM细胞糖酵解的上位关系。野生型Max无法挽救糖酵化基因的表达(图4B)并在含糖培养基中促进GBM生长(图4A)，证明Max到Delta Max的选择性剪接是促进葡萄糖依赖性GBM细胞增殖所必需的。

为了确定表达EGFRvIII的GBM的生长是否需要Delta Max，我们检测了Delta Max缺失对体内肿瘤生长的影响。与对照组相比，Delta Max基因缺失导致肿瘤大小减少近五倍，p<0.01(图4C). 与Delta Max对糖酵解基因表达的证明效果一致(图4B)，siRNA介导的Delta Max缺失特异性抑制GLUT1、GLUT3、HK2和PDK1基因表达(图S4C)以及减少葡萄糖消耗和乳酸生成，有氧糖酵解的两个读数(图4D和S4D系列). 抗si-Delta Max结构的过度表达完全挽救了敲除的效果，证实了靶向Delta Max的siRNA的特异性(图S4D).

Myc以前被证明能转录上调hnRNPA1水平(David等人，2010年)，增加了“前馈”循环的可能性。事实上，Delta Max的过度表达增加了hnRNPA1转录水平，这被Myc siRNA敲除所抵消(图S4E). 综上所述，这些结果表明EGFRvIII通过mTOR依赖的Myc上调和Delta Max剪接反馈，通过Myc依赖的转录调控进一步提高hnRNAP1(图4E).

异种移植瘤研究

将等基因人胶质瘤细胞U87和U87-EGFRvIII皮下植入免疫缺陷SCID/米色小鼠。SCID/米色小鼠在加州大学洛杉矶分校实验放射肿瘤学部AALAC批准的动物设施中繁殖并保持在规定的无病原体条件下。U87和U87-EGFRvIII细胞系在1×10时再次悬浮⁶用Matrigel（BD）将PBS中的细胞/ml植入小鼠腹部的对侧皮下。为了进行MicroPET/CT成像，将U87和U87-EGFRvIII细胞皮下移植到不同小鼠的腹部。如前所述进行MicroPET/CT扫描和分析(郭等人，2009).

微阵列和生存数据分析

人类研究连接阵列（Affymetrix）用于识别来自NOD/SCID/gama（NSG）小鼠的U87和U87-EGFRvIII异种移植瘤之间的差异表达和剪接转录物。用Trizol（Invitrogen）从异种移植瘤中分离出RNA。对于微阵列分析，使用WT表达试剂盒（Ambion）和WT终端标记试剂盒（Affymetrix）处理和扩增RNA。人类研究连接阵列取自Affymetrix，并在加州大学洛杉矶分校DNA微阵列设施中对标记样本进行杂交和扫描。用MADS+软件分析基因表达和选择性剪接(沈等，2010). 使用基因集富集分析（GSEA）软件生成热图(Mootha等人，2003年;Subramanian等人，2005年). 完整的微阵列配置文件可在GSE#####的GEO获得。

临床样本中的生存数据和基因相关性数据：这些微阵列数据来自TCGA，并从癌症细胞出版物下载：“综合基因组分析确定以PDGFRA、IDH1、EGFR和NF1异常为特征的胶质母细胞瘤临床相关亚型”。https://tcga-data.nci.nih.gov/docs/publications/gbm_exp/unifiedScaled.txt加州大学洛杉矶分校数据的生存曲线可通过以下网站公开获取：http://probesetanalyzer.com/

备选剪接分析

使用半定量反转录酶PCR检测选择性剪接。引物被设计成构成外显子侧翼的替代外显子。引物为：MAX_（85）_F 5′-tcagtccactcagg-3′；最大_（85）_R 5′-gcacttgacctctct-3′。反向引物为³²P末端标记和22个循环的PCR反应通过变性PAGE进行解析。使用台风磷光成像仪（GE）检测放射性信号，并使用ImageQuant TL软件（Amersham Biosciences）进行量化。

实时定量PCR

根据制造商的说明，使用Trizol（Invitrogen）提取总RNA，然后进行DNA酶处理（Ambion）和蛋白酶K处理（Roche）。为了合成cDNA，500ng RNA与SuperScript VILO cDNA合成试剂盒（Invitrogen）一起使用，1ul RNA与iQ SYBR Green Supermix（Bio-Rad）一起用于定量实时PCR。通过IDT合成引物，并设计引物（使用引物3）来扩增约200bp的靶3′UTR区域。引物序列见补充信息使用Bio-Rad-iCycler-iQ实时PCR检测系统进行RT-PCR，一式三份。使用iCycler iQ光学系统软件（3.0a版）进行分析，并将数据标准化为vinculin内部控制。

葡萄糖摄取测定

细胞在含有0.5%FBS（不含抗生素）的DMEM中的6孔板中生长24小时，用含有10%FBS（无抗生素）和100uM 2-NBDG（Invitrogen）的DMEM替换培养基。细胞在37°C 5%CO下培养1小时₂培养箱，用PBS清洗3次，然后用胰蛋白酶提起，清洗后使用FACSCalibur分析仪（BD）进行流式细胞术分析。

细胞增殖分析

用siRNA转染细胞，24小时后将其接种在含有0.5%FBS的DMEM 96孔板中。72小时后使用细胞增殖检测试剂盒（Millipore）测定相对生长率。细胞在37°C 5%CO下培养30分钟₂在培养箱中加入四氮唑盐WST-1（Millipore），并使用微孔板阅读器（Bio-Rad）在420至480 nm处测量吸光度。为了确定细胞数量，将siRNA转染到6孔板中的细胞，24小时后清洗细胞，并用添加0.5%FBS的DMEM替换。48小时和72小时后，用血细胞仪对细胞进行计数。为了在含有葡萄糖和半乳糖的培养基上进行增殖，细胞被放置在96个平板中，在2.5×10^三细胞/孔置于100μl生长培养基中，并在每个处理条件下培养。如前所述，在测量葡萄糖依赖性增殖时，使用含有葡萄糖（Cellgro）或添加4.5 g/l半乳糖（Sigma）的非葡萄糖DMEM（Gibco）(Finley等人，2011年). 根据制造商的说明，用细胞增殖测定试剂盒（Millpore）检测细胞增殖。用微孔板阅读器（Bio-Rad）在420至480nm处测量处理和未处理细胞的吸光度。数据表示四个独立实验的平均值±SD。

抗体、细胞裂解物制备和免疫印迹

特定抗体从以下商业来源购买：抗Max抗体是来自Abcam（ab68578）的兔多克隆抗体。抗-HnRNPA1是来自Sigma（克隆号9H10）的小鼠单克隆抗体。抗EGFRr/EGFRvIII鸡尾酒抗体来自Upstate。抗-Actin来自Novus Biologicals（AC-15）。抗Tubin是来自Sigma的小鼠单克隆抗体（T4026）。抗-Myc（D84C12）、抗-HnRNPA2（2A2）、反磷酸EGFR（Y1068）、抗HA（6E2）、抗磷酸Akt（S473）、抗Akt、抗rS6、抗磷酸-rS6（S235/S236）、抗利肌和抗猛禽均来自Cell Signaling。抗PTB由D.L.Black提供。对于细胞裂解液的制备，用PBS清洗细胞，并用RIPA裂解缓冲液（50mM Tris-HCL pH 7.4，150mM NaCl，0.5%脱氧胆酸盐，1%Nonide P-40和0.1%SDS）（Boston BioProducts）进行裂解，该缓冲液含有半蛋白酶抑制剂混合物（Thermo Scientific）和半磷酸酶抑制剂混合物（Sermo Screefic）。使用Bradford试剂盒（Bio-Rad）测定裂解物的蛋白质浓度。蛋白质电泳使用12%NuPAGE Bis-Tris预铸迷你凝胶（Invitrogen）和MES运行缓冲液（Invit罗gen），免疫印迹根据抗体供应商的说明进行，Western blot检测使用SuperSignal West Pico化学发光底物（Thermo Scientific）。为了检测Myc和Max SuperSignal，使用了West Femto化学发光基板（Thermo Scientific）。图像J分析软件（NIH）用于imunoblots的密度定量。

患者GBM活检样本和神经球培养

患者GBM样本是在加州大学洛杉矶分校手术切除后采集的。经患者同意，由加州大学洛杉矶分校脑肿瘤转化资源（BTTR）提供GBM样本。如前所述，分离并培养神经球（Nakano和Kornblum，2009）。

RNAi实验和抑制剂研究

根据制造商的说明，使用Lipofectamine RNAiMAX（Invitrogen）转染siRNA。针对Delta Max第5外显子的siRNA（目标序列：CAUGGAGAUGCAAGUAAA）购自Sigma。靶向hnRNPA1的siRNAs（靶序列（A）：GAAUGGUUAAAAGUGAU；靶序列（B）：GGUUCUAUUUGGAAUUAU）购自Ambion（Applied Biosystems）。靶向Max的siRNA（靶序列：CAAAGACAGCUUUCACAGU）购自Ambion（Applied Biosystems）。对照siRNA（沉默剂选择阴性对照#2）购自Ambion（Applied Biosystems）。靶向Rictor（目录号L-016984-00-0005）和Raptor（目录号L-004107-00-00005）的siRNA位于TARGETplus SMARTpool siRNAs（Thermo Scientific，Dharmacon Division）上。

慢病毒产生和异种移植瘤测量

将靶向Delta Max第5外显子的Si RNA序列克隆到pLKO.1-puro载体（Sigma）中。一个加扰的shRNA（Sigma MISSION shRNA非哺乳动物对照（SHC002））被用作对照。慢病毒是使用三质粒包装系统制成的。简而言之，pLKO.1-puro载体中的shRNAs与含有vsvg公司,堵塞/堵塞、和转速基因。转染后48h，收获慢病毒，加入8ug/ml聚brene。用收获的病毒感染亚流入的U87-EGFRvIII细胞，并在0.7 ug/ml的嘌呤霉素中筛选1周。然后使用稳定的细胞系进行上述异种移植瘤生长研究。当肿瘤可接受时，在1周内进行外部卡尺测量。对于肿瘤体积，确定最大纵向直径（长度）和最大横向直径（宽度），并根据椭球体公式计算肿瘤体积（肿瘤体积=½（长度x宽度²).

我们感谢George Thomas博士和Dan Geschwind博士对手稿的仔细阅读和有益的评论。这项工作得到了以下机构的支持：美国国立卫生研究院（NIH）拨款CA119347和NS73831（P.S.M.）、本和凯瑟琳·艾薇基金会（P.S.M、W.H.Y.和T.F.C，纪念Sigi Ziering（T.F.C.和P.S.M.）的Ziering家庭基金会、Henry Singleton脑癌基金会（W.H.Y.和T.F.C.）、NIH拨款R01 GM084317（Manuel Ares、Xiang Dong Fu、Eugene Yeo和D.L.B.）、NIH-拨款P01-CA95616和国家癌症研究基金会研究员奖（W.K.C.）。D.L.B.是霍华德·休斯医学研究所的研究员。这项工作也得到了摩尔癌症中心核心拨款NCI P30CA23100的支持。