溶酶体膜的扩展蛋白质组图谱揭示了新的潜在转运蛋白^*

摘要

溶酶体是膜结合的细胞内细胞器，在生物材料的降解和再循环中起着关键作用。由于溶酶体蛋白质或参与溶酶体生物发生的蛋白质的遗传缺陷而导致的约50种溶酶体贮存疾病的存在，突显了它们在细胞生理学中的关键作用(1). 降解功能是通过60多种水解酶和辅助蛋白的协同作用在溶酶体腔中实现的(2). 尽管这些可溶性溶酶体蛋白已被广泛研究，但关于膜蛋白的知识仍然相当有限，尽管膜具有多种关键功能。它确实负责建立和维持pH值和离子梯度，将降解底物和产物从细胞液中运输到细胞液中，并保持溶酶体的完整性。此外，溶酶体膜与其他内吞或生物合成室发生多次融合和裂变事件。降解底物通过内吞、吞噬和自噬途径从细胞外环境、质膜或细胞质输送到溶酶体。将新合成的物质输送到溶酶体需要内吞或生物合成细胞器与溶酶体之间的交换。与溶酶体膜相关的分子机制支持了这些众多的贩运事件(三).

在过去的十年中，基于大规模质谱的方法被用于研究溶酶体蛋白质组成。首先使用基于甘露糖6-磷酸修饰的亲和纯化方案分析可溶性含量(4–11)这是可溶性溶酶体蛋白的特征(12). 这导致鉴定了大约60种已知的腔溶酶体蛋白，以及许多以前认为不具有溶酶体功能的甘露糖6-磷酸蛋白(13). 为了深入了解膜的组成，一些研究小组使用了制备亚细胞分离法来回收富含溶酶体的样品(14–18). 尽管后一种方法的实验局限性无法完全分离细胞器，但比较策略和统计工具的使用(14,16,17)允许鉴定新的假定常驻溶酶体膜蛋白，包括一些潜在的转运蛋白，如SLC12A4、SLC44A2、C19ORF28（MFSD12）、SIDT2和MFSD1(14,16). 最近，选择性溶酶体密度偏移和质谱定量的耦合被证明可以同时鉴定和验证候选溶酶体(19). 通过几种选定蛋白质的有效溶酶体驻留证明了这些不同方法在识别候选蛋白方面的效率(16,20–29). 关于膜蛋白，这些研究产生了一个约45个完整的膜溶酶体蛋白的列表，其中溶酶体定位的证据是通过表位标记的融合蛋白的过度表达获得的(30).

然而，尽管这些最近的研究提供了更多的知识，但许多溶酶体因子仍然缺失。例如，尽管已有超过20种溶酶体转运活性的生物化学描述(31,32)，这些转运功能中的许多仍然是孤立的，因为潜在的蛋白质尚未被鉴定(33). 本蛋白质组学研究的目的是为了更深入地了解溶酶体膜及其相关蛋白的特性，鉴于新型潜在溶酶体转运体在溶酶体生理学中的主要作用，因此对其特别感兴趣。转运蛋白是完整的膜蛋白（IMP）¹显示了多个跨膜结构域，而这种IMP由于其高疏水性和低丰度，通常很难通过质谱鉴定(34,35). 因此，为了扩展我们的蛋白质鉴定能力，我们在MS分析之前结合了亚细胞和生化分离。我们首先建立了一份2385个基因产物的总体列表，这些基因产物来自富含溶酶体和不富含溶酶体组分。然后，基于光谱计数的比较蛋白质组学分析选择了734个候选蛋白质。他们一方面包括94种新的潜在溶酶体蛋白，另一方面包括46种已建立或推测的转运体，本研究建议其存在溶酶体。溶酶体定位已被9个候选者验证，其中包括5个转运蛋白。此外，我们最近在其他地方发现，在蛋白质组研究中发现的另一个候选物PQLC2是一种新型溶酶体氨基酸转运体(36).

实验程序

亚细胞分离

所有涉及大鼠的实验均按照机构动物使用委员会批准的协议进行。肝脏取自雄性Wistar大鼠。基本上如前所述，每种制剂均在四只大鼠肝脏上进行(37). 简单地说，通过差速离心分离亚细胞器产生细胞核和重线粒体（NM）、轻线粒体（L）以及微粒体和可溶性（PS）组分。L组分在不连续Nycodenz密度梯度上进行等密度离心。梯度的条件与原始出版物中描述的基本相同(37)，但使用Nycodenz®代替了metrizamide。将以下密度层依次加载到L组分的顶部：1.16（7 ml）、1.145（6 ml）、11.35（7 ml。在83000×克在SW28贝克曼转子中保持2小时30分钟。第2部分（各密度层之间的界面，1.10和1.135 g/ml）恢复为L+（“溶酶体富集”）部分。将组分1、3和4（上部和下部组分）合并为L−（“溶酶体未富集”）组分。分别用0.25稀释L+和L-组分的细胞器米蔗糖，超速离心造粒（100000×克，4°C，1 h），并在缓冲液a（10 m）中受到低渗透性休克米Hepes，pH 7.8，补充蛋白酶抑制剂（Complete，Roche Applied Science）。通过超速离心（100000×克，4°C，1 h），在缓冲液A中广泛清洗，并在储存于−80°C之前再次悬浮于200μl缓冲液A。

通过差速离心和Nycodenz梯度回收组分中的溶酶体，然后进行β-半乳糖苷酶活性测量(38). 这些数据以及每个组分中回收的蛋白质量允许计算与初始匀浆相比的纯化因子。使用Micro BCA评估蛋白质浓度^TM（TM）蛋白质分析试剂盒（Thermo Scientific）。

氯仿/甲醇萃取

根据Salvi对蛋白质进行氯仿/甲醇（CM）分级等。(39). 简单地说，对缓冲液A中250μg细胞器膜（1–10 mg/ml）进行超声处理，在冰上放置15分钟，并在100000×克以及在4°C时。然后将膜芯轻轻地重新悬浮在100μl缓冲液A中，并在900μl冰上冷CM（5:4，v/v）中缓慢稀释。将混合物放在冰上15分钟，定期搅拌，然后离心（15分钟，15000×克（4°C），以产生颗粒（CM-不溶部分，CMI）和上清液（CM-溶部分，CMS，包含最疏水的蛋白质）。将CMS馏分中的溶剂在氮气下蒸发至100μl，蛋白质被丙酮沉淀。将CMI和CMS颗粒的蛋白质溶解在Laemmli缓冲液中进行SDS-PAGE分离。

Triton®声波风廓线仪X-114相位分离

Triton®声波风廓线仪X-114相位分离根据Donoghue进行等。(40). 简单地说，对缓冲液A中250μg细胞器膜（1–10 mg/ml）进行超声处理，在冰上放置15分钟，并在10万×克4°C时。然后将膜颗粒轻轻重悬于800μl冷PBS中，并加入200μl 10%Triton X-114（Sigma-Aldrich）。在4°C的温度下在旋转轮上轻轻搅拌混合物过夜，并通过离心（30 min，20000×克，4°C）。将上清液在37°C下加热30 min并离心（30 min，5000×克，25°C）用于相分离。将上层水相（AQ）和下层洗涤剂相（DT）分别与200μl的10%Triton X-114和800μl的冷PBS混合，在37°C下培养15分钟，并如前所述离心。该步骤重复了三次，然后恢复最后的AQ和DT相以及DT分数（DTP）中存在的颗粒。AQ和DT蛋白被丙酮沉淀，所有样品最终溶解在Laemmli缓冲液中进行SDS-PAGE分离。未保存第一个复制品的AQ样品。

SDS-PAGE蛋白分离和Western Blots

对于蛋白质印迹，如前所述，通过SDS-PAGE分离蛋白质(41)转移到PVDF膜（Immobilon P，Millipore），并用以下针对亚细胞器标记物的抗体进行免疫检测：单克隆小鼠抗鼠LAMP2，1:5（10D10；自制）；兔多克隆抗OSCP，1:50000（G.Brandolin赠品），兔多克隆抗GRP78，1:250（BiP；Abcam，ab2902）；小鼠单克隆抗TGN38，1:250（转导实验室，{“type”：“entrez-notide”，“attrs”：{“text”：”T69020“，”term_id“：”680168“，”term_text“：”T59020“}}T69020吨); 兔多克隆抗58K蛋白，1:500（FTCD；Abcam，ab5820）；兔多克隆抗Rab5，1:2000（StressGen，KAP-GP006）；和鼠抗α1钠钾ATP酶单克隆抗体，1:5000（Abcam，ab7671）。蛋白质通过Western Lightning Plus-ECL试剂（PerkinElmer Life Sciences）显示，并在放射自显影胶片（Kodak Biomax XAR）上显示。

对于MS分析，在4–12%梯度丙烯酰胺凝胶（NuPAGE，Invitrogen）上对还原蛋白进行SDS-PAGE分离。蛋白质通过生物安全考马斯染色或考马斯亮蓝R-250（Bio-Rad）染色。装载蛋白质的数量和迁移长度适应蛋白质样品的复杂性。

MS样品制备

为了进行蛋白质消化，将每个SDS-聚丙烯酰胺凝胶条带系统地切割成1-mm的条带，并在25m内连续培养多次洗涤米全日空航空公司₄HCO公司_三15分钟，在50%（v/v）乙腈中，25 m米全日空航空公司₄HCO公司_三凝胶片用100%乙腈脱水15分钟，然后用7%H培养₂O（运行）₂保持15分钟，然后用上述脱色溶液再次清洗。0.15μg修饰胰蛋白酶（Promega，测序级），25 m米全日空航空公司₄HCO公司_三添加到脱水凝胶片中，在37°C下隔夜培养。在30μl 50%乙腈、30μl 5%甲酸和30μl 100%乙腈中，通过三个15分钟的连续提取步骤从凝胶片中提取肽。汇集的上清液最终在真空下干燥。

纳米LC-MS/MS分析

将干燥提取的肽重新悬浮在30μl的4%乙腈、0.5%三氟乙酸中，并通过在线纳米LC-MS/MS（Ultimate 3000和LTQ-Orbitrap，Thermo Fisher Scientific）进行分析。纳米液相色谱法由40-min的梯度组成，梯度范围为5%至55%的乙腈和0.1%甲酸，流速为300 nl/min。肽在300μm×5 mm的PepMap C18预柱上取样，并在75μm×150 mm的C18柱上分离（Gemini C18，Phenomenex）。MS和MS/MS数据使用Xcalibur（Thermo Fischer Scientific）采集，并使用Mascot Daemon软件（2.1版，矩阵科学）自动处理。

蛋白质鉴定的数据库检索和标准

使用Mascot 2.1（英国伦敦矩阵科学）对每个样本连续搜索IPI_rat_decoy_数据库（基于IPI-rat 3.48版数据库；80082个条目，包括反向条目）。选择ESI-TRAP作为仪器，胰蛋白酶作为酶，并允许两次漏切。前体和片段质量误差容限分别设置为15 ppm和1 Da。搜索期间允许的肽变量修改为：乙酰基（N末端）、氧化（M）、二氧化（M）和三氧化（C）。由至少一个独特肽识别的蛋白质，其得分高于查询阈值（对于第页肽值<0.01）使用IRMa自动验证(42). 过滤后的结果被下载到MS鉴定数据库中，其中肽错误发现率（FDR）为2.38%。（FDR=2×反向/（反向+正向））。自制工具²用于汇编、分组由相同肽集或肽子集识别的蛋白质（根据简约原则）并进行最终比较。短于六聚体的肽在分组步骤中被拒绝。最后一个过滤步骤仅保留由至少两个独特肽识别的蛋白质组。结果中删除了所有角蛋白亚型和胰蛋白酶。所有MS数据均可在Pride数据库网站上获得(43)作为骄傲项目22847。

蛋白质注释

基因名称从IPI-大鼠或Uniprot数据库检索。针对哺乳动物Uniprot数据库部分（2011年2月发布），对未鉴定的蛋白质（IPI序列集）进行了Blastp过程。保留了最热门的蛋白质点击，其电子值至少为10e-05，查询覆盖率大于50%，并手动检查其相关性。查询覆盖率表示包含在对齐段中的查询长度的百分比，并对所有段进行计算。当几个蛋白质组对应相同的基因名称时，它们都被保留下来。

TMHMM 2.0版服务器（丹麦林比生物序列分析中心）用于预测跨膜区域(即跨膜结构域）。蛋白质功能注释和亚细胞定位信息，无论是实验性的还是预测性的，都是从IPI、Uniprot或QuickGO网站和参考书目中收集的。

光谱计数和半定量分析

对于每个确定的蛋白质第页、光谱计数值（sc_{p、 秒}=给定样品中每个蛋白质的指定光谱数秒)使用自制的hEIDI软件进行测定(补充表S1和S2). 考虑了过滤步骤后指向给定蛋白质的所有光谱。对于包含一个或多个亚型的每个蛋白质组，计算一次与蛋白质亚型匹配的光谱。然后，在CM或Triton X-114提取之前，将这些光谱计数值归一化为总膜蛋白的当量（微克）(图1)已经注入光谱仪。因此，归一化光谱计数（Nsc）对应于每微克总MbL+或MbL−蛋白质的光谱数。对于每个确定的蛋白质第页，首先计算每个样本的Nsc值秒（Nsc_{p、 秒})，则对于每个分数（f）（MbL+或MbL−；Nsc_{p、 （f）})在每个复制中，作为Nsc的总和_{p、 秒}在CMS、CMI、AQ、DTP和DT样本中，最后对每个MbL+或MbL−分数求和Nsc_{p、 （f）}三个重复获得。基于无标签光谱计数法评估给定样品或组分中蛋白质的相对丰度(44)，并通过除以Nsc执行_{p、 秒}或Nsc_{p、 （f）}所考虑样品或分数的总Nsc。

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图1。

MS分析样品制备的工作流程。大鼠肝匀浆的差速离心(H（H）)产生一个较轻的线粒体部分L，提交给Nycodenz梯度离心。这一步骤允许分离富含溶酶体的部分(L（左）+)从梯度的其余部分(L（左）−). 低渗透性休克使L+和L-的细胞器破裂，超离心使细胞膜恢复。膜芯(百万磅+和百万磅−）被分成两个相等的部分，通过基于蛋白质疏水性的独立方法（氯仿/甲醇萃取或Triton X-114）分别进行分离(TX114电话)相分离）。随后，在对凝胶内消化样品进行LC-MS/MS分析之前，用SDS-PAGE分离所有所得样品。

对于每种蛋白质，计算包含相对蛋白质丰度和含有该蛋白质的样品数量的光谱指数（SpI），如Fu所示等。(45)允许比较MbL−和MbL+样本。通过排列分析建立置信区间(45)并用于测定MbL+（溶酶体候选蛋白）中显著富集的蛋白质。

分子克隆

从Source Bioscience获得编码以下蛋白质的IMAGE或ORFEOME克隆：LOH12CR1、MFSD1、PTTG1IP、SLC37A2、SLC38A7、SLC46A3、SLCO2B1、STARD10、TMEM104、TMEM175、TTYH2和TTYH3。以融合聚合酶（新英格兰生物实验室）和商业质粒为模板，通过PCR扩增插入物，并克隆用于GFP或YFP融合蛋白的异源表达。原始质粒、DNA加入编号、引物和表达载体见补充表S3.

细胞培养和荧光研究

HeLa细胞取自美国型培养物收集中心（ATCC），在添加10%FBS的DMEM/GlutaMAXI中生长。培养基和血清分别来自PAA实验室和Invitrogen。用电穿孔或脂质体感染法用Lipofectamine 2000瞬时转染细胞，转染2天后处理表面荧光。细胞在室温下固定在4%多聚甲醛中。抗体按以下稀释液使用：小鼠单克隆抗人LAMP1，1:2000（H4A3，发育研究杂交瘤库）；Cy3-共轭驴抗鼠药，1:1000（杰克逊实验室）。使用尼康TE2000表观荧光显微镜检查荧光。使用Metamorp软件（Universal Imaging Corp.）基于PSF的迭代三维反褶积模块采集图像后进行反褶卷。

结果

为了扩展我们对溶酶体蛋白质含量的了解，特别是对膜蛋白，尤其是转运体的了解，我们对富含和不富含溶酶体的大鼠肝脏组分的膜进行了半定量和比较蛋白质组学分析。由于尚待发现的新蛋白质丰度较低，我们通过分析几个生物复制品以及使用膜蛋白亚分馏和SDS-PAGE降低样品复杂性，最大限度地提高了蛋白质的分辨率和覆盖率。基于识别蛋白质的多余肽数量的无标签光谱计数方法(44,46)，用于评估每个蛋白质的相对丰度。通过对溶酶体富集组分和非富集组分的统计比较，进一步选择溶酶体候选蛋白(45). 最后，在多程跨膜蛋白中鉴定出新的候选溶酶体转运体。

从富含溶酶体和富含非溶酶体的级分制备样品

我们基本上遵循了Wattiaux的既定协议等。(37)用于制备溶酶体组分(图1). 首先通过差速离心分离大鼠肝匀浆，并在不连续Nycodenz密度梯度上进一步分离初级溶酶体富集部分（部分L）(47)产生次级L+和L-分数。Nycodenz是一种梯度介质，与最初描述的metrizamide介质一样，它对各种细胞器显示出非常相似的条带密度(48). 制作了三种独立的制剂（生物复制品）。我们的方案旨在改进IMP的鉴定，因为它们的疏水性和通常低丰度阻碍了它们在高度复杂的蛋白质样品中的MS检测和鉴定(34,35). 然而，我们也试图保留外周膜相关蛋白。这些膜相关蛋白确实包括各种运输机制和细胞骨架相关蛋白，它们对内溶酶体的生物发生和功能至关重要。因此，我们避免了去除膜相关蛋白质的苛刻处理，例如碱性洗涤，以制备L+和L−膜（分别为MbL+和MbL−组分）。然后，我们根据蛋白质的疏水性，通过两种独立的处理方法，即氯仿/甲醇萃取，将这两个组分进行亚馏分(39)和Triton®声波风廓线仪X-114相位分离(图1) (40,49). 所有得到的样品最后通过1D电泳分离，然后进行MS分析。

测量三个重复的β-半乳糖苷酶活性，以跟踪溶酶体沿着分馏过程的恢复。这些测量结果表明，相对于初始肝匀浆，L、L+和L−组分在溶酶体中的富集程度分别为9–13-、65–75-和7–9.5倍。这些值与公布的数据一致(37,47)，表明与L相比，L+和L−分别富集和不富集，L+中溶酶体的浓度比L−高得多（～7–9倍）。因此，这些组分分别被描述为溶酶体富集和溶酶体未富集，此后对“富集”的评估将始终基于L+和L-组分之间的比较。

然后，我们通过免疫检测NM、L和PS组分以及L、L+和L−组分的膜中的细胞器标记，分析了几个亚细胞隔室的富集情况(图2). 溶酶体蛋白LAMP2是唯一在L和MbL+组分中高度富集的蛋白质。Rab5（早期内体）、钠钾ATP酶α1亚基（质膜）、TGN38（TGN）和FTCD（高尔基体）从L中缺失，在PS中不同程度富集。尽管它们都显示出MbL+的某些富集，但TGN38是唯一一个与LAMP2的富集程度相当的。线粒体ATP合酶OSCP亚单位和内质网BiP在MbL+中均被耗尽。

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图2。

亚细胞组分的蛋白质印迹分析。通过Western blot分析检测差异离心组分中细胞器蛋白标记的相对丰度(H、 NM、L、和PS（聚苯乙烯）)以及从L组分和L+和L−样品中回收的膜中（分别MbL、MbL+、和百万磅−). 每个样品的蛋白质含量相同（25μg）。亚细胞标记如下：灯2，溶酶体；拉布5早期内体；钠钾ATP酶α1亚基(Na/K-ATP酶)、质膜；TGN38型,反式-高尔基网络；FTCD公司，高尔基；OSCP公司ATP合成酶亚基，线粒体；和商业保险，内质网。对于每个测试的蛋白质，SpI（见“结果”和图4)如所示斜体字.

蛋白质鉴定

从三个生物复制品中，我们生成了959个MS分析。经过一次过滤后，产生了1398920个光谱，其中368147个可归属于IPI-大鼠数据库中的4097个非冗余大鼠基因产物。根据简约原则，不能被识别的肽分离的蛋白质亚型被视为一种独特的基因产物。4097个基因产物对应24316个非冗余肽序列。所有相应的蛋白质和肽信息可在项目编号为22847的Pride数据库和补充表S2进一步过滤，排除胰蛋白酶和角蛋白作为污染物，保留由至少两种独特肽识别的蛋白质，得到2385个非冗余基因产物的列表，以下称为MbL2385列表。在该列表中，528个蛋白质仅存在于MbL+组分中，157个蛋白质仅在MbL−组分中存在，1700个蛋白质存在于两个组分中(补充表S4a和S5a). 因此，大多数蛋白质对MbL+和MbL-组分都是常见的，这与亚细胞分级的有限分辨率和质谱仪的高灵敏度一致。

为了评估样品中IMP的含量，使用TMHMM 2.0服务器预测跨膜结构域(补充表S4a). 这导致鉴定出762个IMP（32%），包括361个多面体蛋白（至少有两个跨膜结构域的蛋白，15.1%）。

半定量数据的提取

尽管通过本研究中使用的成熟的Nycodenz梯度法获得了高富集因子，但其他细胞器（如线粒体）的共分馏对真正溶酶体居民的鉴定提出了挑战，包括具有双重或多重定位的蛋白质。因此，我们比较了溶酶体富集组分和非富集组分的蛋白质集，以确定与溶酶体相关的子集。由于大多数蛋白质都是MbL+和MbL−组分共有的，因此比较它们的数量比比较它们的丰度（比较图3具有补充图S1). 从光谱计数数据中提取丰度信息(补充表S1)，根据光谱计数半定量方法(44,46). 任何给定蛋白质的相对丰度都是根据“实验程序”中使用所有MbL+或MbL−样本发布的合并数据计算得出的Nsc得出的(补充表S1).

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图3。

蛋白质在MbL+和MbL-中的亚细胞分布。MbL+中蛋白质的相对丰度(黑色条)或MbL−(灰色条)根据亚细胞分类进行比较。左侧面板，所有蛋白质的分布。右侧面板多面体蛋白的分布(即包含至少两个跨膜结构域）。

MbL+和MbL−分数显示不同的器官轮廓

然后，我们通过在蛋白质数据库（IPI、UniprotKB和QuickGO）和参考书目中手动收集这些信息，分析了MbL2385列表中已知或预测的蛋白质亚细胞定位。对于没有任何属性化基因名称的IPI条目，之前使用Blastp在Uniprot数据库的哺乳动物子集中搜索同源物。这允许根据以下亚细胞类别比较MbL+和MbL-中的蛋白质丰度：内溶酶体（EL）、质膜（PM）、线粒体、过氧化物酶体和细胞核（MPN）、内质网（ER）、高尔基体（G）、细胞质（C）、细胞骨架（CS）、分泌型（S）、杂项（Misc；囊泡、颗粒和多处定位）和未知。根据亚细胞分布比较MbL+和MbL−中的蛋白质丰度显示出显著差异(图3,左侧面板;补充表S5c); EL和PM蛋白在MbL+中明显富集，因为它们总共占材料的34%，而只有MbL−中的4.7%。相比之下，ER和MPN亚区的蛋白质从MbL+相对于MbL-−（分别为34.2%和73.7%）耗尽。在随后的分析中系统地观察到EL和PM蛋白以及ER和MPN蛋白的类似行为。尽管MbL+部分略有富集（MbL丰度的0.59%+与0.15%（MbL−），少量高尔基蛋白(n个=30）在随后的定量分析中与ER和MPN蛋白一起被列为“污染物”（见下文）。除细胞质外，其他亚细胞成分（CS、S和Misc）在MbL+组分中略有富集（15.6与7.1%). 未知定位蛋白的数量分别为11.2%和10.0%，而MbL+和MbL−的丰度分别为6.3%和3.8%，表明此类蛋白的平均相对丰度较低(图3,左侧面板、和补充图S1和补充表S5c).

因此，来自我们的光谱计数数据的亚细胞分布特征与基于一组有限的细胞器标记的定性预期一致(图2) (37). MbL+中污染物细胞器的大量存在被认为是亚细胞组分的一个已知特征。因此，我们的结果验证了使用基于光谱计数的半定量方法来描述和分析这些分数。

蛋白质对溶酶体的分配

我们研究的下一步是确定MbL+中确定的哪些蛋白确实是新的潜在溶酶体蛋白。因此，我们旨在确定MbL+相对于MbL−的显著富集，例如，与观察到的典型溶酶体标记物β-半乳糖苷酶相对于L−在L+中的富集类似。来自MbL+组分的蛋白质要么只在MbL＋中检测到，要么在两个组分中都检测到(补充表S4a). 在仅存在于MbL+中的528个蛋白质中，我们选择仅存在于三个生物复制品中至少两个并通过至少五个光谱（356个蛋白质；补充表S4b). 在MbL+和MbL−共有的蛋白质中，溶酶体候选蛋白是根据其SpI选择的(45)，一个同时考虑相对蛋白质丰度（通过归一化光谱计数估计）和发现蛋白质的重复次数的参数(补充表S1和S4a). SpI值的范围为-1至+1，与MbL−和MbL+组分中几乎完全检测到的蛋白质相对应的下限和上限值。这些值在MbL2385列表中显示出大致的双峰分布，大量峰值覆盖负值，第二个子集向+1的SpI上升(图4A类). SpI分析强调了不同注释亚细胞类别蛋白质的MbL+和MbL−之间的不同分布(图4B类). 事实上，来自污染物的蛋白质（主要是线粒体、ER和过氧化物酶体蛋白质）是导致负SpI大量峰值的主要因素，而EL和PM蛋白质表现出较高的SpI值趋势，其各自的中值分别为0.77和0.60。通过排列分析建立置信区间(45). 当蛋白质的SpI高于第95百分位临界值（SpI≥0.594）时，被认为是MbL+的显著富集，1700个蛋白质中有378个达到这一水平(补充表S4b).

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图4。

光谱指数的分布。已识别蛋白质的光谱指数分布表示为（in黑色)以及随机分布(浅灰色)由排列分析得出。5%和1%置信区间的阈值（表示MbL+显著富集）表示为虚线。A类MbL+和MbL−共有的所有已鉴定蛋白质的SpI分布。B类，特定亚细胞注释蛋白质的SpI分布。每类蛋白质的数量如下：全部,n个= 1,700;EL公司,n个= 160;急诊室,n个= 228;高尔基人,n个= 19;线粒体,n个= 419;核,n个= 32; 其他，n个= 467;过氧化物酶体，n= 44; 下午，n个= 163;未知,n个= 168;x个轴，SpI（范围从−1到+1）；年轴，蛋白质数量。

总之，我们对MbL+显著富集的选择标准使我们对734个蛋白质进行了分类（Lys-734列表；补充表S4b)在2385个中。这一选择包括79.3%(n个=207），56%(n个=132），仅为3.2%(n个=28）污染蛋白质(图5A类和补充表S5d). C、CS、S和Misc类别由总共273个蛋白质表示。据我们所知，94种蛋白质中有38种没有任何亚细胞定位注释(表一)是全新的溶酶体候选物，因为它们在以前的溶酶体蛋白组学研究中没有被鉴定(14–17,19).

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图5。

Lys-734蛋白质的亚细胞和功能分布。 A类，根据其亚细胞注释的蛋白质分布。展示了未知定位蛋白质的功能注释。“细胞质”、“细胞骨架”、“分泌的”和“杂项”合并在其他类别。B类，根据其功能注释的蛋白质分布。每个饼图部分表示相应类别蛋白质的相对丰度。显示了蛋白质的数量。

表一

潜在新型溶酶体蛋白列表

给出了Lys-734列表中没有任何亚细胞定位注释的蛋白质。其功能如下：I、免疫功能；M、 代谢；杂项，杂项；MT，膜贩运；R/S、受体和信号；T、 输送器、通道和离子泵；U、 未知；TM，跨膜结构域数量；SpI，光谱指数；NA，不适用（仅在MbL+中识别的蛋白质）。MFSD1的溶酶体定位已在本研究过程中显示(66).

基因名称	描述	加入编号。	TM（TM）	功能	SpI公司	肽的数量	新闻报道
阿布卡6	Abca6，类似于ATP结合盒，A亚家族（ABC1），成员6	IPI00762951	13	吨	0.76	6	4.61
Acp1基因	低分子量磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶的Acp1亚型1	IPI00206664号	0	R/S公司	不适用	2	12.66
阿夫米德	LOC688283，类似于犬尿素甲酰胺酶	IPI00882532号	0	M（M）	不适用	7	27.45
阿西	腺苷同型半胱氨酸酶	IPI00476295	0	M（M）	0.60	16	38.66
阿克尔12l1	RGD1559604，类似于蛋白质RAKd	IPI00557070	0	M（M）	不适用	4	13.31
阿克1c13	LOC364773，17β-羟基类固醇脱氢酶	IPI00387641号	0	M（M）	不适用	5	19,38
Aox3公司	Aox3，醛氧化酶1	IPI00205560	0	M（M）	0.88	26	25.11
阿普5z1	Kiaa0415，假设蛋白质LOC641386	IPI00363750型	0	机器翻译	不适用	8	11.03
附件11c-ps1	128-kDa蛋白质	IPI00370178	8	吨	0.63	25	27.32
C10或32	RGD1311783，假设蛋白质	IPI00371685	0	U型	不适用	10	59.06
C16或62	LOC361635，UPF0505蛋白C16orf62同源物	IPI00569226	0	U型	0.80	5	5.61
C17或59	LOC497934，非特征化蛋白C17orf59同源物	IPI00188598	0	U型	0.87	11	22.16
C1加仑1	C1galt1，糖蛋白-N个-乙酰半乳糖胺3β-半乳糖基转移酶1	IPI00200858	1	M（M）	不适用	7	19.83
C1加仑1c1	C1galt1c1，C1GALT1特异性伴侣1	IPI00197034号	1	其他	不适用	三	11.08
C2或72	18-kDa蛋白质	IPI00188569	0	U型	不适用	4	36.9
C6或58	RGD1311933，假设蛋白质	IPI00358842号	0	U型	0.95	9	29.97
C9或91	RGD1304595，假设蛋白质LOC298104	IPI00357901号	2	U型	不适用	7	22.51
碳酸钙	Car2，碳酸酐酶2	IPI00230787号	0	M（M）	不适用	2	8.85
缓存1	RGD1311501，假设蛋白质LOC296599	IPI00363948号	三	吨	不适用	2	14.62
抄送22	Ccdc22，类似于包含22的线圈域	IPI00362580	0	U型	不适用	11	23, 6
抄送93	Ccdc93，线圈域蛋白93	IPI00371846号	0	U型	不适用	10	18.28
抄送302	Cd302、Cd302抗原	IPI00372762	1	R/S公司	不适用	4	15.79
克莱克4f	Clec4f，C型凝集素结构域家族4成员F	IPI00193212号	1	R/S公司	0.98	20	33.64
克莱克4克	Clec4g，类似于C型凝集素结构域家族4，成员g	IPI00764324	1	U型	不适用	4	14.65
Cnp公司	Cnp，2′，3′-环核苷酸3′-磷酸二酯酶	IPI00199394号	0	M（M）	0.78	5	13.81
命令10	Commd10，COMM域包含10	电话：00365123	0	U型	不适用	8	36.63
命令2	Commd2，COMM域包含2	IPI00372217号	0	U型	不适用	2	8.54
命令3	Commd3，COMM结构域蛋白3	IPI00400613	0	U型	不适用	6	36.92
命令7	Commd7，COMM域包含7	IPI00373166	0	其他	不适用	5	31
命令9	Commd9，COMM域包含9	IPI00210812	0	U型	不适用	8	58.59
Cpne5型	Cpne5，副驾驶V	IPI00360489	0	机器翻译	0.60	2	3.04
克里普2	Crip2，富含半胱氨酸的蛋白质2	IPI00200352	0	其他	不适用	三	33.65
Csad公司	半胱氨酸亚磺酸脱羧酶	IPI00214394	0	M（M）	0.74	12	32.86
Csnk2a1号机组	Csnk2a1，酪蛋白激酶II亚单位α	电话：00192586	0	R/S公司	不适用	4	10.23
达克	二羟基丙酮激酶	IPI00372498号	0	M（M）	0.81	22	46.71
Dnajc13号机组	Dnajc13，108-kDa蛋白质	IPI00366703号	0	U型	不适用	三	5.59
Dnajc13号机组	Dnajc13，DnaJ（Hsp40）同源物，C亚家族，成员13	IPI00870706	0	U型	不适用	6	4.14
Dnajc5号机组	Dnajc5，DnaJ同源亚家族C成员5	IPI00210881	0	其他	0.63	6	31.31
英语4	Enpp4，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶4	IPI00371761	1	M（M）	0.89	5	11.07
爱普斯	埃普斯，LRRGT00050	IPI00476855	0	M（M）	不适用	4	2.76
第1层	Fth1，铁蛋白重链	IPI00777061	0	其他	0.70	14	59.34
格纳11	Gna11，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白α-11亚单位	IPI00200437	0	R/S公司	0.86	13	36.21
格纳13	Gna13，Gα13	IPI00422053	0	R/S公司	0.79	13	34.22
格纳14	Gna14，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白，α14	IPI00360645型	0	R/S公司	0.86	三	12.68
Gnai3号机组	Gnai3，鸟嘌呤核苷酸结合蛋白G（k）亚基α	IPI00231726号	0	R/S公司	0.88	12	43.22
Gpr155号	Gpr155 G蛋白偶联受体155	IPI00365274	17	R/S公司	0.89	9	14.29
Grhpr公司	Grhpr，Grhpr蛋白	IPI00767591号	0	M（M）	0.87	7	24.18
Haao公司	Haao 3-羟基邻氨基苯甲酸3，4-二加氧酶	IPI00339188号	0	M（M）	不适用	9	22.03
Iah1级	Iah1，乙酸异戊酯水解酯酶1同源物	IPI00421610	0	M（M）	不适用	5	16.47
免疫球蛋白	免疫球蛋白Ac2-233	IPI00369234号	0	M（M）	不适用	5	5.73
Itfg3号机组	Itfg3蛋白Itfg3	电话：00372350	1	U型	不适用	5	11.78
雅克1	Jak1，类似于酪氨酸蛋白激酶Jak1	IPI00212981	0	R/S公司	0.75	三	2.84
12千立方英尺	Kctd12，类似于钾通道四聚体结构域蛋白12	IPI00767085	0	其他	不适用	三	9.77
千倍1	LOC498606，UPF0459蛋白C19orf50同源物	IPI00197953	0	U型	不适用	7	28.25
拉加尔5	半乳糖5，半乳糖凝集素5	IPI00231663型	0	其他	0.94	8	55.17
低12cr1	Loh12cr1，杂合性缺失，12，染色体区域1同源	IPI00189639	0	U型	0.94	22	80.51
墨西哥比索	LOC684626，类似于K11B4.2	电话：00364627	0	U型	0.97	6	38.66
Mfsd1型	Mfsd1，类似于主要促进者超家族域控制1	IPI00373212号	11	吨	不适用	6	18.75
麦克风1	RGD1311805，类似于RIKEN cDNA 2400010D15	IPI00363472号	0	U型	不适用	25	41.55
Mios公司	RGD1308432，类似于缺失的卵母细胞CG7074-PA	IPI00199953	0	U型	不适用	7	8.11
周一b	Mon1b，MON1同源物b	IPI00359673号	0	机器翻译	0.93	23	53.86
姆佩格1	巨噬细胞表达基因1蛋白	IPI00204417号	1	U型	0.80	18	39.92
Myadm公司	Myadm，骨髓相关分化标志物	电话：00339007	8	U型	0.76	2	8.49
小睡	LOC682827，35-kDa蛋白质	IPI00367524号	0	机器翻译	0.92	28	52.24
奥普拉	Oplah，5-氧丙烷酶	IPI00326436号	0	M（M）	不适用	5	5.05
帕	苯丙氨酸-4-羟化酶	IPI00193258	0	M（M）	0.66	11	36.64
铅铅	Pbld，奋乃静生物合成类结构域蛋白	IPI00200041	0	M（M）	不适用	6	32.64
基本业务流程1	Pebp1，磷脂酰乙醇胺结合蛋白1	IPI00230937号	0	其他	0.68	5	43.85
匹克3ca	Pik3ca，类似于磷脂酰肌醇-4,5-二磷酸3-激酶催化亚基α亚型	IPI00955176	0	R/S公司	0.64	2	2.06
派克	类似于丙酮酸激酶3	IPI00561880	0	M（M）	不适用	18	35.78
Pklr公司	Pklr，异型R型丙酮酸激酶同工酶R/L	IPI00202549	0	M（M）	0.86	18	43.55
广场2a	Pla2g2a，磷脂酶A2，膜相关	IPI00205248	1	M（M）	不适用	三	28.08
第1页	Ppa1，类似于焦磷酸酶	IPI00371957	0	M（M）	不适用	三	11.63
项目1	Prkag1，5′-AMP活化蛋白激酶亚单位γ-1	IPI00196645	0	R/S公司	0.72	5	20
卢比1	Rbp1，视黄醇结合蛋白1	IPI00231825	0	吨	不适用	5	29.63
RGD1308461型	RGD1308461，类似于CG5149-PA	IPI00359821号	0	U型	不适用	9	24.35
第14l4节	第14l4节、第14-like 4节	IPI00204634号	0	其他	0.66	11	31.07
Slc38a7系列	Slc38a7，推测的钠偶联中性氨基酸转运蛋白7	IPI00421684号	11	吨	不适用	7	10.8
Slc46a3系列	Slc46a3，溶质载体家族46成员3	IPI00364398号	11	吨	不适用	2	5.86
Slco2b1公司	Slco2b1，溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员2B1	IPI00230858型	12	吨	0.75	三	5.56
索德	山梨醇脱氢酶	IPI00760137（IPI0076137）	0	M（M）	0.68	16	45.1
标准10	Stard10，START域包含10	IPI00555188号	0	U型	不适用	5	16.21
标签3	Tagln3、transgelin-3	IPI00210532	0	U型	不适用	5	11.47
Tgm2型	Tgm2、转谷氨酰胺酶2、C多肽	IPI00205135	0	M（M）	不适用	6	11.81
变压器9sf4	Tm9sf4，跨膜9超家族成员4	IPI00373155号	9	其他	不适用	9	13.84
内存104	Tmem104，类似于CG5262-PA	IPI00778760	11	吨	不适用	6	11.29
T内存144	Tmem144，跨膜蛋白144	IPI00373219	10	U型	0.95	5	23.85
Tmem175型	Tmem175，跨膜蛋白175	IPI00211068	9	U型	不适用	5	18.44
UBB公司	LOC679594；LOC682397类似于多泛素	IPI00763565	0	M（M）	0.88	三	38.96
Ubl3号机组	Ubl3，泛素样蛋白3	IPI00358637号	0	U型	不适用	6	47.01
乌洛克1	Uroc1，类似于含有1的尿激酶结构域	电话：00388707	0	M（M）	不适用	8	14.35
UST4r公司	UST4r，推测的完整膜转运蛋白	IPI00202688	7	吨	0.89	6	10.33
Vsig4型	Vsig4、V-set和免疫球蛋白结构域4	IPI00372986	1	R/S公司	不适用	5	17.19
第81周	Wdr81，类似于α2-纤溶酶抑制剂	IPI00370309	0	U型	0.65	6	3.58
第91页	Wdr91、Wdr91蛋白	IPI00373314	0	U型	不适用	4	7.62

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最近研究表明，大多数已知溶酶体基因表现出由转录因子TFEB调节的协调转录行为，我们将Lys-734列表与291个在HeLa细胞中TFEB过度表达后上调的基因列表进行了比较(50). 这一比较指出了38种常见的蛋白质，其中30种是EL-annotated蛋白，1种是第81周基因具有未知的注释定位。

从蛋白质数据库或文献中提取，并对已知或预测的功能注释进行分析，结果表明所有定义的功能过程都在Lys-734列表中表示，尽管只有两个“多肽运输”注释的蛋白质仍然存在(图5B类). 离子和小分子的转运子、通道和泵代表了最丰富的功能类别，尽管其蛋白质数量排名第三。代谢相关蛋白数量最多，但丰度排名第二(补充表S5e). 对于没有亚细胞注释的94个蛋白质，三分之一也没有功能注释；四分之一以上是各种代谢酶；其余的分布在“杂项”、“转运蛋白、通道和离子泵”以及“受体和信号传导”类别之间，丰度相当相似(图5A类).

新型假定溶酶体转运体的鉴定

除了扩展目前已知溶酶体蛋白的列表外，我们的兴趣还集中在发现潜在的新型溶酶体转运体。由于转运蛋白显示多个跨膜域(35)，我们过滤了Lys-734列表中的多面体蛋白。在136 MbL+富集的多面体蛋白中，10%(n个=11）没有属性函数且超过一半(n个= 72; 67.5%的Lys-734 IMPs丰度属于转运蛋白、通道和离子泵类。该蛋白质组包含许多ATP酶亚基（v-ATP酶(n个= 6); P-ATP酶(n个= 5)),A类TP（转移定价）-b条编结c（c）资产（ABC）运输公司(n个=9），通道(n个=10）和次级活性转运体(n个= 42). 后者包括最近发现的潜在或有效溶酶体转运体C2ORF18(21,51)、DIRC2(27)、LMBD1(52)和MFSD8(53) (图6). 在我们手稿的修订过程中，确定了ABC转运蛋白ABCD4的溶酶体定位(29)，我们在另一项研究中显示了PQLC2蛋白的溶酶体定位和转运功能(36).

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图6。

溶酶体运输。所有已知和潜在的转运体或通道都被选择性富集在MbL+中。这些蛋白质至少显示两个跨膜结构域，它们要么属于功能类“转运蛋白、通道和离子泵”，要么没有功能注释。它们根据功能注释和亚细胞注释进行分类。不同类别的运输工具用不同的颜色表示（ABC运输工具，绿色; MFS运输车，粉红色; SLC家族成员，紫色; ATP酶，深蓝色; V-ATP酶亚单位，浅蓝色; 频道，棕色的; 杂项，黑色). 经过验证的候选人在黑体.

去除已经被注释为内溶酶体的转运蛋白后，产生了一组46个新的潜在溶酶体转运蛋白，其中包括27个质膜蛋白和12个未知定位的蛋白(表二). 据我们所知，在这46种蛋白质中，有9种（ABCA6、C7ORF23、C9ORF91、CACFD1、SLC26A1、SLC38A7、SLC40A1、SLC46A3和TMEM50b）尚未在哺乳动物溶酶体、吞噬体或溶酶体相关细胞器的蛋白质组学分析中得到鉴定(14–17,19,54–61).

表二

潜在新型溶酶体转运体列表

显示了具有两个或多个TM、未知功能或具有属性传输功能的候选。定位如下：内质网、高尔基体、内质网；EL，内溶体；杂项；PM，质膜；U、 未知。其功能如下：T、转运体、通道和离子泵；U、 未知；TM，跨膜结构域数量；SpI，光谱指数；NA，不适用（仅在MbL+中识别的蛋白质）。在此过程中显示了MFSD1的溶酶体定位(66).

基因名称	描述	加入编号。	TM（TM）	本地化	功能	SpI公司	肽的数量	新闻报道
阿布卡6	Abca6，类似于ATP结合盒，A亚家族（ABC1），成员6	IPI00762951	13	U型	吨	0.76	6	4.61
阿布卡8a	Abca8a，类似于ATP结合盒，亚家族A（ABC1），成员8a	电话：00763783	11	颗粒物	吨	不适用	4	1.18
抗体11	Abcb11，胆盐出口泵	IPI00195615	9	颗粒物	吨	0.90	15	14.76
抗体10	Abcc10，ATP结合盒，C亚家族（CFTR/MRP），成员10	IPI00371742	14	颗粒物	吨	0.84	15	10.85
抗体2	Abcc2，泪小管多特异性有机阴离子转运蛋白1	IPI00205806	14	颗粒物	吨	0.94	28	24.08
抗体6	Abcc6，多药耐药相关蛋白6	IPI00207513号	12	颗粒物	吨	0.97	17	17.58
安克	进行性强直蛋白同源物	IPI00765376	8	颗粒物	吨	不适用	2	6.63
附件11c-ps1	128-kDa蛋白质	电话：00370178	8	U型	吨	0.63	25	27.32
第2b1页	Atp2b1，质膜钙转运ATP酶1的亚型D	IPI00231268号	7	颗粒物	吨	不适用	5	4.26
附件8a1	Atp8a1，类似于ATP酶，氨基磷脂转运蛋白（APLT），I类，8A型，成员1	IPI00952342	8	颗粒物	吨	不适用	10	9.08
C7或23	RGD1562351，假设蛋白质LOC499990	IPI00565669	三	MPN（最大功率）	U型	0.60	4	23.73
C9或91	RGD1304595，假设蛋白质LOC298104	IPI00357901号	2	U型	U型	不适用	7	22.51
缓存1	RGD1311501，假设蛋白质LOC296599	IPI00363948号	三	U型	吨	不适用	2	14.62
Gjb1号机组	Gjb1，缝隙连接β-1蛋白	IPI00207191号	4	颗粒物	吨	不适用	4	15.19
Mfsd1型	Mfsd1，类似于包含1的主要促进者超家族域	IPI00373212号	11	U型	吨	不适用	6	18.75
Myadm公司	Myadm，骨髓相关分化标志物	IPI00339007系列	8	U型	U型	0.76	2	8.49
第2rx4页	P2rx4，P2X嘌呤受体4	IPI00324987号	2	颗粒物	吨	0.87	13	38.4
Sidt2公司	Sidt2，SID1跨膜家族，成员2	电话：00369576	9	EL公司	U型	0.82	4	6.23
Slc12a9系列	Slc12a9，溶质载体家族12成员9	IPI00198772	11	颗粒物	吨	不适用	6	9.85
Slc22a1系列	Slc22a1，溶质载体家族22成员1的亚型1	IPI00213324	10	颗粒物	吨	0.77	6	15.81
Slc22a7系列	Slc22a7，溶质载体家族22成员7	IPI00203971	11	颗粒物	吨	0.83	12	25.23
Slc24a6系列	Slc24a6，钠/钾/钙交换器6	IPI00464527号	12	颗粒物	吨	0.92	5	12.27
第26a1页	Slc26a1，硫酸盐阴离子转运蛋白1	IPI00207298	9	颗粒物	吨	0.74	10	25.6
Slc31a1系列	Slc31a1，高亲和力铜摄取蛋白1	IPI00231403	三	颗粒物	吨	0.79	5	16.58
Slc37a2系列	Slc37a2，类似于溶质载体家族37（3-磷酸甘油转运蛋白），成员2	IPI00569704	12	急诊室	吨	0.98	5	16.4
Slc38a4系列	Slc38a4，钠偶联中性氨基酸转运蛋白4	电话：00189469	11	颗粒物	吨	0.95	7	14.63
Slc38a7系列	Slc38a7，推测的钠偶联中性氨基酸转运蛋白7	IPI00421684号	11	U型	吨	不适用	7	10.8
Slc39a1系列	Slc39a1，类似于锌转运蛋白ZIP1	IPI00373235型	6	颗粒物	吨	0.96	6	19.75
Slc40a1系列	Slc40a1，溶质载体家族40成员1	IPI00326002	10	颗粒物	吨	不适用	2	5.61
Slc46a3系列	Slc46a3，溶质载体家族46成员3	IPI00364398号	11	U型	吨	不适用	2	5.86
Slc4a1系列	Slc4a1，溶质载体家族4，成员1	IPI00231379	10	颗粒物	吨	不适用	6	8.41
Slc7a2系列	Slc7a2，阳离子氨基酸转运蛋白-2	电话：00608159	16	颗粒物	吨	0.92	9	14.63
Slc7a2系列	Slc7a2，阳离子氨基酸转运蛋白-2A	IPI00206144	14	颗粒物	吨	0.95	6	8.98
Slco1b2公司	Slco1b2，溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员1B2的亚型1	IPI00215390	11	颗粒物	吨	0.73	14	27.91
Slco2a1号机组	Slco2a1，溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员2A1	IPI00231272号	11	颗粒物	吨	0.76	三	5.13
Slco2b1公司	Slco2b1，溶质载体有机阴离子转运蛋白家族成员2B1	IPI00230858型	12	U型	吨	0.75	三	5.56
同步器2	Syngr2，联会蛋白2	IPI00200093	4	颗粒物	U型	0.72	2	4.7
Sypl1公司	Sypl，突触素样蛋白	IPI00471762号	三	其他	U型	0.95	4	20.16
Tmem104型	Tmem104类似于CG5262-PA	IPI00778760	11	U型	吨	不适用	6	11.29
T内存144	Tmem144，跨膜蛋白144	IPI00373219	10	U型	U型	0.95	5	23.85
Tmem175型	Tmem175，跨膜蛋白175	IPI00211068	9	U型	U型	不适用	5	18.44
Tmem192型	Tmem192，跨膜蛋白192	电话：00364640	4	EL公司	U型	不适用	4	12.78
Tmem50b型	Tmem50b，跨膜蛋白50B	IPI00373040型	4	急诊室	U型	不适用	2	12.03
Tmem63a公司	Tmem63a，类似于跨膜蛋白63a	IPI00363369	11	EL公司	U型	不适用	4	5.1
Ttyh2型	Ttyh2，类似于tweety 2	IPI00763162	6	颗粒物	吨	不适用	5	4.81
Ttyh3型	Ttyh3，tweety同源物3	IPI00363776	5	颗粒物	吨	不适用	4	7.44
UST4r公司	UST4r，推测的完整膜转运蛋白	IPI00202688	7	U型	吨	0.89	6	10.33

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选定候选人的验证

选择12个候选基因，LOH12CR1、STARD10、PTTG1IP、MFSD1、SLC37A2、SLC38A7、SLC46A3、SLCO2B1、TMEM104、TMEM175、TTYH2和TTYH3，独立验证蛋白质组数据。允许识别的肽在补充表S6.LOH12CR1和STARD10是推测的细胞溶质蛋白。PTTG1IP预计是一种完整的膜蛋白，在细胞贩运中发挥作用。它的亚细胞定位尚不清楚，因为一些作者已在胞浆和细胞核中观察到它(62)以及其他人在晚期内体中(63). 所有其他候选蛋白都是多跨膜蛋白。TMEM175与功能已知的蛋白质没有同源性，关于其功能也没有其他线索。TTYH2和TTYH3可能代表大电导阴离子通道(64). 其余的候选者是来自不同运输家庭的孤儿。

SLC46A3（SoLute Carrier家族46成员3）、SLC37A2（SoLuteCarrier 37家族成员2）和MFSD1（Major Facilitor Superfamily Domain-containing protein 1）属于次级转运蛋白Major Accilitor Super家族中的远亲(65). MFSD1，之前已在溶酶体和吞噬体的蛋白质组学分析中确定(14,16,19,54,59,60)，对转录因子TFEB有反应，被认为是一种有前途的溶酶体蛋白候选物(16,50). 在我们的研究过程中，其溶酶体定位已被独立确认(66). SLC37A2介导蛋白质脂质体中的糖磷酸/磷酸和磷酸/磷酸交换(67).

SLC38A7（SoLute载体家族38成员7）属于氨基酸/多胺/有机阳离子超家族(68). 据报道，在本研究过程中，它在质膜上运输中性和阳离子氨基酸(69)，但信噪比低得令人惊讶，这表明SLC38A7的实际作用值得进一步研究。SLCO2B1/SLC21A9/OATP2B1是一种在酸性pH条件下受到刺激的有机阴离子转运蛋白(70). TMEM104是氨基酸和生长素渗透酶转运蛋白家族的孤儿成员。

这些候选蛋白在HeLa细胞中瞬时表达为GFP或YFP融合蛋白，并将其细胞内分布与溶酶体/晚期内体标记物LAMP1进行比较。有趣的是，只有三个候选基因没有与LAMP1重叠，而是定位在质膜（STARD10和SLCO2B1）或LAMP1-阴性点状体（LOH12CR1；数据未显示）。相比之下，其他9名候选人的分布与LAMP1广泛重叠(图7)从而确认它们存在于溶酶体中，并验证Lys-734列表的预测值。

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图7。

候选细胞在HeLa细胞中的亚细胞定位。固定瞬时表达GFP或YFP标记候选细胞的HeLa细胞，用针对LAMP1的抗体进行免疫染色，LAMP1是一种晚期内体和溶酶体标记物，并在反褶积后通过表观荧光成像。荧光蛋白相关荧光、LAMP1免疫染色和合并图像显示于从左到右。插图是平方面积的×3倍。比例尺，20微米。

讨论

基于亚细胞分馏的溶酶体导向蛋白质组学研究的主要关注点是，由于其他细胞器的共分馏，确定真正溶酶体居民(37,71). 因此，鉴定候选溶酶体需要比较溶酶体富集和非富集部分。卡拉汉及其同事进行的一项先驱研究(15)目的是从Triton WR1339密度移位溶酶体（也称为三小体）中鉴定溶酶体膜蛋白。然而，由于缺乏比较方法，本研究中确定的几种蛋白质的实际溶酶体居住地无法确定。后来，一项对胎盘溶酶体蛋白的研究利用了连续制备步骤之间的比较，并使用半定量无标记光谱计数方法选择了86个候选溶酶体(16). 最近，Lobel和同事(19)证明了将Triton WR-1339注射液诱导的大鼠选择性溶酶体密度偏移与等压肽标记MS定量相结合的潜力，以便同时鉴定和验证候选溶酶体。在这项工作中，我们比较了通过差速离心和等密度梯度离心从大鼠肝脏中获得的溶酶体富集和非富集组分，然后通过洗涤剂或有机溶剂萃取步骤在MS分析之前降低样品复杂性。我们基于光谱计数的分析为我们提供了2385个蛋白质的广泛列表（MbL2385列表），包括32%的IMP。在这些蛋白质中，734被选为溶酶体部分显著富集的蛋白质（Lys-734列表）。

据我们所知，MbL2385列表是迄今为止针对溶酶体发布的最广泛的列表(15–17,19,72)，吞噬体(54–56,59,60,73,74)或溶酶体相关细胞器(57,58,75–78). 如果不进行特定的亚分馏处理，其IMP含量（32%）远高于通常获得的含量（5–15%IMP(34))，但它与同样使用有机溶剂处理的胎盘溶酶体膜的研究结果非常相似(16). 由于我们的制备方案，我们总共鉴定了IMP和膜相关蛋白，但也鉴定了可溶性蛋白，如腔溶酶体水解酶。事实上，溶酶体膜的离心作用导致聚集的内含物从溶酶体基质中沉淀，从而导致可溶性溶酶体酶和蛋白质的存在被降解(30). 此外，可溶性蛋白质也可能被包埋在低渗溶解和随后细胞器重新密封产生的膜碎片中。Lys-734列表也比其他比较蛋白质组研究中的列表长（参考文献124中的蛋白质。16和76参考文献中。19). 然而，这些数据集的比较表明，69个和51个蛋白质的重叠相当重要。

由于在Lys-734列表中回收了约80%的EL-annotated蛋白，但只有3.2%的污染蛋白，我们的半定量方法能够将内溶体蛋白与已识别的污染细胞器（如线粒体或内质网）的蛋白强烈区分开来。然而，被注释为非内溶酶体的蛋白质的存在，除了假阳性保留的可能性之外，还对其选择的重要性提出了疑问。此外，在EL蛋白本身中，溶酶体蛋白与其他内吞小室（早期或晚期内吞小体）的蛋白没有区别。

注释到溶酶体以外的其他腔室的蛋白质的存在可能代表具有多个亚细胞位置的真正溶酶体居住地，溶酶体居住地要么是主要的，要么是次要的。事实上，由于我们的数据仅限于从等密度梯度发布的部分，我们不知道对给定蛋白质观察到的“类溶酶体”行为是代表整个蛋白质细胞池还是局限于一个小的特定子集。例如，TGN标记物TGN38从L组分中耗尽，并在差速离心后主要在PS组分中回收(图2). 然而，在差速离心过程中与溶酶体共分离的少数TGN38蛋白在随后的Nycodenz梯度离心后集中在MbL+组分中(图2). Lys-734列表中保留了数量惊人的PM蛋白（56%）。之前已经讨论过溶酶体富集部分中存在PM(37); 结果表明，在L组分（～5%）中回收的少量PM蛋白表现出类似于米氮酰胺梯度上的溶酶体的行为，无论是作为真正的PM居民还是作为溶酶体蛋白。PM蛋白在PM和溶酶体之间的迁移是可以想象的。事实上，内吞途径构成了这两个隔间之间的联系，因为在该途径的各种实体（PM、内吞囊泡、早期和晚期内体以及溶酶体）之间发生了许多融合/裂变事件。此外，已知溶酶体在特定情况下与PM直接融合(三). 通过观察溶酶体细胞质表面的5′-核苷酸酶活性，提出了这种双重定位(37). 该蛋白被视为PM标记，在Lys-734列表中显著存在。

候选者的非EL注释也可能过于严格。例如，许多被注释为细胞质或属于细胞骨架的蛋白质实际上可能与内溶体有关，它们是膜运输机制的组成部分，允许溶酶体和其他细胞器之间的膜交换，或者属于内溶体在细胞内沿其移动的微管(79,80). 最后，如果不是真正的溶酶体居民，候选蛋白可能通过内吞或自噬作用靶向溶酶体降解。例如，许多PM酪氨酸激酶受体，如EGF受体，通过这个过程下调(81). 然而，在我们的工作中，只有少数这种类型的受体，包括EGF受体，被鉴定出来。

Lys-734清单中的众多结构物中的接近完工标识强调了我们方法的稳健性和敏感性(即液泡ATP酶）或功能性(即γ-分泌酶、运输和营养敏感机械）复合物，已知作用于晚期内胚体和溶酶体膜（详见图8). 在先前的溶酶体蛋白质组学研究中已经确定了这些复合物的许多亚单位(15–17,19,72)，吞噬体(54–56,59,60,73,74)或溶酶体相关细胞器(57,58,75–78). 然而，这些复合物通常没有像这项工作中那样被广泛记录。下面将讨论几个具体点。

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图8。

选定溶酶体相关过程的已识别作用体的示意图。内溶体示意图是用选定溶酶体相关过程中涉及的已识别蛋白质的名称绘制的。此处不考虑跨膜转运。成熟的复合体表示在灰色背景。无论是否在本研究中确定，均显示了其所有描述的成分。Rab7蛋白显示在各种复合物附近，这些复合物需要Rab7相互作用才能与溶酶体内膜结合。黑色，选择的蛋白质；黑色斜体，至少有五种光谱鉴定但未选定的蛋白质；灰色斜体，蛋白质既没有鉴定也没有选择。

蛋白酶体除了作为细胞溶质蛋白水解酶机器的主要作用外，还需要将受体内吞运输和分类到多泡体的内膜(82,83)通过Rab7和蛋白酶体α亚单位PMSA7之间的特定相互作用(84). 因此，许多亚单位(n个=28）的蛋白酶体出现在Lys-734列表中。在之前的一项研究中，在胎盘溶酶体膜中发现了24个蛋白酶体亚单位，尽管不被认为是溶酶体候选亚单位(16). 在吞噬体的蛋白质组研究中，蛋白酶体亚单位也被鉴定出来，尽管程度较低(54)，溶酶体相关细胞器(57)，或拟南芥液泡。^三

溶酶体的生物发生和向这些细胞器输送内吞物质涉及内吞途径和分泌途径的隔室之间的大量和高度动态的膜融合和裂变事件，从而允许蛋白质输入溶酶体或从溶酶体中提取(三,85). 参与这些过程的所有复合物都存在于Lys-734列表中(图8). 鉴于ESCRT-III的众多组件(E类内体S公司运动C类复合体R（右）需要用于吨转运III）复合物，介导新形成的腔内小泡脱落(86)，则未鉴定出ESCRT-0、-I或-II复合物的任何成分。这已经是我们最近对细胞内吞途径的蛋白质组分析中的情况盘状网柄菌(87)或在液泡膜上进行的研究中拟南芥.^三ESCRT-III与内溶酶体膜明显“紧密”结合的起源（相反，在吞噬体中检测到ESCRT-0和-I(54))值得进一步调查。至于晚期内体和溶酶体之间的同型或异型融合过程，这意味着HOPS介导的初始栓系步骤(呵异型融合和液泡第页蛋白质秒运动）综合体(88). 非常相似的是，早期内体同型融合中的栓系是由CORVET（类C类 cor公司e（电子）v（v）针孔-e（电子）多柔体t吨转运）复合体，与HOPS共享四个亚单位(89). 有趣的是，所有HOPS成分都出现在Lys-734列表中，尽管没有检测到任何特定的CORVET亚单位。这与在酵母液泡膜的蛋白质组学研究中观察到的相似(90).

与内体相似(91)溶酶体现在正在成为一种信号平台，能够检测细胞环境的变化，如能量、生长因子和营养水平(92). 因此，许多信号传导过程的因子在MbL+部分中富集，如受体、异源三聚体G蛋白的α亚基、蛋白激酶和一些Ras相关蛋白。由于这些信号蛋白中有一半是PM-annotated，因此到目前为止，它们额外的内吞定位可能被忽略。营养素传感中的一个关键信号通路涉及主细胞生长调节剂mTOR，它控制自噬以响应广泛的信号，包括氨基酸可用性(93). 最近的研究表明，溶酶体充当传感装置“营养素”的组装位置，该传感装置由RagA/B-RagC/D异二聚体、Ragulator和mTORC1复合物、Rheb GTPase和V-ATPase组成(92,94). 该途径的大多数蛋白质都存在于Lys-734列表中(图8).

补充材料

致谢

脚注

参考文献