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细胞组织研究。作者手稿；PMC 2013年6月6日提供。
以最终编辑形式发布为：
《细胞组织研究》，2012年8月；349(2): 483–491.
2012年5月25日在线发布。 数字对象标识：2007年10月10日/00441-012-1434-4
预防性维修识别码：PMC3674513
NIHMSID公司：尼姆斯456112
PMID：22628160

斑马鱼Cajal间质细胞的超微结构鉴定达尼奥雷里奥

埃文·鲍尔,Miho M.Matsuda先生,路易斯·戴伊,维多利亚·霍夫曼,帕特里夏·M·泽法斯,伊娃·萨雷克,亚当·里奇,Ajay B.Chitnis公司、和君士坦丁·A·斯特拉塔基斯
作者信息 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充材料

摘要

Cajal间质细胞（ICCs）作为胃肠道起搏器，是胃肠动力的重要介质。除了功能外，ICC也是结构不同的细胞，最容易通过其超微结构特征和酪氨酸激酶受体c-KIT的表达来识别。已在哺乳动物、啮齿动物、鸟类、爬行动物和两栖动物中描述了ICC，但还没有关于硬骨类谱系生物胃肠道内ICC超微结构水平的报告。我们描述了细胞在肌层斑马鱼肠道；这些细胞与其他脊椎动物的ICC具有相似的特征。类ICC细胞与肌层，比周围的平滑肌细胞电子密度更高，具有长的细胞质突起和线粒体，并且位于与肠神经结构相对的位置。此外，针对假定的ICC标记c-KIT（kita）的斑马鱼直系同源物的抗体的免疫荧光和免疫电镜研究显示，c-KIT在斑马鱼ICCs中具有免疫反应性。综上所述，这些数据代表了肌层斑马鱼的达尼奥雷里奥并表明脊椎动物进化中的ICC分化可追溯到硬骨骨谱系。

关键词：Cajal间质细胞（ICC），C-kit，胃肠动力，超微结构，斑马鱼，达尼奥·雷里奥（Telestei）

介绍

胃肠运动的协调是一个动态过程，涉及来自所有三个胚胎胚层的细胞：外胚层、中胚层和内胚层。尽管不同物种之间的特定信号不同，但与胃肠（GI）运动相关的整体细胞类型、可溶性因子和解剖结构在许多脊椎动物中都是保守的。肠道神经系统除了刺激或抑制有助于食物分解的局部胃酶的分泌外，还调节进食和禁食状态下平滑肌细胞的收缩和松弛(Huizinga 1999年). 经口收缩介导的食物内容物通过胃肠道或蠕动的传播，是由肠道平滑肌细胞的收缩和松弛以机械方式介导的。胃肠道的自发收缩被认为是由一种异质的间质细胞群（称为Cajal间质细胞，ICC；Faussone-Pellegrini和Thuneberg，1999年).

ICC被认为是胃肠道的起搏细胞；它们传播有节奏的慢波并介导神经传递(Iino和Horiguchi 2006). 100多年前，Ramón y Cajal通过亚甲基蓝染色首次描述了ICCs，最初被认为是自主神经系统的一部分(Min和Leabu 2006); 然而，ICC的现代描述依赖于电子显微镜和ICC标记物的免疫标记，如酪氨酸激酶受体c-KIT。由于ICC无法发育或在c-KIT被敲除或删除时显著减少，ICC被认为在发育上依赖于c-KIT信号，很可能是通过c-KIT介导的平滑肌前体细胞ICC的谱系规范(Klüppel等人，1998年). ICC的分子和发育研究通常使用c-KIT和其他ICC标记，如TMEM16A，来识别这些细胞(Chen等人，2007年). 尽管ICC可以根据其在内外平滑肌层内的分布或与肌间神经丛的联系进行亚分类，但大多数ICC具有与周围平滑肌细胞不同的共同超微结构特征。与肠平滑肌细胞相比，肠间充质干细胞的形态更为星状、细长，核质比相对较高，有丰富的滑面内质网和线粒体，表面有小凹(高村2006).

迄今为止，已通过透射电子显微镜（TEM）对多种脊椎动物ICC的超微结构特征进行了表征(Komuro等人，1999年)从两栖动物的进化史来看(宫本纪和高村2007). 尽管Rich等人（2007）我们已经证明斑马鱼肠道中存在kit样免疫反应，据我们所知，没有任何研究进一步描述斑马鱼或硬骨鱼类任何其他后代中ICC的特征。本研究的目的是在超微结构水平上表征斑马鱼中kit阳性ICCs的存在达尼奥雷里奥.

材料和方法

为了进行电子显微镜（EM）的固定，成年斑马鱼被三辛安乐死，组织被固定在4%多聚甲醛（PFA）/2.5%戊二醛的碳酸钠缓冲液（pH7.4）中。为了避免肠道的机械拉伸和超微结构的破坏，将肠道从一条部分解剖的鱼中分离出来，该鱼之前是用20毫升固定剂固定的。通过解剖肠道周围的皮肤、脂肪和肌肉，暴露胃肠道，而不切除肠道。将鱼固定在4°C的4%PFA/2.5%戊二醛溶液中过夜，轻轻摇晃。然后将肠切开，并将其置于1ml新鲜固定剂中再放置一小时。在制备EM之前，将样品储存在碳酸钠缓冲液中。斑马鱼是一种“无胃”鱼，肠道各段轮廓模糊。在这项研究中，我们将重点放在了肠道的中部（见下文）。

对于免疫电子显微镜（immuno-EM）的研究，PFA固定采用相同的方案以提高抗体敏感性。固定后，用磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗肠道，并将其嵌入PBS中2%的琼脂糖中。在4°C下切割振动切片（100μm）（Ted Pella-Pelco 100振动切片系统）。

切片在PBS中冲洗，在室温下用0.1%Triton在PBS内渗透8分钟，在抗体缓冲液（4%正常山羊血清和0.1%Trito在PBS）中的c-Kit一级抗体（ab16832）中在摇杆上4°c孵育过夜，并在抗体缓冲溶液中洗涤两次（每次7分钟）。接下来，将切片在抗体缓冲液中与Alexa 488（抗兔）偶联的纳米荧光金二级抗体中在摇杆上4°C孵育过夜，在抗体缓冲溶液中清洗10分钟，然后在PBS中清洗四次（每次7分钟），并在双蒸馏水（DDW；每次5分钟）中冲洗五次，然后进行银强化，在暗室条件下，室温下冲洗7分钟。随后，在DDW中彻底冲洗切片10分钟，然后在0.1 M磷酸盐缓冲液中冲洗两次（每次5分钟）。在室温下，将切片在0.1M磷酸盐缓冲液中的0.2%四氧化锇中固定1小时，并在0.1M磷酸缓冲液中清洗三次（每次5分钟），然后在冷的0.1M醋酸盐缓冲液中冲洗三次（每个5分钟）。将0.25%乙酸铀酰放入0.1 M醋酸盐缓冲液中，在4°C下保持1 h，包括一个en-bloc步骤。在此步骤之后，将切片在冷的0.1 M醋酸盐缓冲液中冲洗三次（每次5分钟）。

在可变功率的Pelco BioWave Pro微波炉（美国加利福尼亚州雷丁市Ted Pella）中，将切片在冷的0.1 M醋酸盐缓冲液中清洗后，使用以下方案完成包埋：乙醇脱水系列（50%、70%、90%、100%）、Embed-812树脂/乙醇渗透系列（1:1、2:1）、，然后100%树脂渗透。将切片嵌入100%树脂中，并在60°C的实验室烘箱中聚合16小时。在Reichert-Jung Ultracut-E超薄切片机（50 nm厚）上切割薄片，并收集在LuxFilm网格（Ted Pella）上，薄膜厚度为30 nm。用醋酸铀酰和柠檬酸铅对格栅进行后染色，并在80 kV操作的JEOL 1010（日本东京JEOL）透射电子显微镜中进行检查。

仅使用第二抗体的阴性对照（减去第一抗体）与实验部分平行进行。

为了进行共焦显微镜成像，将成年斑马鱼的肠道解剖出来，包埋在OCT化合物中，并直接冷冻在液氮中。切片（10μm厚）在冷冻刀上切割，安装在带电载玻片上，并在冰镇甲醇中固定20分钟，然后在冰镇丙酮中固定1分钟。用PBS冲洗切片，然后用0.2%Triton X-100溶液渗透1分钟，然后在由10%正常山羊血清和1%二甲基亚砜组成的封闭溶液中培养1小时，在1×PBS中培养1 h。用初级抗体、c-kit（abcam:100）和乙酰化微管蛋白（Invitrogen:1400）培养在RT下进行1小时，然后在PBS中进行两次5分钟的洗涤。在RT下的暗室中用二级抗体（Invitrogen）和核抗血清（Hoechst）培养1小时，随后在PBS内进行两次五分钟洗涤。为了进行比较，斑马鱼胚胎用共焦显微镜进行染色和成像，以确定包括肠道在内的发育组织中的kit阳性细胞。此外，用与斑马鱼相同的方案为标准EM制备成年小鼠的肠道样品，并对其进行成像，作为ICC形态学的比较指南。如前所述，使用蔡司共焦显微镜进行胚胎染色、样品安装和图像准备(Matsuda和Chitnis 2010).

结果

斑马鱼的肠道由一层外纵肌层和一层内环肌层组成，它们通过一层薄薄的结缔组织或粘膜下层与上皮组织的褶皱相连(图1). 这个肌层由肠神经网络支配，包括神经束、含有颗粒和无颗粒小泡的轴突突起以及与平滑肌细胞相关的轴突扩张（或静脉曲张）(图2). 虽然数量稀少，但类似于其他脊椎动物肌间神经丛的结构位于内外肌层之间。肠神经元有大的细胞核，通常有可见的核仁和电子透明的细胞质（数据未显示）。

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斑马鱼肠道的超微结构。显示外纵肌的纵断面(LM公司)层和内环平滑肌(厘米)薄层，粘膜下层(性虐待)层和上皮粘膜细胞。酒吧2微米

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突触小泡和神经束支配肌层.一神经束(N个)在中找到肌层含有许多大颗粒小泡。小静脉曲张(V（V）)也位于纵行平滑肌和环行平滑肌。b条胶质细胞(G公司)包裹神经束(N个)与Cajal（ICC）样细胞的间质细胞相对，其细胞质稀少，线粒体突出(米).c（c）含有带有大颗粒小泡的轴突的神经束(箭头)大颗粒囊泡和小颗粒囊泡的混合物(长箭头).酒吧1微米

肠平滑肌细胞的超微结构特征类似于与其他脊椎动物相似的类肌细胞，既有细丝也有粗丝。斑马鱼的ICCs是通过先前在其他生物体中报道的超微结构特征鉴定的，并与成年小鼠中鉴定的ICCs进行了比较(图3). ICC的特征包括具有丰富线粒体、粗面内质网和相对少量电子致密细胞质的长星状外观(图4). ICC也被发现与含有无颗粒小泡的神经束有关，可能释放胆碱能介质(图5). 在其他脊椎动物中描述的一些ICC特征在斑马鱼中没有发现，包括钉状和插座状连接、间隙连接和表面小窝。观察到可能的缝隙连接，但超微结构始终不够清晰，无法将其与ICC自信地联系起来。表面小凹在ICC或平滑肌细胞中不显著，但在内皮细胞中发现（数据未显示）。

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斑马鱼的形态比较(一)和鼠标(b条)国际商会(星星).酒吧5微米(一)，2微米(b条)

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斑马鱼ICC的超微结构特征。一与内环平滑肌层相关的ICC(厘米)和束状神经结构(（f）).插入线粒体的高倍镜观察(米).b条细胞质延伸的高倍放大(星星ICC）。酒吧2微米(一和b条)，500纳米(b条,插入在里面一)

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位于内外肌层之间的斑马鱼ICC的超微结构特征，其细胞质突起似乎包含束状神经结构(F类).酒吧500纳米

与小鼠和人类相比，在苏木精和伊红染色的切片上用常规光学显微镜鉴定斑马鱼独特的肌间神经节是困难的，可能是因为斑马鱼体型较小。然而，共焦显微镜下乙酰化微管蛋白抗体免疫染色显示，丰富的神经网络支配肌层用c-KIT抗体标记的细胞（称为“KIT-阳性细胞”）存在于肌层可能与肠道神经系统有关(图6a-c). Kit阳性细胞呈星状，与平滑肌细胞相比，核质比相对较高，在成体和幼虫期都可见(图6d-k;补充电影1,2). 斑马鱼胚胎肠道中kit的表达程度与kit正常表达的其他细胞（包括神经肥大细胞）的表达程度相当(图6l)和黑素细胞(图6m).

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成年斑马鱼和发育中斑马鱼kit阳性细胞的共焦成像。一成年斑马鱼中肠的纵切面，显示肠腔上皮层的对侧(概述在里面灰色). 在这个略成角度的横截面中，外纵肌层(奥尔姆)和内环肌(国际货币基金组织)层面在横截面的顶部清晰可见，但在另一侧不完整（肌肉层边界为概述在里面红色). 这个虚线框放大了b、 c（c）显示试剂盒染色(绿色)在外层肌肉层(箭头)与乙酰化微管蛋白染色相关(白色)神经结构(箭头).d日在成人肠道的单独横切面上，kit阳性细胞都靠近粘膜下层/粘膜层(箭头)并且在肌层(箭头).e–g胚胎发育期间（受精后7天）斑马鱼肠道整体投影的低倍和高倍放大图显示kit阳性细胞(绿色在里面e（电子）)乙酰化微管蛋白染色显示肠道神经系统网络发育良好(红色在里面（f），合并于克). 这个带圆圈的虚线区域如所示e（电子）放大并显示在中的不同切片小时–小时肠中kit阳性细胞的强度与发育期间正常表达kit的其他细胞（包括神经肥大细胞）中kit染色的强度相似(我)和黑素细胞(米).酒吧20微米(a–d，h–m)，10微米(e–g)

免疫电镜和共聚焦显微镜研究表明，kit阳性细胞与透射电镜和共焦点显微镜观察到的ICC在解剖位置、相对密度和近似形态方面相关。通过免疫电镜，kit阳性细胞被鉴定为在给定细胞的至少四个位置表达银增强纳米金颗粒的细胞，每个细胞至少有八个颗粒。这些kit阳性细胞具有长的细胞质突起和线粒体，并且大多位于两个肌层之间(图7)或跨越环形肌层(图8). 与透射电镜相比，免疫电镜的局限性在于线粒体等细胞器精细超微结构特征的完整性受损，线粒体在免疫电镜下的形态不太明显(图7)因为为免疫电镜准备的组织只固定在PFA中，而这种精细特征只在同样用戊二醛固定的样品中观察到(图4，插图）。

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免疫电镜显示kit阳性细胞与肌层kit阳性ICC与外纵平滑肌层相关(箭头银增强纳米金颗粒，米线粒体，LM公司纵向平滑肌，明星国际商会）。酒吧500纳米

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免疫电镜显示kit阳性细胞与肌层Kit-阳性ICC与圆形平滑肌和粘膜下层之间的边界相关（银增强纳米金颗粒箭头(厘米环状平滑肌，LM公司纵向平滑肌，明星国际商会）。酒吧(实线)2微米(虚线)500纳米

讨论

本研究的目的是表征斑马鱼ICCs的超微结构特性斑马鱼是硬骨鱼类世系的后代。尽管据报道，ICCs在不同物种中具有不同的结构特征，并发生在整个胃肠道层(Rumessen和Vanderwinden 2003)我们认为，我们观察到的细胞的整体外观和位置提供了斑马鱼中存在ICC的第一个明确证据。尽管仅基于超微结构特征进行ICC鉴定存在局限性，但我们的结论是新颖的，因为它们通过相关的免疫电镜和共聚焦显微镜以及ICC标记物c-kit得到了加强。综上所述，这些数据代表了斑马鱼体内存在ICC的第一个令人信服的数据斑马鱼.

这里观察到的斑马鱼ICC最显著的区别是缺乏丰富的表面小窝和可能更少的线粒体。虽然出乎意料，但至少有三种可能的解释可以解释这些观察结果。首先，斑马鱼肠道的小尺寸可能会影响这些因素，因为ICC的密度似乎相对较低，这使得确定ICC比大动物（如小鼠）更具挑战性。第二，独立于ICC形态的种间变异性，这些差异在一定程度上可归因于固定相关问题，因为即使是最仔细的肠道解剖也会导致固定前组织的拉伸，这可能会影响小窝等细微特征的分辨。最后，这些结构差异可能只是反映了物种之间的差异。在解决这些问题时，我们发现免疫电镜是一种有用的工具，可以确认这些细胞是真正的ICC，尽管物种之间存在差异。

尽管对斑马鱼的研究很少，但之前的研究对斑马鱼类的超微结构进行了检测肌层在其他电视节目中发现了类似于我们在这里描述的特征(Krementz和Chapman 1975)包括与肌间神经丛相关的轴突或含分泌颗粒的静脉曲张，即大颗粒小泡和无颗粒小泡；这些轴突被认为分别是胺能和胆碱能神经元(沃森1981). 也许是因为大多数低等脊椎动物的超微结构研究都是在获得关于ICC特征的公认标准之前进行的，所以很少关注ICC在不同谱系间的进化方式。事实上，一些研究人员一直在努力识别低等脊椎动物中的ICC，但也发现了类似的解剖或功能证据来支持参与肠道运动的ICC的存在。宫本纪和高村（2007）根据两栖动物模型中ICC的形态确定了ICC，非洲爪蟾类肌样细胞，有大量线粒体和表面小窝，常与神经静脉曲张或神经束有关。

虽然通过分析与斑马鱼肠蠕动相关的生理数据超出了本研究的范围，但其他研究人员根据斑马鱼胚胎发育过程中肠蠕动的功能研究，认为斑马鱼具有肠蠕动。ICC被认为是胃肠道的起搏细胞，负责产生“缓慢蠕动波”或自发去极化刺激，其本身不超过阈值(Hennig等人，2010年). 这种波被认为决定了相态收缩的频率(Horowitz等人，1999年). 使用河豚毒素（TTX）减少神经元活动，Holmberg等人（2007）已经证明斑马鱼含有ICC，ICC以起搏器样的方式作为TTX抗性非神经元细胞发挥作用，有助于在斑马鱼胚胎肠道中产生和启动传播波。最近的研究sox10型变异斑马鱼，无色的无法发育肠道神经系统，表明无色的野生型斑马鱼幼虫都具有有效的推进蠕动(Davuluri等人，2010年). ICCs的存在可以解释斑马鱼胚胎肠道神经系统受到遗传或毒物诱导损伤时的蠕动。事实上，我们已经能够在斑马鱼胚胎肠道中发现kit阳性细胞，其时间点与蠕动运动的时间点相似，尽管它们损害了肠道神经系统的发育。

这个配套元件编码酪氨酸激酶受体c-KIT的基因在斑马鱼基因组复制过程中经历了复制，有效地导致了两个配套元件基因：基塔(Parichy等人，1999年)和基特(梅尔格伦和约翰逊2005)它们都与人类同源配套元件(Braasch等人，2006年). c-KIT的内源性配体也被复制以产生基特拉和基特尔布与kitb/kitlb相比，kita和kitla的相互作用在斑马鱼中调节了大量黑素细胞的形成(Hultman等人，2007年). 黑素细胞和ICC在发育上依赖c-KIT(Klüppel等人，1998年)和基因改变配套元件人类已经证明激活配套元件突变导致色素沉着过度，增加了胃肠道间质瘤的易感性(Robson等人，2004年)，一种被认为来自ICC的间叶肿瘤(Kindblom等人，1998年). 考虑到其他表型关联和以往的研究，我们假设斑马鱼中的ICC更可能受kita/kitla相互作用的控制，并且在预期表达kita的其他组织（如黑素细胞）中观察到类似水平的免疫反应(图6m)、神经桅杆(图6l)和肾小管(补充电影2).

有趣的是，斑马鱼稀疏的突变体，包含一个点突变，导致提前终止密码子基塔，是可行的，可以繁殖。相反，小鼠c-kit功能的双等位基因缺失在胚胎上是致命的，主要是因为造血缺陷(Edling和Hallberg，2007年). 尽管黑素细胞数量显著减少，但在稀疏的突变体。斑马鱼的进一步研究基塔吗啉靶向治疗缺陷小工具可能会为斑马鱼的作用提供更多的见解配套元件直系血统在ICC和其他依赖kit的血统的发展中起作用。

硬骨骨谱系中ICC的出现表明，这些是进化保存的细胞，具有重要功能。跨物种ICC细微可变超微结构特征的意义尚不清楚，进一步描述ICC解剖可能有助于更好地了解ICC的功能，包括消化道内ICC的亚型(Garcia-Lopez等人，2009年). 例如，粘膜下丛的ICC位于胃肠道的最远端，在小鼠中，仅在结肠中发现(Vanderwinden等人，2000年). 斑马鱼被认为是“无胃”脊椎动物，在大体和组织学水平上具有更简单的胃肠道解剖结构(Wallace等人，2005年). 尽管斑马鱼胃肠道的解剖结构更简单，但分子和基因表达的分析表明，斑马鱼胃肠道可以细分为类似于其他脊椎动物的区域，斑马鱼的远端表现出与人类结肠相似的表达模式(Wang等人，2010年). 在成年斑马鱼的中肠中，我们已经在内层和外层之间的界面上识别出ICC的亚型肌层和内环肌层和粘膜下层之间的ICC(图9). 尽管这些可能与先前在其他生物体（如小鼠）的这些区域报道的ICC亚型相对应(图3)进一步的研究，也许在其他硬骨鱼类中，应该检查ICC亚型在进化过程中的保存程度。

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斑马鱼肠道的表现。一斑马鱼的消化道是无胃的，分为三个一般解剖区域：最前部或肠球(红色)，中肠(蓝色)以及最远端或尾部区域(绿色). 这个虚线表示本研究的重点胃肠道的主要区域。b条中肠纵切面的表示，描绘了主要的组织学亚区：肌层分为外纵肌(OLM公司)和内环肌层(信息与通信管理)在神经元细胞和ICC之间有一个小空间(红色)一层薄薄的粘膜下层结缔组织，一层粘膜上皮细胞伸入管腔。粘膜下层和外纵肌层之间还发现了其他ICC

斑马鱼在发育研究中是一种有用的工具，最近通过基因操作和正向基因筛选成为肿瘤形成的模型(Merlino和Khanna 2007). 尽管ICC被认为是来源于平滑肌前体的间充质细胞，但神经嵴细胞被认为有助于ICC的发育(Wu等人，2000年). 研究斑马鱼早期胚胎发育的独特能力可能会为长期争论的神经嵴细胞在ICC发育中的作用提供线索。在斑马鱼肠道中表达ICC的试剂盒的超微结构证明进一步证明了斑马鱼是研究影响肠道运动和ICC发育和分化的基因的一种新的有用工具。

补充材料

电影1

单击此处查看。（1.4M，移动）

第2季度末

单击此处查看。（3.1M，移动）

致谢

这项工作的一部分由国家卫生部慷慨资助，包括NIH DK071588-02；其余资金由NIH NICHD的校内项目提供。

脚注

电子辅助材料该文件的在线版本（doi:10.1007/s00441-012-1434-4）包含对授权用户可用的补充。

参与者信息

Evan R.Ball，美国马里兰州贝塞斯达市MSC1103中心大道10号CRC大楼10号楼1-3330室，尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）发育内分泌与遗传学项目内分泌与遗传学科。

Miho M.Matsuda，美国马里兰州贝塞斯达NICHD神经发育动力学部分子遗传学实验室，邮编20892。

路易斯·戴伊，美国马里兰州贝塞斯达国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）显微镜和成像中心，邮编：20892。

维多利亚·霍夫曼，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院兽医资源部研究服务办公室，邮编：20892。

Patricia M.Zerfas，美国马里兰州贝塞斯达国立卫生研究院兽医资源司研究服务办公室，邮编：20892。

伊娃·萨雷克，美国马里兰州贝塞斯达市MSC1103中心大道10号CRC大楼10号楼1-3330室，尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）发育内分泌与遗传学项目内分泌与遗传学科。

亚当·里奇，美国纽约州布鲁克波特市纽约州立大学生物科学系，邮编：14420。

Ajay B.Chitnis，分化计划，神经发育动力学部分，NICHD，NIH，Bethesda，MD 20892，美国。

君士坦丁·A·斯特拉塔基斯，美国马里兰州贝塞斯达市MSC1103中心大道10号CRC大楼10号楼1-3330室，尤妮斯·肯尼迪·施莱弗国家儿童健康与人类发展研究所（NICHD）发育内分泌与遗传学项目内分泌与遗传学科。

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