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大脑。2013年6月；136(6): 1830–1845.
2013年5月6日在线发布。 数字对象标识：10.1093/brain/awt092
预防性维修识别码：项目经理3673461
PMID：23649698

过量Notch3导致细胞外基质蛋白异常募集电子海图：CADASIL的一种新的病理机制

玛丽·莫内特·利佩雷,1,2 伊曼·哈达德,三 塞琳·门古伊男爵,1,2 马伊·福伊略特·潘查尔,1,2 梅里姆·利亚尼,1,2 瓦莱里·多明加·德尼尔,1,2 克莱尔·杜索尔,1,2 艾曼纽尔·科纳特,1,2 乔尔·文,三和安妮·朱特尔通讯作者1,2
作者信息 文章注释 版权和许可信息 PMC免责声明

关联数据

补充资料

摘要

伴有皮层下梗死和白质脑病的常染色体显性脑动脉病（CADASIL）是最常见的脑遗传性小血管疾病之一，其特征是血管平滑肌细胞的逐渐丧失和细胞外基质的积聚。这种疾病是由NOTCH3受体（NOTCH3）胞外结构域内的高度定型突变引起的电子海图)这导致了半胱氨酸残基的奇数。而CADASIL相关槽口3突变会不同程度地影响NOTCH3受体的功能和活性，它们都与NOTCH3的早期积累有关电子海图-在小容器中含有聚集体。我们仍然缺乏联系的机械解释槽口3小血管病变的突变。在此，我们假设过量的Notch3电子海图可以在大脑的小血管中招募和隔离功能重要的蛋白质。我们分别使用来自CADASIL患者的脑组织和动脉组织以及在疾病末期和早期出现血管病变的CADASIL小鼠模型，进行了生化、纳米液相色谱-串联质谱和免疫组织化学分析。脑和动脉样本的生化分级证明突变Notch3电子海图在CADASIL小鼠和患者体内积聚在二硫醚交联洗涤剂不溶性聚集体中。进一步的蛋白质组学和免疫组织化学分析确定了两种功能重要的细胞外基质蛋白，金属蛋白酶组织抑制剂3（TIMP3）和玻璃体凝集素（VTN），它们被螯合到Notch3中电子海图-包含骨料。使用培养细胞，我们发现Notch3水平增加或聚集增强了Notch3的形成电子海图–TIMP3复合物，促进TIMP3的招募和积累。反过来，TIMP3促进包括NOTCH3和VTN在内的复杂形成。体内CADASIL小鼠和患者的脑血管显示不溶性交联和可溶性TIMP3物种水平升高。此外，反向酶谱分析显示小鼠和CADASIL患者脑血管中TIMP3活性显著升高。总之，我们的发现支持了Notch3电子海图CADASIL疾病病理学中的级联假说，假设Notch3的聚集/积累电子海图脑血管是一个中心事件，促进功能重要的细胞外基质蛋白的异常募集，最终可能导致多因素毒性。具体来说，我们的结果表明TIMP3活性的失调，这可能导致Notch3突变电子海图通过破坏小血管中细胞外基质的稳态而产生的毒性。

关键词：CADASIL、Notch3、蛋白聚集、细胞外基质蛋白、脑血管

介绍

脑小血管疾病是导致中风的主要原因，也是导致成人血管认知障碍的主要原因。临床表现由多发性皮质下腔隙性梗死和广泛的白质损伤引起(Dichgans，2007年;潘托尼，2010). CADASIL是由NOTCH3受体显性突变引起的遗传性脑小血管病最常见的病因诊断(约特尔等。, 1996;沙布里亚等。, 2009). 潜在的血管病主要涉及软脑膜和小穿透动脉，其特征是血管平滑肌细胞进行性丢失，血管壁被各种类型的胶原蛋白显著增厚，以及所谓的颗粒嗜锇物质的细胞外积聚(鲁丘（Ruchoux）等。, 1995;蒂卡等。, 2009;东等。, 2012).

NOTCH3受体以异二聚体的形式存在于质膜上，其由210 kDa外结构域（NOTCH3）组成电子海图)含有34个表皮生长因子样重复序列，非共价连接到97kDa膜束缚的细胞内结构域（Notch3TMIC公司) (约特尔等。, 2000). 作为对配体结合的反应，NOTCH3和其他Notch受体一样，会经历连续的蛋白水解裂解，释放Notch细胞内结构域，该结构域转移到细胞核，与转录因子RBPJ和共同激活剂结合，激活基因转录(Kopan和Ilagan，2009年). Notch3主要表达于小动脉的血管平滑肌细胞和脑毛细血管周细胞。对小鼠的研究表明，Notch3在壁细胞投资、动脉分化和小动脉血管平滑肌细胞成熟中起着关键作用(多明加等。, 2004;线路接口单元等。, 2010;富亚德等。, 2012).

CADASIL患者具有高度刻板印象槽口3突变。绝大多数突变都是错义突变，迄今为止报道的几乎所有突变都会导致特定EGF-like重复序列中半胱氨酸残基的奇数(约特尔等。, 1997;彼得斯等。, 2005). 然而槽口3突变和小血管病理学尚不清楚。一方面，基于细胞的系统和体内研究表明，突变对NOTCH3–RBPJ活性有不同的影响，少数突变表现为功能丧失或亚型突变，而其他许多突变似乎不会损害NOTCH3R功能和典型信号(约特尔等。, 2004;彼得斯等。, 2004;莫奈等。, 2007,2009;Arboleda-Velasquez公司等。, 2011). 此外，NOTCH3活性受损是否可能导致疾病表型仍存在争议，因为小鼠NOTCH4的完全缺失与CADASIL表型无关，基因型-表型相关分析表明，CADASIL-associated loss of function突变与临床表型减弱有关(多明加等。, 2004;Monet-Lepretre公司等。, 2009). 另一方面，CADASIL相关突变的共同特征是Notch3非纤维沉积的存在电子海图以及血管壁中的颗粒嗜锇物质。槽口3电子海图在血管平滑肌细胞和脑周细胞周围聚集成微小的细胞外聚集物，最近被认为是颗粒嗜锇物质的组成部分(约特尔等。, 2000,2001;莱斯尼克·奥伯斯坦等。, 2003;石黑子等。, 2006;莫奈等。, 2007,2009;蒂卡等。, 2009;约特尔等。, 2010). Notch3在转基因小鼠模型中的观察电子海图积聚是发病机制中最早的事件之一，这表明它可能是细胞病理学的近因(莫奈等。, 2007,2009;约特尔等。, 2010). 在此，我们测试了过量Notch3的假设电子海图可以募集和隔离功能上重要的蛋白质。为了实现这一点，我们将来自CADASIL患者的脑组织和动脉组织以及CADASIL小鼠模型结合起来，进行生化、纳米液相色谱-串联质谱（nanoLC-MS/MS）和免疫组织化学分析。死后CADASIL脑组织显示出强大的病理学，尽管在疾病过程的末期，血管平滑肌细胞变性和血管纤维化显著，而来自CADASIL小鼠模型的材料显示出较少的损伤，但在疾病的早期。

材料和方法

更多信息见补充材料.

大脑和动脉样本

人脑组织

我们使用了七名CADASIL死亡老年患者（平均年龄62.8岁，范围49-70岁）的冷冻或石蜡包埋样本（额叶、颞叶或枕叶），这些患者的分子遗传学证实NOTCH3突变（R153C、C1261R、R169C、R133C和R110C），以及九名死亡老年对照受试者（平均年龄68岁，范围48-86岁）没有已知的脑血管疾病。所有人体样本均按照法国生物伦理学法律进行储存和处理，该研究得到了INSERM机构审查委员会的批准。

人脑血管

如前所述，从枕叶或额叶分离出微血管(尤西夫等。, 2007). 简单地说，称取脑组织重量（1-2 g），用手术刀切碎，在冷PBS（20 ml）中均质，在玻璃均质器中上下冲程20-40次。将均质液与等量的含有30%右旋糖酐的冷PBS混合。然后在6000℃下离心悬浮液克在4°C下保持20分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于含有1%牛血清白蛋白的PBS中。然后将悬浮液倒入40µm尼龙网中，研磨并用PBS充分清洗。通过翻转尼龙网在PBS中收集微血管，并通过离心造粒。用相控显微镜监测微血管制剂的纯度。

小鼠脑血管

我们使用了TghNotch3（WT）、TghNotch3（R90C）和TghNotch 3（C428S）小鼠，它们表达了人类槽口3C57BL/6J背景下野生型或突变序列的转基因(莫奈等。, 2007,2009). 转基因在TghNotch3（WT）和TghNotch 3（R90C）小鼠中以纯合状态表达。Tg缺口3重量和TgNotch3169C兰特转基因小鼠是否过度表达野生型或突变型大鼠槽口3FVB/N背景中杂合状态下的基因座(约特尔等。, 2010). 在显微镜下解剖脑动脉，包括Willis环的动脉和中等大小的分支，立即在液氮中快速冷冻，并在−80°C下储存直至使用。实验程序符合国家关于在研究中使用动物的指导方针，并得到了动物实验伦理委员会（巴黎迪德罗大学地方委员会，拉里波西埃-维尔明分校）的批准。

生物化学程序

所有提取缓冲液均含有蛋白酶抑制剂的混合物（完整™蛋白酶抑制剂混合物；罗氏）。对于使用定量蛋白质的实验，使用BCA蛋白质分析试剂盒（Pierce）以牛血清白蛋白为标准测定总蛋白质浓度。

总血管裂解物

使用磨砂玻璃均质器在SDS缓冲液（2%SDS，50 mM Tris，pH 7.4）中均匀化脑血管，每次约30次，并在室温下旋转1小时。

顺序生化分馏

将人脑组织样品（1.5–2.0 g）在10 ml/g缓冲液A（2 M NaCl，10 mM HEPES/NaOH pH 7.4，1 mM EDTA，10 mMN个-甲基马来酰亚胺），使用Potter-Elvehjem玻璃/玻璃均质器（30冲程），并在10万下通过超速离心沉淀克将上清液保存为高盐（S1）部分，然后将所得颗粒（P1）均匀化于10 ml/g缓冲液B中（100 mM NaCl，10 mM HEPES/NaOH，pH 7.4，1 mM EDTA，10 mCN个-甲基马来酰亚胺），含2%十二烷基硫酸钠，在室温下旋转1小时，然后在100 000下沉淀克在15°C下保持1 h。上清液保存为SDS（S2）可溶部分，剩余颗粒（P2）用10%2-巯基乙醇在SDS-Laemmli缓冲液（0.44 ml/g）中重新萃取至少24 h，然后在25 000下离心克在12°C下保存30分钟，并保存为“SDS+ß-巯基乙醇”部分。在另一组实验中，将颗粒P1重新悬浮在含有1%Triton™X-100或4 M尿素或6 M盐酸胍或7 M尿素、2 M硫脲和3%CHAPS的混合物的缓冲液B中，或在99%甲酸中提取。将所有再悬浮的P1旋转1小时，并在10万克将上清液保存为S2组分，并使用SDS-Laemmli缓冲液和10%2-巯基乙醇对所得颗粒（P2）进行最终提取。

在放射免疫沉淀分析（RIPA）缓冲液（150 mM NaCl，50 mM Tris–HCl，1%NP-40，0.1%SDS，0.5%脱氧胆酸钠，外加10 mM）中使用磨砂玻璃均质器在冰上均质人或小鼠脑血管N个-甲基马来酰亚胺）并在25000下离心克在4°C下保持30分钟。保留上清液（S1），在SDS缓冲液（3%SDS，125 mM Tris–HCl，10 mMN个-甲基马来酰亚胺）并在25000下离心克在11°C下保持30分钟。将上清液保存为S2级分，并在25000离心之前，使用含有10%2-巯基乙醇或20mM二硫代苏糖醇的SDS-Laemli缓冲液对所得沉淀（P2）进行最终提取克在11°C下保持30分钟。S1和S2馏分通过丙酮沉淀浓缩。

蛋白质印迹分析

样品与含有10%2-巯基乙醇或20 mM DTT的SDS-莱姆利缓冲液（4%SDS，125 mM Tris–HCl，pH 6.8，20%甘油）混合，通过29号针头15-20次，在25 000下离心澄清克SDS-PAGE前，在11°C下加热30分钟，在95°C下升温5分钟。蛋白质提取物在6%三甘氨酸SDS-PAGE或4-12%双蓖麻碱NUPAGE（Invitrogen）上电泳，并转移到硝化纤维素膜上。使用了以下主要抗体：小鼠单克隆抗Notch3电子海图（克隆5E1，稀释度1:500；克隆11A1，稀释度1:1000；约特尔等。, 2000)、小鼠单克隆抗卵黄凝集素（克隆BV2，Chemicon，稀释1:200）、兔单克隆抗TIMP3（克隆D74B10，细胞信号，稀释1:2500）、鼠单克隆抗平滑肌α-肌动蛋白（克隆1A4，Dako，稀释1:25000）和鼠单克隆抗体-肌动素（克隆AC15，Sigma，稀释1:10000）。将印迹与一级抗体在4°C下孵育过夜，然后使用与辣根过氧化物酶结合的二级多克隆抗鼠或抗兔免疫球蛋白和增强化学发光检测（Thermo Fisher Scientific）。使用ImageJ（10.2版，NIH）对带强度进行密度定量。

逆转录酶谱分析

将等量的总脑血管裂解物（8µg）与非还原性Laemmli样品缓冲液混合，并装入含有1 mg/ml明胶和表达明胶酶a（MMP2）的幼仓鼠肾细胞条件培养基的12%SDS-PAGE凝胶中，该酶被所有四种TIMP蛋白抑制（Dylan Edwards慷慨赠送）。清洗凝胶，在冲洗缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，5 mM CaCl）中培养24小时2，2.5%Triton™X-100），然后在再生缓冲液（50 mM Tris pH 7.5，5 mM CaCl）中培养18小时2)37°C，用水冲洗并用考马斯蓝染色。将转染人TIMP1、TIMP2或TIMP3的细胞裂解液作为对照。在这些条件下，TIMP通过活化明胶酶A抑制明胶消化，在较浅的背景下产生深蓝色条带。将相同的样品平行放置在4–12%的NUPAGE凝胶上，转移并用肌动蛋白抗体进行免疫印迹。使用ImageJ对带强度进行密度定量，并根据肌动蛋白信号进行归一化。

样品制备和质谱分析

使用RIPA和含有SDS的缓冲液对人脑样品和鼠脑动脉样品进行分级。用四只转基因小鼠收集的血管制备每个小鼠样品。在20–48小时之间，将最终颗粒提取在40µl含有20 mM二硫苏糖醇的Laemmli缓冲液中，并通过离心进行澄清。30微升蛋白质提取物在95°C下孵育5分钟后变性，在4–12%NUPAGE双蓖麻碱凝胶上电泳12分钟，200 V。回收凝胶，用水洗涤，用考马斯蓝（Bio-Rad）染色，并在室温下在水中广泛洗涤2至3小时（三次改变）。每个通道根据大小分为三个（小鼠样品）或五个（人体样品）部分，切成1 mm的立方体并放入1%的乙酸中。因此，每个样本进一步包含三个或五个子样本。

如前所述，对纯化样品使用凝胶胰蛋白酶消化法(舍甫琴科，2001年). 简单地说，还原后-烷基化（50 mM NH中的5 mM二硫苏糖醇4HCO公司三，56°C下30分钟；50 mM NH中25 mM碘乙酰胺4HCO公司三凝胶片通过在碳酸钠中与12.5 ng/µl胰蛋白酶（改良测序等级，罗氏）孵育消化，在37°C下轻轻摇晃过夜。用一体积（50μl）5%甲酸停止反应。将子样品在室温下的超声浴中超声处理10分钟，并进行处理以进行纳米LC MS/MS分析，如补充材料或在使用前储存在−20°C。

免疫组织化学分析

将以下抗体（小鼠单克隆抗卵黄凝集素，克隆BV2，Chemicon，稀释1:200；小鼠单克隆抗体TIMP3，克隆13613H4，Chemicon，稀释1:1000）应用于人脑石蜡切片，如补充材料以下抗体（兔多克隆抗卵黄凝集素，牛津生物医学研究，1:1000和Genway，1:1000稀释度；小鼠单克隆抗TIMP3，克隆13613H4，Chemicon，1:200稀释度；鼠单克隆抗Notch3电子海图，克隆5E1，稀释度1:2；多克隆抗Notch3电子海图，BC2，稀释度1:1000）用于冷冻脑切片，如补充材料.

免疫学-电子显微镜分析

冷冻脑切片与小鼠单克隆抗TIMP3（克隆13613H4，稀释1:50）孵育，并按照补充材料.

现场杂交

951 bp人类TIMP3公司通过PCR扩增制备探针（核苷酸，3964–4915 gi:75905820）并克隆到pBluescript®中。现场对CADASIL患者的脑石蜡切片进行杂交(n个=3） 和控制个人(n个=3） 如中所述补充材料.

表达质粒、细胞培养和免疫共沉淀分析

表达质粒

全长野生型NOTCH2、NOTCH3缺失和点突变、全长TIMP3和缺失突变体以及玻璃体凝集素构建物(补充图5)按中所述生成补充材料.

细胞培养和转染

HEK 293T细胞在补充有10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素的Glutamax™中生长。人类冠状动脉平滑肌细胞（级联生物制品）在补充了平滑肌生长补充剂（级联生物制剂）的培养基231中生长。如前所述，使用磷酸钙沉淀法将质粒转染到亚融合293T细胞中(约特尔等。, 2004). 对于联合免疫沉淀，293T细胞生长在50 cm2平板并转染20 ng血凝素标记的TIMP3、1µg血凝素或V5标记的玻璃体凝集素和1µgFLAG®标记的NOTCH3质粒。在共表达实验中，用200 ng血凝素标记的TIMP3和1µg FLAG®标记的NOTCH3质粒转染293T细胞。转染后48小时，收集细胞并制备提取物用于下游分析。

协同免疫沉淀、细胞组分和免疫印迹分析

在免疫沉淀缓冲液（0.5%Triton™X-100，10 mM TrisCl pH 8，140 mM NaCl）中溶解293T细胞，并添加蛋白酶抑制剂混合物。使用抗FLAG M2、抗血凝素或抗V5亲和凝胶（Sigma-Aldrich）进行免疫沉淀。用抗NOTCH3抗体从人冠状动脉平滑肌细胞中免疫沉淀内源性NOTCH3和TIMP3电子海图兔多克隆抗体（BC2）(约特尔等。, 2000)以兔免疫球蛋白为对照。为了制备细胞级分，在Ca2+，镁2+游离PBS，收集并在免疫沉淀或RIPA缓冲液中溶解。然后将培养板在PBS中冲洗数次，在含有5 mM EDTA的PBS中培养15分钟，然后在PBS内进行最终冲洗，并在少量Laemmli缓冲液中刮除细胞外基质。

蛋白质提取物在4–12%NUPAGE凝胶（Invitrogen）上分离并转移到硝化纤维素膜上。用兔多克隆抗FLAG®（Sigma-Aldrich稀释度，1:50000）、兔多克隆抗血凝集素（Sigma Aldrich，稀释度1:5000）或兔多克隆抗体c-myc、过氧化物酶结合物（Sigma-Aldrich，稀释度：1:5000，其次是与辣根过氧化物酶结合的次级多克隆抗兔或抗鼠免疫球蛋白和增强化学发光检测（Thermo Fisher Scientific）。细胞外基质的样品在4–12%的NUPAGE凝胶上平行运行，凝胶用银染色（皮尔斯银染色，赛默飞世尔科技公司）。使用ImageJ对带强度进行密度定量。

统计分析

数据表示为平均值±平均值标准误差（SEM）。两组比较通过双尾分析t吨-独立样本测试。通过单因素方差分析（ANOVA）评估多重比较，然后事后（post-hoc）测试。结果带有P（P）-值<0.05被认为具有统计学意义。

结果

突变体Notch3电子海图积聚在二硫化物交联洗涤剂不溶性聚集体中

我们首先分析了Notch3的生化特性电子海图在人类衍生材料中。我们使用增加蛋白质提取强度的缓冲液对CADASIL患者和对照受试者的脑样本进行了系列提取(图1A） ●●●●。与我们之前的报告一致(约特尔等。, 2000)，槽口3电子海图在对照组中几乎检测不到，而在CADASIL样品中则大量积累。在患者身上，几乎没有切口3电子海图在高盐和SDS可溶性组分中检测到，而在SDS加还原剂（莱姆利+ß-巯基乙醇）组分中存在大量(图1A） ●●●●。这些数据是用另外两名对照受试者和四名患者的大脑样本证实的(补充图1). 然后，我们评估了含有其他洗涤剂和变性剂的缓冲液，包括Triton™X-100（1%）、甲酸、尿素（4M）、胍（6M）或尿素（7M）、硫脲（2M）和CHAPS（3%）的混合物提取Notch3的能力电子海图引人注目的是，我们发现这些洗涤剂/变性剂都不能溶解Notch3电子海图而槽口3电子海图在含有还原剂的SDS缓冲液中从所得颗粒中回收(图1B） ●●●●。

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Notch3的生化分布电子海图在人脑样本和小鼠脑血管中。(A类)对一名人类对照个体和一名CADASIL患者的额叶进行均质化，并使用高盐（HS）缓冲液、2%十二烷基硫酸钠和雷姆利+巯基乙醇（βme）进行连续生化提取(左边). 高盐（S1）、2%SDS（S2）和Laemmli+ß-巯基乙醇（S3）组分在每条车道上装载相当于1.7 mg脑组织，在还原条件下进行6%SDS-PAGE，并用5E1抗Notch3免疫印迹分析电子海图抗体(正确的). 所示的斑点具有代表性，是使用来自五名CADASIL患者和三名对照受试者的死后脑组织样本进行的实验。(B类)使用高盐缓冲液、各种洗涤剂或变性剂（包括1%Triton™X-100、4M尿素、7M尿素、2M硫脲、3%CHAPS（UTC）、6M胍（Gnd）或99%甲酸（FA）的组合）对CADASIL患者的额叶进行连续的生物化学提取，然后用Laemmli+ß-巯基乙醇进行最终提取。用5E1抗体免疫印迹法分析洗涤剂/变性剂（S2）和相应的Laemmli+ß-巯基乙醇（S3）组分。对于甲酸可溶和不可溶部分，每车道装载相当于34 mg脑组织，对于所有其他部分，装载相当于1.7 mg脑组织。(C)来自非转基因（非Tg）、TgNotch3的脑动脉重量和TgNotch3169C兰特使用RIPA、2%SDS和Laemmli+ß-巯基乙醇对6个月大的小鼠进行连续生化提取(左边). RIPA组分（S1）每车道装载10微克蛋白质，2%SDS组分（S2）装载4微克蛋白质。直接装载所得2%SDS不溶性/Laemmli+ß-巯基乙醇萃取组分（S3），并用5E1抗体进行免疫印迹(上面的和中间的和平滑肌肌动蛋白抗体（SMA，降低面板）。显示了至少两个独立实验的代表性印迹。

我们将分析扩展到CADASIL小鼠模型的分离脑动脉。Tg缺口3重量和TgNotch3169C兰特小鼠过度表达大鼠缺口3转基因约为内源性的4倍槽口3(约特尔等。, 2010). 在TgNotch3中重量小鼠，少量Notch3电子海图在含有ß-巯基乙醇缓冲液的RIPA和SDS中同样可提取。相反，在TgNotch3中169C兰特老鼠身上，Notch3大量堆积电子海图在含有ß-巯基乙醇分数的SDS中，在较小程度上在SDS可溶性分数中，而在Notch3中电子海图仅在RIPA缓冲液中几乎无法提取(图1C） ●●●●。

我们还分析了Notch3的生化特性电子海图在TghNotch3（R90C）和TghNotch 3（C428S）突变小鼠和表达人类生理水平的对照TghNotch3（WT）小鼠中槽口3转基因（约为内源性小鼠的1.5倍槽口3). R90C和C428S分别是活性和非活性NOTCH3–RPBJ突变体(约特尔等。, 2004;莫奈等。, 2007,2009). 有趣的是，这些小鼠中的转基因可以使用人类Notch3特异性单克隆抗体进行特异性识别电子海图(鲁丘（Ruchoux）等。, 2003). 我们发现，在野生型动脉中，Notch3电子海图主要在RIPA缓冲液中回收，大多数人类和内源性Notch3电子海图在此分数中检测到(补充图2A和B类). 相比之下，在TghNotch3（R90C）和TghNotch3（C428S）小鼠中，突变型Notch3电子海图在RIPA缓冲液中可提取性较差，而在SDS+ß-巯基乙醇部分中积累(补充图2B). 综合起来，数据表明突变型Notch3电子海图被并入由二硫键交联的高阶多聚体中。

TIMP3和玻璃体凝集素在Notch3中富集电子海图-CADASIL样品的富集分数

接下来，我们测定了Notch3的蛋白质组电子海图-富集部分，假设Notch3隔离蛋白质电子海图应该在这一部分中富集。为了实现这一点，我们使用纳米LC-MS/MS和光谱计数方法进行了敏感的半定量蛋白质组分析(线路接口单元等。, 2004). 我们首先利用一名CADASIL患者和一名对照受试者的死后脑组织进行了初步蛋白质组研究。与我们测量凹口3的说法一致电子海图富集组分，CADASIL样品含有18种独特的NOTCH3肽，这些肽都是从NOTCH 3中提取的电子海图序列，而对照样品不含任何序列。我们在对照和CADASIL样品中分别鉴定了323和281种蛋白质，其中104种在CADASIL样品中富集。其中，CADASIL样本中存在72种蛋白质，主要包括细胞外基质蛋白质，而对照组中不存在(补充表1).

为了确定疾病早期差异表达的蛋白质，我们使用10–12个月龄野生型TghNotch3（WT）和突变转基因TghNotch 3（R90C）小鼠的脑动脉重复蛋白质组学分析。在三对野生型和突变型样品上进行的蛋白质组学实验分别鉴定了野生型和变异型样品中的39和48个蛋白质，这些蛋白质是由三个生物复制品中至少两个的两个或多个独特肽共同鉴定的(补充表2). 再次，我们鉴定出八种不同的NOTCH3肽，它们都是从NOTCH4中分离出来的电子海图序列，在突变样本中，在野生型样本中没有。重要的是，两种蛋白TIMP3和VTN在人类CADASIL样本中高度富集，在突变动脉中存在，而在对照动脉中几乎不存在(补充表2和补充图3).

免疫印迹分析证实，与对照脑的类似部分相比，TIMP3和VTN在人CADASIL脑的SDS+还原剂（Laemmli+ß-巯基乙醇）部分中富集(补充图4A和B类). 同样，与对照小鼠相比，从10–12月龄小鼠动脉样品制备的Laemmli+ß-巯基乙醇组分在突变小鼠中显示TIMP3和VTN的积累(补充图4C和D类).

TIMP3和玻璃体凝集素并入Notch3电子海图-包含存款

接下来，我们通过免疫组织化学方法评估患者和对照组以及小鼠模型脑组织中TIMP3和VTN的表达模式。对CADASIL脑组织的检查显示，软脑膜和穿透性白质动脉的中层存在强健的颗粒状免疫反应性，其中含有抗玻璃体凝集素(图2B和C）和反TIMP3(图3B和C）抗体，与抗Notch3抗体极为相似电子海图抗体(约特尔等。, 2000). 相反，对照组受试者的血管显示出弱而均匀的染色模式(图2A和​和3A）。三A） ●●●●。同样，免疫荧光分析显示，在TgNotch3的脑血管内，VTN以点状结构的形式积聚169C兰特对照组TgNotch3中缺失的小鼠重量老鼠(图2D–L）。早在12个月大的时候，软脑膜和脑内动脉中就可以检测到颗粒性VTN免疫反应（数据未显示），但在20个月大时就有标记(图2G） 而在12个月大的时候，它在脑毛细血管中已经很明显了(图2J） 。值得注意的是，槽口3电子海图这些小鼠在1到6个月大时开始形成微观聚集体(约特尔等。, 2010). 重要的是，我们发现VTN和TIMP3与Notch3显著共存电子海图-TgNotch3脑血管中的阳性聚集物169C兰特CADASIL小鼠和患者(图2一、 L和3F）。由于缺乏合适的抗体，我们无法分析TIMP3在小鼠组织中的分布，也无法检测Notch3电子海图以及VTN在人体组织中的共同定位。

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VTN矿床与Notch3共存电子海图骨料。(A–C)对照组的石蜡脑切片(A类)和CADASIL受试者(B类和C)用单克隆抗VTN抗体（α-VTN）染色，该抗体能有力地检测VTN沉积到CADASIL脑血管介质中。所示图像代表了四名CADASIL患者和四名对照受试者的实验中的至少两个部分。(D–L型)TgNotch3的冷冻脑切片重量(D–F型)和TgNotch3169C兰特老鼠(G–L)用抗Vitronectin和抗Notch3染色电子海图抗体和免疫荧光分析。20个月大的TgNotch3软脑膜动脉的代表性切片重量鼠标(D–F型)从20个月大的TgNotch3纵向切下的两条相邻软脑膜动脉169C兰特鼠标(G–I)和一个12个月大的TgNotch3的毛细血管169C兰特鼠标(J–L型)如图所示。这些面板代表了使用三只突变小鼠和三只对照小鼠进行的两次实验中的至少六个部分。比例尺：50µm(A–C)，26微米(D–I型)和15µM(J–L型).

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TIMP3和槽口3电子海图并入颗粒嗜锇物质沉积物中。(A–C)对照组的石蜡脑切片(A类)和CADASIL受试者(B类和C)用单克隆抗TIMP3抗体染色，可可靠地检测CADASIL脑血管中的TIMP3沉积。所示图像代表了四名CADASIL患者和四名对照受试者的实验中的至少两个部分。(D–F型)CADASIL受试者冰冻脑切片用抗TIMP3和抗Notch3染色电子海图抗体和免疫荧光分析。所示图像代表了两个实验中的至少四个截面，所用材料来自三名CADASIL患者。(G公司和H（H）)用抗TIMP3抗体对CADASIL受试者冰冻脑切片进行免疫电镜检查(G公司)或anti-Notch3电子海图(H（H）)抗体。星号表示颗粒嗜锇物质沉积。免疫标记显示为黑点（箭头）。面板是两个实验中至少三个组织块的代表。SMC=平滑肌细胞。比例尺：50µm(A–C)，60微米(D–F型)和1µM(G公司和H（H）).

评估缺口3之间的关系电子海图TIMP3沉积更详细，脑切片进行免疫电镜分析。由于缺乏合适的抗体，这项技术对VTN的精细定位受到阻碍。如所示图3H、 Notch3的免疫金标记电子海图在颗粒嗜锇物质附近的血管平滑肌细胞的质膜上可见，也在颗粒嗜奥斯物质沉积物中可见，这与最近的报告一致，表明Notch3电子海图会积聚成颗粒状的嗜锇物质(石子等。, 2006). 值得注意的是，TIMP3免疫金标记是在颗粒嗜锇物质沉积物中检测到的，尽管银增强的金颗粒主要出现在颗粒嗜奥斯物质的周边，而核心区域几乎没有(图3G） ●●●●。然而，我们承认，用于本实验的预包埋方法可能限制了抗体的可及性，并且可能没有提供最佳信号。综合这些结果，表明VTN和TIMP3被纳入CADASIL矿床体内.

NOTCH3水平的增加或聚集增强了NOTCH3-TIMP3复合物的形成，TIMP3促进了包括NOTCH3-和VTN在内的复合物的生成

接下来，我们研究了TIMP3和VTN是否与Notch3复合电子海图，使用联合免疫沉淀分析。我们发现，在存在FLAG标记的野生型NOTCH3（FLAG-N3-WT）的情况下，抗FLAG抗体可降低大量血凝素标记的TIMP3（TIMP3-HA），但在存在缺失所有34个EGF-like重复序列的NOTCH4缺失突变体（FLAG.N3ΔEGFR1-34）的情况除外(图4A） ●●●●。在反向免疫共沉淀实验中也得到了类似的结果(图4D） ●●●●。值得注意的是，NOTCH3（R90C、C212S和C428S）中的CADASIL相关突变与TIMP3以类似于野生型NOTCH4的方式复合(图4B） ●●●●。相反，使用抗V5抗体与V5标记的卵黄凝集素（VTN-V5）共同免疫沉淀的野生型和突变型NOTCH3数量极低(图4C） ●●●●。此外，没有使用抗血凝素（HA）抗体与血凝素标记的卵黄凝集素（VTN-HA）共同免疫沉淀的Flag-N3-WT，而大量的Flag-N3-WT与TIMP3-HA共同免疫沉淀，证实VTN与Notch3的亲和力低得多电子海图在该分析中比TIMP3(图4D） ●●●●。

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TIMP3与Notch3形成复合物电子海图和Vitronectin。(A–D)用血凝素标记的TIMP3（TIMP3-HA）共同转染FLAG标记的野生型NOTCH3（FLAG-N3-WT）和突变型NOTCH2（ΔEGF1-34，R90C，C212S，C428S，TMIC）(A类和B类)或V5标记的Vitronectin（Vtn-V5）(C)293T细胞中。获得转染细胞48小时后，用抗FLAG抗体进行免疫沉淀（IP）(A类和B类)或抗V5抗体(C)并用所示抗体进行免疫印迹（IB）。(D类)用TIMP3-HA或血凝素标记的VTN（VTN-HA）联合转染FLAG标记的野生型NOTCH3（FLAG-N3-WT）和缺乏34个EGF-like重复序列的FLAG标记NOTCH4缺失突变体（FLAG.N3ΔEGF1-34）。用抗血凝素（HA）抗体进行免疫沉淀。(E类)用TIMP3-HA和Vtn-V5联合转染Flag-N3-WT，用抗V5抗体进行IP。这个小组是三个独立实验的代表。(F类)冠状动脉平滑肌细胞内源性NOTCH3与TIMP3的相互作用。使用抗NOTCH3进行NOTCH3免疫沉淀电子海图以兔多克隆抗体（BC2）、正常兔IgG为对照。星号表示非特定标记。显示了至少两个独立实验的代表性凝胶。

然后我们测试了TIMP3与VTN复合的可能性。我们发现，在VTN-V5存在的情况下，抗V5可以降低TIMP3-HA，但在没有VTN-V4的情况下则不能(图4E） ●●●●。重要的是，在外源性TIMP3-HA存在的情况下，Flag-N3FL-WT可以降低更多的VTN-V5(图4E） ●●●●。

值得考虑的是，即使在低表达水平下，在野生型或突变型Notch3转染的细胞中，细胞内Notch3聚集体也不可避免地积累(奥斐克等。, 2009). 为了确定NOTCH3和TIMP3在生理水平表达时是否在同一复合物中相关，我们使用抗NOTCH3抗体对培养的人冠状动脉平滑肌细胞进行联合免疫沉淀电子海图抗体；由于缺乏合适的TIMP3抗体，我们无法进行反向免疫共沉淀分析。我们找到了Notch3电子海图能够协同免疫沉淀少量TIMP3(图4F） ●●●●。总的来说，结果表明Notch3的水平或聚集增加电子海图增强NOTCH3–TIMP3复合物的形成，TIMP3促进包括NOTCH3-和VTN在内的复合物形成。因此，选择TIMP3进行进一步研究。

Notch3水平增加或聚集电子海图促进TIMP3的招募和积累

接下来，我们询问Notch3的水平是否增加或聚集电子海图使用单独表达TIMP3-HA的HEK293T细胞或与FLAG-tagged NOTCH3结合使用，可能会影响TIMP3的表达水平和亚细胞定位。值得注意的是，在本试验中，NOTCH3主要在细胞内过度表达（数据未显示）。在全长野生型NOTCH3过度表达后，我们发现细胞裂解液中TIMP3蛋白的稳态水平比仅表达TIMP3的细胞增加了2.6倍(图5A） ●●●●。TIMP3是一种分泌蛋白，与TIMP1、TIMP2和TIMP4的区别在于其结合细胞外基质的能力(李等。, 2007). 与细胞外基质结合的TIMP3定量，其中Notch3电子海图不存在（数据未显示），显示过表达NOTCH3的细胞比单独表达TIMP3的细胞减少2.3倍(图5B） ●●●●。值得注意的是，家族连锁的CADASIL R90C突变以类似于野生型NOTCH3的方式调节TIMP3蛋白水平(图5A和B）。有趣的是，TIMP3过度表达后NOTCH3蛋白水平没有改变(补充图6). 重要的是，我们检查了瞬时转染细胞表达的TIMP3-HA公司信使RNA在这些分析中(图5A和数据未显示）。因此，这些数据表明过量的NOTCH3可以促进TIMP3蛋白在过度表达的细胞室中的募集和积累。

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NOTCH3以需要形成NOTCH3-TIMP3复合物的方式影响TIMP3蛋白水平。(A类和B类)单独或与野生型（Flag-N3-WT）或突变型R90C Flag-tagged NOTCH3（Flag.N3-R90C）联合转染血凝素标记的TIMP3（TIMP3-HA）。转染细胞后48小时(A类)和细胞外基质(B类)收获了。用所示抗体或银染法对细胞裂解物和细胞外基质进行免疫印迹分析(顶部面板）。相对TIMP3-HA公司测定信使RNA和TIMP3-HA蛋白水平(底部面板）。所示为相对TIMP3-HA公司信使RNA水平标准化为第6页(A类,左边)，将细胞裂解液中的TIMP3-HA蛋白相对水平归一化为肌动蛋白(A类,中间的)或NOTCH3(A类,正确的)和细胞外基质中相对TIMP3-HA蛋白水平归一化为总蛋白含量(B类) (n个=3） （S，分子量标准）。(C)与单独转染TIMP3-HA的细胞和共表达TIMP3-NA和FLAG-N3-WT的细胞相比，删除34个EGF-like重复序列（FLAG-N3ΔEGF1-34）的FLAG-tagged NOTCH3不会影响细胞裂解液中TIMP3-HA的稳态水平。底部：相对TIMP3-HA公司信使RNA水平标准化为G6PD公司(C,左边)和归一化为肌动蛋白的细胞裂解液中的相对TIMP3-HA蛋白水平(C,正确的) (n个=3). (D类和E类)Flag-N3-WT不影响TIMP3ΔNTD-HA稳态水平(D类)但增加TIMP3ΔCTD-HA稳态水平(E类). 下图TIMP3ΔNTD-HA(D类,左边)和，共TIMP3ΔCTD-HA(E类,左边)标准化为G6PD公司TIMP3ΔNTD-HA的相对细胞内蛋白水平(D类,正确的)和TIMP3ΔCTD-HA(E类,正确的)归一化为ß-肌动蛋白(n个=3). *P（P）<0.05, **P（P）<0.01和***P（P）<0.001，与Tukey的方差分析事后（post-hoc）分析(A类和C)或学生考试(D类和E类). ns=不显著。

接下来我们研究了NOTCH3诱导的TIMP3蛋白水平变化是否需要NOTCH3-TIMP3复合物的形成。TIMP3蛋白水平不受NOTCH3缺失突变体N3ΔEGFR1-34过度表达的影响，该突变体无法与TIMP3复合(图5C） ●●●●。另一方面，仅包含外域的NOTCH3构造（NOTCH3电子海图)强烈上调TIMP3水平(补充图7). 此外，TIMP3突变体缺乏N末端半体（TIMP-3ΔNTD-HA），无法与NOTCH3复合(补充图8)，在NOTCH3过度表达时表达不变(图5D） 而缺乏C末端半体的TIMP3突变体（TIMP-3ΔCTD-HA）的稳态水平在NOTCH3过度表达时增加，该突变体保留了与NOTCH_3形成复合物的能力(图5E和补充图8). 因此，这些数据表明，NOTCH3诱导的TIMP3积累需要NOTCH3-TIMP3复合物的形成，NOTCH2信号活动对于这种效应是不必要的。

CADASIL脑血管中TIMP3蛋白水平与生物活性

我们评估了Notch3电子海图积累/聚集影响TIMP3的表达和活性体内，在脑血管中。首先，从CADASIL患者和对照组的死后大脑样本中分离微血管，并用western blot进行分析。量化脑血管裂解物中TIMP3的总水平显示，与对照组相比，CADASIL患者的TIMP3水平增加了14.4倍。值得注意的是，从30 kDa到凝胶顶部的高分子量TIMP3物种大量积累，这可能与对照受试者中未检测到的TIMP3聚集体相对应(图6A） ●●●●。如预期的那样，在RIPA缓冲液和SDS缓冲液中的连续提取显示，TIMP3在CADASIL患者脑血管SDS不溶部分中积累。值得注意的是，我们还检测到CADASIL患者血管中RIPA和SDS可溶性TIMP3水平升高(图6B） ●●●●。值得注意的是，在这些后来的船只中，Notch3电子海图仅在SDS不溶部分中积累。

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CADASIL患者脑血管中TIMP3蛋白水平和生物活性。(A类)从CADASIL和对照受试者中分离的脑血管的总裂解物用所示抗体进行免疫印迹(左边面板）。底部：TIMP3蛋白相对水平归一化为肌动蛋白水平(n个=4名CADASIL患者n个=4名对照受试者）。(B类)对照组和CADASIL患者的脑血管使用RIPA、2%SDS和Laemmli+ß-巯基乙醇进行连续生化提取。RIPA组分在每条车道上装载30微克总蛋白，直接装载产生的2%SDS可溶和2%SDS不可溶但Laemmli+ß-巯基乙醇萃取组分，并用所示抗体进行免疫印迹。至少两个独立实验显示了一个具有代表性的印迹，该实验使用了两个对照组和两个CADASIL患者的脑血管。(C)将来自对照组和CADASIL患者的石蜡脑切片与TIMP3公司互补RNA探针和暗场检查(左边)和亮场照明(正确的). 所示图像（具有穿透血管的白质）代表了使用三名CADASIL患者和三名对照受试者进行的实验的至少四个切片。(D类)从4名CADASIL患者和4名对照组受试者分离的脑血管裂解物同时进行反向酶谱分析和免疫印迹-肌动蛋白。转染TIMP3或空质粒的细胞裂解液用作反向酶谱的内部对照。显示了两个独立实验的代表性反向酶谱。右：4例CADASIL患者和4例对照组受试者测定TIMP3相对活性，并将其归一化为肌动蛋白水平。SMA=平滑肌肌动蛋白。

现场对对照组人脑切片的杂交显示，血管细胞是TIMP3公司信使RNA在大脑中，在穿透的小血管中检测到最高表达。重要的是，我们发现TIMP3公司来自CADASIL患者的血管与来自对照个体的血管中的信使RNA表明，观察到的TIMP3蛋白水平的增加不太可能是由于转录效应，而是由于翻译效率的提高或蛋白质降解受损(图6C） ●●●●。

我们通过反向酶谱法进一步分析了人类脑血管中TIMP3的活性水平，该酶谱法测量了TIMP3抑制基质金属蛋白酶的能力(Stetler-Stevenson，2008年). 引人注目的是，在人类脑血管中，TIMP3占明胶酶抑制活性的大部分(图6D和数据未显示）。重要的是，CADASIL患者的TIMP3活性是对照组的2.5倍(图6D） ●●●●。

接下来，我们使用从TgNotch3分离的脑动脉重复了相同的分析169C兰特和控制TgNotch3重量老鼠。免疫印迹分析显示TgNotch3中TIMP3的总水平增加了1.9倍169C兰特小鼠与TgNotch3的比较重量对照小鼠(图7A） ●●●●。值得注意的是，TgNotch3重量和非转基因小鼠表达可比的TIMP3蛋白水平(补充图9). 在Triton™X-100、RIPA和SDS+ß-巯基乙醇缓冲液中的连续提取显示，TgNotch3中所有三种馏分（包括Triton™X-100和RIPA可溶馏分）中的TIMP3更多169C兰特老鼠(图7B） ●●●●。逆转录酶谱分析显示TIMP3是鼠脑动脉中主要的内源性基质金属蛋白酶抑制剂。值得注意的是，TgNotch3的明胶酶抑制活性高1.8倍169C兰特小鼠与TgNotch3的比较重量老鼠(图7C） ●●●●。总的来说，这些数据表明CADASIL患者和小鼠的脑血管积聚了一系列不溶性和可溶性TIMP3物种，并表明这与TIMP3活性异常升高有关。

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CADASIL小鼠模型脑血管中TIMP3蛋白水平和生物活性。(A类)从TgNotch3分离的脑血管总裂解物重量和TgNotch3169C兰特20个月龄小鼠用所示抗体进行免疫印迹。显示的是来自TgNotch3的两个脑动脉样本的代表性斑点重量和TgNotch3169C兰特老鼠。赖特：TIMP3蛋白相对水平归一化为平滑肌肌动蛋白水平，根据n个=4个野生型和n个=由8个TgNotch3制备的4个突变样品重量小鼠和八个TgNotch3169C兰特小鼠。(B类)来自TgNotch3的脑血管重量和TgNotch3169C兰特使用Triton™X-100、RIPA和Laemmli+ß-巯基乙醇（\223,me）进行连续生化提取。Triton-soluble组分在每条通道中装载25微克总蛋白，直接装载产生的RIPA可溶和RIPA不可溶但Laemmli+ß-巯基乙醇萃取组分，并用所示抗体进行免疫印迹。显示了至少两个使用对照和突变小鼠脑血管的独立实验的代表性印迹。(C)从TgNotch3分离的脑血管总裂解物重量和TgNotch3169C兰特对20个月龄的小鼠进行反向酶谱分析。转染TIMP1、TIMP2和TIMP3的细胞裂解液或空质粒作为内部对照。显示的是来自两个独立实验的代表性反向酶谱图。赖特根据平滑肌肌动蛋白水平标准化的TIMP3相对活性，由两个独立的实验使用n个=4 Tg缺口3重量样品和n个=4 Tg缺口3169C兰特从八个TgNotch3制备的样品重量小鼠和八个TgNotch3169C兰特小鼠。

讨论

这里我们证明，在CADASIL患者和转基因小鼠的脑血管中，Notch3电子海图聚集在含有功能重要的基质细胞蛋白的聚集体中，包括TIMP3和VTN。重要的是，TIMP3和VTN之前并未牵涉到CADASIL，也不被称为NOTCH3的交互伙伴。通过对这两种蛋白质的进一步分析，我们可以破译CADASIL沉积形成的一些机制以及它们异常募集的可能后果。

以前，我们和其他人都报告过，为了溶解Notch3，必须同时添加洗涤剂和还原剂电子海图来自CADASIL大脑(约特尔等。, 2000;迪林等。, 2011). 此外，在体外使用含有前五个EGF-like重复序列的纯化重组NOTCH3片段进行的研究表明，半胱氨酸突变片段自发形成高阶多聚体，并通过二硫键交联(迪林等。, 2011). 在这里，我们使用来自CADASIL患者和小鼠模型的脑和动脉样本进行生化分析，通过显示突变Notch3来扩展这些发现电子海图被并入变性剂和洗涤剂不溶性聚集体中，通过添加还原剂可以从中回收。值得注意的是，携带RBPJ-活性或非活性突变的NOTCH3分子表现类似。因此，这些数据强烈认为半胱氨酸修饰是突变Notch3构象改变的关键决定因素电子海图分子，最终导致在显微镜下可识别的缺口3的形成电子海图骨料。然而，这个过程中单个半胱氨酸残基的确切配对和贡献仍有待确定。Notch3的可能性电子海图首先发生聚集体内从转基因突变小鼠中观察到Notch3得到了一些支持电子海图早在1个月龄时就可以检测到聚集物，TIMP3和VTN的聚集随后发生。接下来，我们的实验结果表明Notch3的水平或聚集增加电子海图而不是突变Notch3中的未配对半胱氨酸残基电子海图，强烈增强的TIMP3–槽口3电子海图复杂形成，导致TIMP3的招募和积累，进而促进包括NOTCH3和VTN在内的复杂形成。这表明Notch3的聚集或过量水平电子海图可能会形成一个平台或充当种子，影响与细胞外基质蛋白（如TIMP3）的相互作用，进而结合和招募越来越多的蛋白质（如VTN），产生新的相互作用表面，并在滚雪球效应中放大聚集物的毒性潜力。这很容易让人想起许多神经退行性疾病中蛋白质聚集体沉积不当的情况(Wolfe和Cyr，2011年).

迄今为止，在CADASIL患者死后脑组织上使用激光捕获显微切割技术，仅发现另外两种蛋白质，即细胞外伴侣凝集素（clusterin）和内皮抑素（endostatin），这两种蛋白质是来源于胶原α-1（XVIII）链的天然蛋白水解片段，是颗粒嗜锇物质成分(Arboleda-Velasquez公司等。, 2011). 有趣的是，我们的蛋白质组分析揭示了额外的蛋白质，包括大多数细胞外基质蛋白质，这些蛋白质在CADASIL样品中富集，值得进一步研究。值得注意的是，人源性CADASIL样本富含聚簇素和内皮抑素，支持我们方法的有效性和价值。尽管如此，这两种蛋白质的丰度在转基因小鼠的野生型和突变型脑动脉中似乎具有可比性，这表明聚集素和内皮抑素可能在疾病的晚期积累。这可能适用于通过我们的蛋白质组分析确定的许多其他蛋白质，这一发现与上述滚雪球模型一致。因此，Notch3的比较蛋白质组学分析电子海图在疾病过程的不同阶段，从突变和野生型样品中制备的富集部分可能代表了一种识别与Notch3共聚合蛋白质的有趣方法电子海图在发病过程中。

蛋白质在聚集体中的补充和进一步隔离通常会导致其生物功能的崩溃(奥尔兹查等。, 2011). 然而，我们的反向酶谱分析提出了一种有趣的可能性，即TIMP3活性在CADASIL脑血管中异常升高。CADASIL患者和小鼠的脑血管显示，除了交联洗涤剂不溶性TIMP3物种水平升高外，可溶性TIMP3中间产物水平增加，这一观察结果也支持了这一观点。然而，值得注意的是，反向酶谱分析的一个局限性是使用可能溶解TIMP3物种的洗涤剂，否则这些物种将不溶于水或不活泼现场。因此，需要额外的实验来评估TIMP3蛋白水平增加在CADASIL脑血管中的功能作用。

TIMP3具有多种生物活性，与CADASIL发病直接相关。在大脑中，穿透小血管的血管细胞是TIMP3的主要来源。TIMP3失调可能通过其众所周知的基质金属蛋白酶抑制活性而导致小血管病变。细胞外基质的平衡是通过降解细胞外基质成分和TIMP蛋白及其内源性抑制剂的基质金属蛋白酶功能的平衡来维持的。值得注意的是，我们的结果表明，在脑血管中，TIMP3是金属蛋白酶活性的主要调节器。因此，TIMP3活性异常升高预计会导致血管纤维化。CADASIL充分显示了小动脉壁的纤维化增厚，最近，在所有脑血管管径中都记录到I、III、IV和VI型胶原蛋白的增加(东等。, 2012). 值得注意的是，一些非细胞外基质分子也是基质金属蛋白酶的潜在底物，因此TIMP3活性升高可能产生有害影响。TIMP3失调也可能通过其抗血管生成活性而导致病理改变(气等。, 2003;易卜拉欣等。, 2011). 特别是，TIMP3可以独立于其基质金属蛋白酶抑制活性而抑制血管内皮生长因子介导的血管生成。之前，我们已经记录了TgNotch3中毛细管密度的显著降低169C兰特CADASIL小鼠模型。此外，TIMP3是唯一能抑制ADAM17/TNF转化酶的TIMP，该酶介导跨膜受体和包括TNF和表皮生长因子受体配体在内的配体的外域脱落(长濑等。, 2006). 有趣的是，最近的研究表明肝素结合型EGF样生长因子在周细胞募集过程中的作用，周细胞募集导致血管成熟和稳定(斯特拉曼等。, 2010). 最后，TIMP3的突变导致索斯比眼底营养不良，这是一种成年发病的遗传性黄斑变性疾病，其特征是TIMP3异常沉积、黄斑萎缩和脉络膜新生血管(韦伯等。, 1994;法利斯等。, 1998;气等。, 2003). 细胞外基质重塑中的内稳态紊乱可能与Sorsby眼底营养不良病理有关，尽管其机制尚不清楚。另一方面，可以想象TIMP3的各种生物活性受到TIMP3积累的不同影响。需要进一步研究来检验这些假设。

同样，VTN的异常募集和隔离可能会损害其功能。虽然VTN是一种丰富的循环血浆蛋白，但我们发现，在脑血管中，VTN转录丰富（未发表），是细胞外基质的正常成分。通过与整合素型细胞粘附受体、尿激酶受体和细胞外基质蛋白结合的能力，VTN具有调节细胞粘附、信号传递和细胞骨架重组的能力。此外，通过结合和稳定纤溶酶原激活抑制剂1型，VTN可以调节纤溶系统的平衡，从而调节细胞外基质的稳态(Preissner和Reuing，2011年). 需要进一步研究，以检查局部VTN沉积物是否以及如何改变这些生物活性。

总之，我们的结果支持Notch3电子海图级联假设，假设Notch3的聚集电子海图脑血管是CADASIL病病理学的中心事件，促进细胞外基质功能重要蛋白的异常募集和潜在失调，最终可能导致多因素毒性。识别CADASIL–槽口3电子海图interactiome可能是一种有趣的方法，可以进一步揭示这种毒性的分子机制。

补充材料

补充数据：

鸣谢

我们感谢Dylan Edwards博士的实验室进行TIMP活性检测，感谢Hannu Kalimo博士、Françoise Chapon博士、Jean-Jacques Haw博士、Catherine Godfraind博士和GIE-NeuroCeb脑库（法国巴黎）提供人脑样本，感谢Barbara Lemaire-Carrette博士提供技术援助。我们感谢Fer-á-Moulin研究所和TAAM-Orleans（Karine Jambou）的电子显微镜核心为动物提供住所。

词汇表

缩写

CADASIL公司伴有皮质下梗死和白质脑病的常染色体显性脑动脉病
槽口3电子海图NOTCH3细胞外结构域
RIPA公司放射免疫沉淀分析

基金

这项工作得到了法国国家研究机构（批准号ANR Genopath）的资助2009年-RAE09011HSA)，国立卫生研究院（拨款编号R01 NS054122型)A.J.M.R.的Leducq基金会（跨大西洋大脑小血管疾病发病机制卓越网络）是欧洲共同体（玛丽·居里初始培训网络）奖学金的接受者。FT ICR MS的收购得到了埃塔-雷区（CPER）基金会Recherche et Technologie（2002-2006）的投资拨款支持。感谢TGE FT-ICR为开展研究提供的资金支持。

补充材料

补充材料位于大脑在线。

工具书类

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文章来自大脑由以下人员提供牛津大学出版社