外显子组测序确定前列腺癌复发性SPOP、FOXA1和MED12突变

拷贝数分析

采用Affymetrix SNP 6.0阵列对肿瘤和正常DNA进行分析，以检测体细胞拷贝数改变的区域。如前所述，进行了质量控制、分割和拷贝数分析³³为了减少可能由生殖系信号引起的复发性病变的数量，我们采取了另一个步骤：我们仅对正常DNA样本应用相同的检测管道。两种分析中检测到的所有峰值都被排除在复发性体细胞拷贝数畸变列表之外。GISTIC q值<0.1的其余病变包括在与突变基因相关的拷贝数变化分析中。所有关联检验均采用双尾Fisher精确检验。

序列数据处理和质量控制

外显子序列数据处理和分析是使用Broad Institute管道进行的^14,38,39通过“Picard”管道对每个肿瘤和正常样本进行Illumina测序读取，生成与hg19人类基因组构建一致的BAM文件。“Firehose”管道用于管理输入和输出文件，并提交分析以供GenePattern执行⁴⁰.

Firehose中的质量控制模块用于比较来自Affymetrix阵列和测序数据的基因型，以确保一致性。SNP阵列中的基因型也用于监测测序数据中不同个体样本之间的低水平交叉污染，使用ContEst算法⁴¹.

突变召唤与显著突变基因的鉴定

来自Broad Institute Genome Analysis Toolkit的MuTect算法用于识别目标外显子中的SSNV^39,42MuTect通过对给定基因组位点的肿瘤和正常BAM中碱基及其质量的贝叶斯统计分析来识别候选SSNV。我们需要至少14个读数覆盖肿瘤中的一个部位，8个读数覆盖正常部位以进行突变调用。我们利用ContEst管道交叉污染的估计值，确定了每样本检测SSNV的最低等位基因分数⁴¹在肿瘤和正常序列的局部重排后，使用Indelocator算法检测小的体细胞插入和缺失⁴².

Broad Institute的MutSig算法被用于识别在给定序列背景和基因组区域的情况下因突变而显著富集的基因或基因集^14,39,42对于每个基因，我们计算了检测到观察到的突变群或更极端的突变群的概率，给定了整个数据集计算的背景突变率。然后针对多假设测试（Benjamini-Hochberg程序）调整该p值，以获得q值。通过在综合基因组查看器（IGV）中检查BAM文件，手动审查显著突变基因和文本中描述的其他基因的突变⁴³.

通过质谱基因分型验证选定突变

我们选择了48对T/N对中的240个非沉默突变（231个SSNV和9个indels），利用iPLEX平台（加州圣地亚哥Sequenom）通过质谱基因分型进行验证。我们针对q值<0.1的显著突变基因或基因集中的74个突变以及COSMIC报告的突变。其余166个非沉默突变是随机选择的。因为当突变等位基因出现在低等位基因分数时，使用该技术的验证率显著下降^14,38，我们试图仅验证等位基因分数≥0.2的突变（即20%的肿瘤序列读取包含突变）。

在240次尝试的检测中，228次成功进行了基因型调用，218次体细胞突变得到确认（列于补充表3). 肿瘤中的所有事件都没有出现在相应的正常值中。突变调用的总准确率为95.6%（CI:92%–98%；Clopper-Pearson 95%置信区间），与之前的研究非常一致^14,38,39.

突变注释

使用Oncotator（Ramos）对体细胞点突变和indels进行注释等，提交），整合了来自公共数据库的信息，包括UCSC Genome Browser的UCSC Genes track⁴⁴，miRBase版本15⁴⁵，dbSNP内部版本132⁴⁶，UCSC Genome Browser的ORegAnno轨道⁴⁷，UniProt版本2011_03⁴⁸和COSMIC v51⁴⁹.

使用ABSOLUTE算法将突变分为杂合子或纯合子（Carter等。，按）。ABSOLUTE将来自SNP阵列的全基因组拷贝数数据和体细胞突变的等位基因分数值整合到肿瘤中的模型基因和突变拷贝数中。只有一部分肿瘤包含足够的拷贝数改变，以便进行分析。这些肿瘤中的突变被标注为杂合或纯合，以及克隆或亚克隆。还计算了突变多重性，即每个癌细胞突变的平均拷贝数。

RNA提取、RNA-seq样品制备、测序和处理

根据制造商的方案，使用TRIzol（Invitrogen）从冷冻癌组织中提取RNA。按照Illumina的样品制备方案制备总RNA，用于对mRNA进行配对测序，如前所述⁵⁰如前所述，使用ELAND将成对end读数与人类基因组（hg18）对齐⁵⁰使用集成基因组查看器可视化数据⁴³，并在单点定位编码区域。

DNA提取和SPOP基因分型

如前所述，使用酚氯仿提取DNA并通过乙醇沉淀法纯化¹⁴.推测基因的直接Sanger测序斯波普在使用特异性引物进行PCR扩增后，采用标准方法对所有肿瘤血型对进行体细胞突变。用于扩增和测序的引物序列单点定位在中给出补充表9.

激光捕获显微解剖（LCM）

切割、固定5µm厚的组织切片，并在涂膜载玻片上染色，然后用Arcturus进行解剖XT公司™LCM仪器（美国加利福尼亚州生命技术公司）。如Espina所述，由M.B.和K.P.进行组织染色和激光捕获Mircodissection（LCM）等。⁵¹采用红外捕获和紫外激光切割相结合的方法，以最好地恢复精确的细胞亚群。按照制造商建议的单细胞方法用全基因组扩增试剂盒（WGA4）扩增DNA（美国密苏里州圣路易斯市西格玛·奥尔德里奇）。标准PCR用于SPOP外显子6和7的靶向富集，然后进行Sanger测序。

鱼类

这个电动滑行系统重排状态和PTEN公司在提取RNA和DNA的同一肿瘤结节的组织切片上评估缺失状态。荧光原位杂交（FISH）方法TMPRSS2-ETS系统基因融合先前已有描述^9,11。我们使用ERG、ETV1、ETV4、，和预计技术成熟度5用断裂部分FISH分析确认DNA水平上的基因重排⁵².评估PTEN公司，如前所述，我们使用了一个位点特异探针和一个参考探针¹⁴。所有FISH探头均列于补充表10.

定量RT-PCR

根据制造商的说明，使用TRIzol试剂（Invitrogen）提取RNA，然后进行DNA酶处理（无DNA试剂盒；Applied Biosystems），并用于定量RT-PCR。使用ABI 7500实时PCR系统（Applied Biosystems）按照制造商的RNA-to-CT一步协议进行定量RT-PCR。每个靶点分为三份，并根据比较阈值循环CT方法（2）测定与看家基因GAPDH相关的表达水平^−ΔΔCT）。这些实验中使用的引物序列如下所示补充表9.所有实验均一式三份；结果代表了三个独立的实验。

免疫组织化学

如前所述，通过免疫组织化学证实ERG重排状态⁵³简单地说，最初的兔单克隆抗体是从Epitomics（加州伯林盖姆）获得的。使用热回收和CC1标准，即高pH Tris/硼酸盐/EDTA缓冲液（VMSI，目录号950-124）进行抗原回收。将载玻片与1:100的ERG一级抗体在室温下孵育1小时。使用ChromoMap DAB检测试剂盒（VMSI，目录号760-159）和UltraMap抗Rb HRP（VMSI）检测一级抗体。将抗Rb-HRP二级抗体在室温下施用16分钟。用苏木精II（VMSI，目录号790-2208）对载玻片进行8分钟的复染，然后在37°C下用发蓝试剂（VMSI、目录号760-2037）复染4分钟。研究病理学家（K.P.、J-M.M.、M.A.R.）对ERG蛋白表达的主观评价为阳性或阴性

SPOP wt和突变质粒

野生型SPOP来自Origene（Rockville，MD），在哺乳动物表达载体中带有C末端myc和FLAG标签。SPOP-F133V是使用QuikChange II定点突变试剂盒（Agilent）创建的。所有质粒均通过Sanger测序确认，蛋白表达通过SPOP、myc和FLAG抗体的Western blot确认。

细胞培养和转染

人类前列腺癌细胞系22Rv1、DU145和良性前列腺细胞系RWPE来自美国型培养物收集中心（弗吉尼亚州马纳萨斯）。22Rv1和DU145细胞保存在添加了10%胎牛血清（FBS）和青霉素/链霉素的RPMI 1640（Invitrogen）中。RWPE细胞保存在补充有人重组表皮生长因子和牛垂体提取物（BPE）的角质形成细胞-SFM（Invitrogen）中。

对于siRNA转染，RWPE（2.5×10⁵每口井），22Rv1（4×10⁵每口井）和DU145（2×10⁵每孔），将细胞接种在6孔组织培养板上。第二天，根据制造商的说明，使用Dharmfect 2试剂（Invitrogen）将100 nM SPOP或非靶向（对照）siRNAs（ON-TARGETplus；Thermo Scientific）转染细胞。对于质粒转染，DU145（4×10⁵每孔），将细胞接种在6孔组织培养板上。第二天，根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen）将4 ug pCMV6-WT SPOP或pCMV-SPOP-F133V转染细胞。

细胞活力和增殖测定

22Rv1（2×10^三每口井）和DU145（1×10^三用对照或SPOP siRNA或SPOP质粒转染的细胞接种在96个组织培养板中。根据制造商的说明，通过在450 nm处进行WST-1分析（Roche）读取吸光度来测定细胞活力和生长。针对每个治疗和时间点，获得了三口井的数值。结果代表了三个独立的实验。

这项工作得到了美国国家人类基因组研究所（NHGRI）大规模测序计划的支持，授予布罗德研究所（E.S.L.）U54 HG003067、科尔伯格基金会（L.A.G.）、斯塔尔癌症联合会（M.A.R.，F.D.，L.A.G）、前列腺癌基金会（M.A.R.），国防部协同奖PC101020（F.D.，L.A.G.，M.A.R.），Dana-Farber/哈佛癌症中心前列腺癌SPORE拨款NIH P50 CA090381，新研究员奖PC094516（F.D.），国家癌症研究所，早期检测研究网络U01CA111275，NCI EDRN，PNW前列腺癌SPORE P50CA097186（C.M.，P.S.N.）、国防部协同奖PC093372（T.W.，P.S.N.）、瑞士科学基金会拨款PASMP3_134379/1（J.-P.T.）和美国国立卫生研究院院长新创新者奖（DP2OD002750）（L.A.G.）。S.C.B.由美国国家卫生研究院的医学科学家培训计划（MSTP）资助。C.E.B.获得前列腺癌基金会青年研究员奖的支持。我们感谢布罗德研究所生物样本平台、基因分析平台和基因组测序平台成员的协助。我们感谢Samprit Banerjee的计算协助，感谢Robert Kim和Robert Leung对Weill Cornell前列腺癌肿瘤库的重要贡献，感谢Peter Schraml、Susanne Dettwiler和Martina Storz对UHZ队列和生物库的协助，感谢华盛顿大学快速尸检项目的成员。我们感谢密歇根大学前列腺癌SPORE（P.I.Ken Pienta）对本研究的样本贡献。我们也感谢为这些研究做出贡献的患者和家属。