鲜血。作者手稿；PMC 2013年6月5日提供。
以最终编辑形式发布为：
预防性维修识别码：PMC3672970
EMSID:EMS52071标准
JAK2V617F系列纯合子在PV和ET中常见且反复出现，但PV的特点是显性纯合子亚克隆的扩增
,1,三 ,1,三 ,1 ,1,2 ,1 ,4 ,5 ,6 ,7 ,8 ,9 ,10 ,11 ,12 ,8 ,5 ,4 ,13和1,三
安娜·L·戈弗雷
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
三英国剑桥大学干细胞研究所
埃德温·陈
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
三英国剑桥大学干细胞研究所
弗朗西丝卡·帕加诺
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
克里斯蒂娜·奥尔特曼
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
2英国剑桥阿登布鲁克医院血液科
伊冯·西尔伯
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
比阿特丽斯·贝洛西洛
4西班牙巴塞罗那Mar-IMIM医院血液科
保拉·古列尔梅利
5意大利佛罗伦萨大学血液科医疗和外科护理系
克莱尔·哈里森
6英国伦敦盖伊和圣托马斯NHS基金会信托血液学系
弗兰克·斯特格曼
8乌尔姆大学医院第三内科，德国乌尔姆
丰塔内特·比茹
9法国波尔多Français du Sang Aquitaine Limousin成立
利珀特
10波尔多大学中心医院血液学实验室和法国波尔多塞加伦大学Inserm U 1035血液学实验室
玛丽·麦克马林
11英国贝尔法斯特市贝尔法斯特市立医院血液科
Jean-Michel Boiron公司
12法国波尔多Français du Sang Aquitaine-Limousin Etablissement Haut-Levèque医院血液学系
Konstanze Döhner公司
8德国乌尔姆大学乌尔姆医院内科III
亚历山德罗·万努奇
5意大利佛罗伦萨大学血液科医疗和外科护理系
卡洛斯·贝塞斯
4西班牙巴塞罗那Mar-IMIM医院血液科
安东尼·格林
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
三英国剑桥大学干细胞研究所
1英国剑桥大学剑桥医学研究所和血液学系
2英国剑桥阿登布鲁克医院血液科
三英国剑桥大学干细胞研究所
4西班牙巴塞罗那Mar-IMIM医院血液科
5意大利佛罗伦萨大学血液科医疗和外科护理系
6英国伦敦盖伊和圣托马斯NHS基金会信托血液学系
7英国谢菲尔德皇家哈拉姆郡医院血液科
8德国乌尔姆大学乌尔姆医院内科III
9法国波尔多Français du Sang Aquitaine Limousin成立
10波尔多大学中心医院血液学实验室和法国波尔多塞加伦大学Inserm U 1035血液学实验室
11英国贝尔法斯特市贝尔法斯特市医院血液科
12法国波尔多Français du Sang Aquitaine-Limousin Etablissement Haut-Levèque医院血液学系
13英国剑桥威康信托桑格研究所
作者贡献：A.L.G.完成了研究并撰写了论文；E.C.、F.P.和Y.S.进行菌落分析和基因分型；C.A.O.执行TET2测序；B.B.、P.G.、C.N.H.、J.T.R.、F.S.、F.B.、E.L.、M.F.M.、J.-MB.、K.D.、A.M.V.和C.B.提供的患者样本和临床数据；P.J.C.为该项目提供了大量智力投入；A.R.G.指导研究并撰写论文；所有作者都审阅了手稿。
摘要
纯合的亚克隆JAK2V617F系列真性红细胞增多症（PV）比原发性血小板增多症（ET）更常见，但其发病率和意义尚不清楚。这个JAK2号机组在77例PV或ET患者中测定了6495个BFU-E在低促红细胞生成素条件下生长的突变状态JAK2V617F系列-PV阳性，在JAK2V617F系列-阳性ET和JAK2号机组外显子12突变的PV。使用微卫星PCR来绘制单个菌落内的异基因缺失断点，我们证明了JAK2V617F系列纯合性在PV和ET中都经常发生。PV与ET的区别在于显性纯合亚克隆的扩增，其选择性优势可能反映出额外的遗传或表观遗传损伤。我们的结果表明，在一个模型中JAK2V617F系列-在许多PV患者中，纯合子亚克隆导致红细胞增多，而在那些具有较小或无法检测到的纯合子突变克隆的患者中，替代机制起作用。
介绍
这个JAK2V617F系列95%的真性红细胞增多症（PV）患者和60%的原发性血小板增多症（ET）患者存在突变，1-4但导致不同疾病表型的机制尚不清楚。一些间接证据表明，通过突变JAK2增加信号传导很重要：（1）约30%的PV患者的粒细胞中发现了“纯合”序列模式，但在ET中罕见1-4; （2） 在PV患者中，JAK2V617F系列等位基因负荷与较高的血红蛋白水平和白细胞计数相关，但与较低的血小板计数相关5,6; （3） 突变体的拷贝数JAK2号机组影响小鼠模型的表型7,8; 和（4）JAK2号机组据报道，外显子12突变的信号比JAK2V617F系列和与PV相关，但与ET无关。9
纯合度JAK2V617F系列有丝分裂重组的结果，1-4在大多数PV患者中存在纯合突变BFU-E，但在ET患者中不存在。10这一观察结果提出了以下可能性：PV患者更容易形成纯合子亚克隆，或者纯合子突变细胞在PV患者中具有选择性优势，但在ET患者中没有，人们普遍认为，特定患者中的纯合子突变细胞通常是具有选择性优势的单个克隆的成员，并且JAK2V617F系列纯合子在PV发病机制中起着因果作用。然而，这个模型因几个观察结果而变得复杂：一些PV患者有非常小的纯合突变克隆10; 据报道，2名患者携带2个不同的纯合子克隆11,12; 在PV患者中发现STAT1磷酸化缺陷13; 以及少数携带纯合突变BFU-E的ET患者的报告14-16而PV患者则没有。14,15因此，我们系统地评估了纯合子突变BFU-E前体在JAK2号机组-PV和ET突变。与我们之前的研究相比，10我们使用低促红细胞生成素条件并分析了大量菌落，以最大限度地鉴定突变前体。
方法
患者选择
有关患者招募站点，请参阅补充方法（可从血液网站；请参阅在线文章顶部的补充材料链接）。这项研究得到了剑桥和东部地区伦理委员会的批准，患者出具了书面知情同意书，研究是根据《赫尔辛基宣言》进行的。患者符合英国血液学标准委员会PV或ET诊断标准。17,18临床特征见补充表1。
BFU-E分析
PBMC被镀（2.2-2.5×105细胞/mL），补充0.01或0.1 U/mL重组促红细胞生成素α（Janssen-Cilag），并在37°C下培养14-16天。通过形态学和/或胞浆鉴定BFU-E菌落。
突变筛选
通过从RLT裂解缓冲液（QIAGEN）中提取异丙醇或悬浮液中制备菌落DNA。基因分型JAK2V617F系列通过定量PCR进行19或直接测序和通过直接测序检测外显子12突变。对于TET2型分析、编码区和剪接位点用粒细胞DNA测序。补充表2中列出了底漆。
微卫星分析
荧光微卫星PCR使用公共数据库中的引物序列（补充表2）和口腔拭子或菌落中的DNA。使用3730×l DNA分析仪和峰值扫描仪1.0版软件（Applied Biosytems）进行分析。
结果和讨论
我们对77名患者共6495个BFU-E菌落进行了基因分型：30名患者JAK2V617F系列-正PV，29，带JAK2V617F系列-ET阳性，18例JAK2号机组外显子12突变的PV。所有3个疾病组均存在纯合突变前体(). 患有以下疾病的患者JAK2V617F系列-正PV()显示纯合子-突变前体的比例最高，与之前的报告一致。10,14,15,206例患者未检测到纯合子JAK2V617F系列-阳性PV（20%），尽管评估了大量菌落并使用了低促红细胞生成素条件JAK2V617F系列-纯合子前体。获得TET2型5名“纯杂合”患者中有3名报告了突变14,21但在我们的6名患者中没有发现，这表明许多此类患者没有携带TET2型突变。
比例JAK2号机组患者BFU-Es基因型JAK2号机组-突变的PV和ET每个垂直条代表1名患者，根据获得的野生型、杂合型和纯合型突变菌落的比例进行划分，绝对菌落数如上所示（WT/Het/Hom）。如图所示，BFU-E菌落在低促红细胞生成素条件下生长。（A） 30例患者的菌落基因型JAK2V617F系列-PV阳性（共2287个菌落；平均每个患者76个菌落）。（B） 29名患有JAK2V617F系列-ET阳性（共2277个菌落；平均每个患者79个）。（C） 18例患者的菌落基因型JAK2号机组外显子12突变的PV（共1931个菌落；平均每个患者107个）。（D） 纯合子患者的样本序列追踪JAK2号机组菌落中第12外显子突变。（E） 两次生长的患者示例显示基因型比例在JAK2V617F系列-正PV，JAK2V617F系列-ET阳性，以及JAK2号机组外显子12突变的PV（1和2代表独立实验）。总共有16名患者（5名“仅杂合子”）JAK2V617F系列-PV阳性患者，4名JAK2V617F系列-纯合和杂合克隆阳性PV患者，3JAK2V617F系列-具有小纯合克隆的ET阳性患者，以及4名JAK2号机组第12外显子突变的纯合克隆PV患者）以这种方式进行评估（实验之间的平均时间为13个月；范围为2-32个月），并显示杂合和纯合-突变菌落比例的再现性。
在JAK2V617F系列-阳性ET和JAK2号机组外显子12突变的PV，JAK2V617F系列-纯合子菌落在患者中的检出率高得惊人（分别为52%和44%）。纯合克隆尺寸较小；在第12外显子突变的PV中，纯合子与这两种基因都相关K539升-类型和E543删除-类型突变(). 在两次不同的测试中，16名患者的杂合和纯合突变菌落的相对比例随着时间的推移保持稳定(; 和数据未显示）。因此，纯合子突变型BFU-E在许多患有JAK2V617F系列-正PV，JAK2V617F系列-ET阳性，以及JAK2号机组第12外显子突变的PV，在后2种疾病中比之前认识到的更频繁。5,20,22,23对具有和不具有可检测纯合性的患者进行比较，未发现诊断时血液计数、可触及的脾肿大或血栓形成史方面的任何差异（曼·怀特尼U型测试/Fisher精确测试，P（P）>0.05（对于每个疾病亚组）。
确定是否JAK2V617F系列-纯合子集落是单个克隆的一部分或反映了杂合性丢失（LOH）的反复获得，使用荧光微卫星PCR在10例患者（8例PV和2例ET）的576个纯合子突变集落中绘制了染色体9p LOH的断点。1名PV患者和1名ET患者的结果如所示，其他总结如下在8例PV患者中的5例和两例ET患者中，至少鉴定出2个不同的纯合子亚克隆，这表明独立的纯合-突变克隆在PV和ET中频繁出现。重要的是，断点映射的分辨率有限（2.3-14.2 MB），因此可能低估了不同亚克隆的数量。纯合子突变克隆的高流行率可能反映了JAK2V617F在同源重组中的作用24和/或DNA损伤后细胞存活不当。25多个纯合突变亚克隆的存在与患者年龄、疾病持续时间或治疗之间没有明显关系（补充表3）。纯合子突变群体并不是从短寿命的祖细胞中产生的，因为不同的亚克隆会随着时间的推移而持续存在。患者PV24有2个亚克隆，其相对比例在10个月内保持不变（补充图1），表明它们来自早期干/祖细胞。
中9p LOH的微卫星定位JAK2V617F系列-纯合菌落（A） 68个微卫星定位JAK2V617F系列-患者PV26的纯合子菌落（患者代码与). 左侧显示了9号染色体上的微卫星标记面板（端粒和D9S2148之间的距离按比例缩放），从中为每个患者选择了信息标记。在该患者的菌落中观察到三种微卫星标记模式，表明存在3个不同的LOH断点。每个亚克隆由一条垂直线表示，表示为a（60个克隆）、B（4个克隆）或C（4个菌落），标记以绿色显示杂合性，以红色显示LOH。荧光微卫星PCR显示了3个亚克隆的2个标记（D9S925和D9S1817）的痕迹示例（右），等位基因的位置用箭头表示。（B） 微卫星定位5JAK2V617F系列-患者ET29的纯合菌落。观察到两种微卫星标记；右侧显示了2个标记（D9S43和D9S1817）的轨迹示例。（C） 微卫星测绘JAK2V617F系列-其他8例患者为纯合子集落。标记面板与面板A中的相同。与每个模式对应的菌落数量如上所示。
重要的是，PV和ET患者的不同之处在于前者含有一个主要的纯合子-突变克隆，其大小是同一患者中次要亚克隆的8-85倍(). 该观察结果表明，大多数PV患者中存在的大量纯合子突变集落并不反映大量独立亚克隆的积累，而是反映了1个显性克隆的扩张。鉴于间接证据JAK2V617F系列纯合子增强了红细胞生成，似乎许多PV患者中存在的显性克隆可能与红细胞增多症的发展有关，而其他机制在少数纯合子突变克隆较小或检测不到的患者中起作用。
PV患者显性纯合子-突变克隆的形成至少有两种解释。首先，在第二次多着丝粒有丝分裂重组事件后，显性亚克隆可能来自先前存在的次级亚克隆，其选择性优势反映了LOH区域的延伸。然而，没有显性亚克隆共有的LOH区域和次要亚克隆缺失的LOH区域(). 此外，在一些患者中，优势亚克隆的断点明显与次要亚克隆（如PV24、PV26）的断点端粒相似。因此，我们赞成另一种解释，即次要和主要亚克隆是独立产生的，后者的选择优势反映了获得额外的遗传或表观遗传变化。
致谢
作者感谢剑桥大学转化研究实验室的样本收集。
A.R.G.实验室的工作得到了白血病和淋巴瘤研究、威康信托基金会、医学研究委员会、凯·肯德尔白血病基金会、剑桥NIHR生物医学研究中心、剑桥实验癌症医学中心和美国白血病和淋巴瘤学会的支持。A.L.G.是Kay Kendall初级临床研究员。A.M.V.和P.G.由Associazione Italiana per la Ricerca sul Cancro（Milano）“特别项目分子临床肿瘤学5×1000”支持，Associa齐one Itariana per la Ricerca sul Cancro/Gruppo Italiano Malattie Mielopliferative（项目1005）支持。C.A.O.由德国研究基金会（DFG，OR255/1-1）支持。P.J.C.是Wellcome Trust的高级临床研究员。
脚注
利益冲突披露：作者声明没有相互竞争的财务利益。
本文的在线版本包含数据补充。
这篇文章的出版费用部分由页面费支付。因此，仅为了表明这一事实，根据《美国法典》第18卷第1734节，本文特此标记为“广告”。
工具书类
1Baxter EJ、Scott LM、Campbell PJ等。人类骨髓增生性疾病中酪氨酸激酶JAK2的获得性突变。柳叶刀。2005;365(9464):1054–1061.[公共医学][谷歌学者] 2Levine RL、Wadleigh M、Cools J等。真性红细胞增多症、原发性血小板增多症和骨髓样化生伴骨髓纤维化患者酪氨酸激酶JAK2的激活突变。癌细胞。2005;7(4):387–397.[公共医学][谷歌学者] 三。James C、Ugo V、Le Couedic JP等。导致构成性信号传导的独特克隆JAK2突变导致真性红细胞增多症。自然。2005;434(7037):1144–1148.[公共医学][谷歌学者] 4Kralovics R、Passamonti F、Buser AS等。骨髓增生性疾病中JAK2的获得性功能突变。N英格兰医学杂志。2005;352(17):1779–1790.[公共医学][谷歌学者] 5Vannucchi AM，Antonioli E，Guglielmelli P，等。真性红细胞增多症或原发性血小板增多症患者纯合子JAK2 617V>F突变的临床特征。鲜血。2007;110(3):840–846.[公共医学][谷歌学者] 6Passamonti F，Rumi E，Pietra D等人对338名真性红细胞增多症患者的前瞻性研究：JAK2（V617F）等位基因负荷和白细胞增多对纤维化或白血病疾病转化和血管并发症的影响。白血病。2010;24(9):1574–1579.[公共医学][谷歌学者] 7Tiedt R、Hao-Shen H、Sobas MA等。突变JAK2-V617F与野生型JAK2的比率决定了转基因小鼠的MPD表型。鲜血。2008;111(8):3931–3940.[公共医学][谷歌学者] 8Lacout C、Pisani DF、Tulliez M、Gachelin FM、Vainchenker W、Villeval JL。JAK2V617F在小鼠造血细胞中的表达导致MPD模拟人PV继发性骨髓纤维化。鲜血。2006;108(5):1652–1660.[公共医学][谷歌学者] 9Scott LM、Tong W、Levine RL等。真性红细胞增多症和特发性红细胞增生症的JAK2外显子12突变。N英格兰医学杂志。2007;356(5):459–468. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 10Scott LM，Scott MA，Campbell PJ，Green AR。V617F突变的纯合祖细胞出现在大多数真性红细胞增多症患者中，但不是原发性血小板增多症。鲜血。2006;108(7):2435–2437.[公共医学][谷歌学者] 11Schaub FX、Jager R、Looser R等。MPD中染色体20q和JAK2-V617F缺失的克隆分析表明，del20q独立作用，不是JAK2-V617F的预处理突变之一。鲜血。2009;113(9):2022–2027.[公共医学][谷歌学者] 12Schaub FX、Looser R、Li S等。TET2和JAK2突变的克隆分析表明，TET2可能是骨髓增生性肿瘤进展的晚期事件。鲜血。2010;115(10):2003–2007.[公共医学][谷歌学者] 13.Chen E，Beer PA，Godfrey AL，等。与JAK2V617F相关的不同临床表型反映了差异STAT1信号。癌细胞。2010;18(5):524–535. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 14Dupont S、Masse A、James C等。JAK2 V617F突变引发真性红细胞增多症患者原代细胞的红细胞生成素超敏反应和终末红细胞扩增。鲜血。2007;110(3):1013–1021.[公共医学][谷歌学者] 15Moliterno AR、Williams DM、Rogers O、Isaacs MA、Spivak JL。JAK2 V617F-阳性MPD的表型变异：祖细胞和中性粒细胞等位基因负荷的作用。实验血液学。2008;36(11):1480–1486. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 16Pardanani A、Lasho TL、Finke C等。将Jak2V617F和MplW515突变分析扩展到单个造血集落和B、T淋巴细胞。干细胞。2007;25(9):2358–2362.[公共医学][谷歌学者] 17McMullin MF、Reilly JT、Campbell P等，《红细胞增多症/红细胞增多病诊断和调查指南修正案》。英国血液学杂志。2007;138(6):821–822.[公共医学][谷歌学者] 18Harrison CN、Bareford D、Butt N等。血小板增多症成人和儿童的调查和管理指南。英国血液学杂志。2010;149(3):352–375.[公共医学][谷歌学者] 19Levine RL、Bellisle C、Wadleigh M等。基于X灭活的克隆性分析和JAK2V617F定量评估揭示了PV中的克隆性与JAK2C617F之间的强相关性，但与et/MMM无关，并确定了JAK2V17F阴性et和MMM患者的一个子集，即克隆性造血患者。鲜血。2006;107(10):4139–4141. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 20Li S、Kralovics R、De Libero G、Theocharides A、Gisslinger H、Skoda RC。JAK2第12外显子和JAK2-V617F突变的真性红细胞增多症患者的克隆异质性。鲜血。2008;111(7):3863–3866.[公共医学][谷歌学者] 21Delhommeau F、Dupont S、Della Valle V等。髓系肿瘤TET2的突变。N英格兰医学杂志。2009;360(22):2289–2301.[公共医学][谷歌学者] 22Kittur J、Knudson RA、Lasho TL等。原发性血小板增多症JAK2V617F等位基因负荷的临床相关性。癌症。2007;109(11):2279–2284.[公共医学][谷歌学者] 23Carobbio A、Finazi G、Antonioli E等，JAK2V617F等位基因负荷和血栓形成：原发性血小板增多症和真性红细胞增多症的直接比较。实验血液学。2009;37(9):1016–1021. [PMC免费文章][公共医学][谷歌学者] 24Plo I、Nakatake M、Malivet L等。JAK2刺激同源重组和遗传不稳定性：骨髓增生性疾病异质性的潜在含义。鲜血。2008;112(4):1402–1412.[公共医学][谷歌学者] 25Zhao R，Follows GA，Beer PA，等。骨髓增生性疾病中Bcl-xL脱酰胺途径的抑制。N英格兰医学杂志。2008;359(26):2778–2789.[公共医学][谷歌学者] 
