常驻间充质细胞与纤维化^✩

摘要

1.简介

慢性或重复损伤后受损组织的修复对生存至关重要。修复过程通常包括两个不同的步骤：再生阶段，受损细胞被相同类型的细胞替换，不会留下持续的损伤证据；以及纤维化阶段（也称为瘢痕形成），结缔组织取代正常的实质组织[1]. 虽然最初是有益的，但正常伤口愈合反应的失败会导致慢性病，导致全世界数百万人的发病率和死亡率，早期可能无症状。在美国，据估计，器官纤维化是高达45%的自然死亡的促成因素[1].

尽管纤维化根据损伤组织有不同的病因和临床表现，但它是一种常见的病理反应：在所有情况下，它的特点是持续产生生长因子、蛋白水解酶、血管生成因子和纤维生成细胞因子，导致进行性和过度生产，纤维细胞外基质（ECM）成分的沉积和收缩，是基质重塑的过程。纤维状ECM的产生可能是组织对限制器官损伤或维持组织结构的反应。然而，在纤维化没有停止和解决的情况下，纤维ECM的积聚和收缩会导致组织结构的扭曲。这不仅是运动器官的主要问题(例如心脏和肺部），也适用于相对静止的器官(例如.肾脏和肝脏）。围绕实质单位（例如肾单位）的间质的扩张和硬化会破坏生理功能和毛细血管微灌注。此外，负责纤维状ECM沉积的细胞，即肌成纤维细胞和相关的炎性白细胞，直接损伤包括毛细血管在内的组织，从而促进器官衰竭。

纤维蛋白增生性疾病(即纤维化和纤维生成细胞增殖）可能影响任何实体器官的组织，包括皮肤、肾脏、肌肉、肺、心脏和血管系统、中枢神经系统、眼睛、肝脏、胰腺和肠道。许多牵涉到纤维生成的常见疾病目前只有很少或根本没有治疗方法，并且主要是通过支持性措施进行治疗。目前，没有针对美国食品和药物管理局批准使用的纤维生成过程的治疗药物，只有少数在欧洲和日本获得许可。尽管如此，基于靶向纤维化级联关键参与者的有效抗纤维化治疗的前景是极好的，并且迫切需要。

本综述的重点是在纤维形成中观察到的瘢痕形成细胞，即肌成纤维细胞（有时是疾病相关的成纤维细胞）及其前体(图1). 我们将首先描述炎症因子以及对局部实质细胞的损伤如何增强其激活。然后，我们将讨论几个不同的实验模型的研究，这些实验模型为肌成纤维细胞在纤维发生过程中的起源提供了证据。最后，我们将讨论本研究产生的潜在治疗途径。

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图1

伤口愈合概述：组织再生或纤维化。各种损伤引起的上皮和/或内皮损伤释放炎症介质，引发抗纤溶性凝血级联反应，从而触发血栓形成。随后是炎症期，在此期间白细胞在损伤部位聚集。受损的上皮和/或内皮也可以直接激活周细胞-肌成纤维细胞的转换。然后，来自周细胞/常驻成纤维细胞/间充质细胞的肌成纤维细胞产生纤维细胞外基质成分。胶原纤维组织化，血管恢复正常，瘢痕组织消除，上皮细胞和/或内皮细胞分裂并迁移，以再生受损组织。然而，持续的炎症可导致慢性肌成纤维细胞活化和ECM成分的过度积累，最终导致纤维化。

2.炎症与纤维化的关系

急性和慢性炎症反应在许多不同器官中触发肌成纤维细胞的激活中起着重要作用(图1). 急性炎症是对有害物质的快速反应，而慢性炎症是一个持续时间较长的过程，炎症级联持续数周或数月。在急性炎症中，上皮和/或内皮细胞暴露于有害刺激，如细菌、毒素或治疗药物，会激活炎症伤口愈合反应，导致原纤维ECM成分在受影响组织中暂时过度沉积。尽管现代文献表明，在许多情况下，即使是这种解决方案也可能是不完整的，但这种过剩的ECM被认为在很大程度上得到了解决[2,三]. 相反，致病性纤维化是由持续的炎症触发因素引起的，是炎症、组织破坏和修复过程同时发生的病理机制。

3.肌成纤维细胞在纤维化中产生致病性纤维ECM

虽然许多细胞类型都有可能产生和分泌ECM，包括上皮细胞、内皮细胞和白细胞，但肌成纤维细胞产生各种形式纤维化中观察到的致病性纤维胶原基质。特别是，肌成纤维细胞沉积I型和III型胶原，这些胶原存在于纤维化器官中，也沉积IV型胶原、糖胺聚糖、硫酸乙酰肝素蛋白聚糖和糖蛋白，如层粘连蛋白和纤维连接蛋白。

肌成纤维细胞最初被称为“伤口成纤维细胞”，1972年通过电子显微镜对皮肤创伤的研究首次定义，其特征是有丰富的粗面内质网、椭圆形和斑点状细胞核、纺锤形细胞体和无溶酶体[6,7]. 通过中间丝结蛋白、波形蛋白和收缩蛋白αSMA（在人类中，是肌动蛋白家族中目前确定的六种蛋白之一）的表达，对其进行生化定义。αSMA也存在于血管平滑肌细胞（vSMCs）和其他间充质来源的细胞中[8]. 目前的研究通过αSMA的表达来区分“疾病相关成纤维细胞”和肌成纤维细胞，但根据物种、所研究的器官和细胞激活程度，这些重叠的名称代表同一类型的细胞。肌成纤维细胞在形态上也以应激纤维的形成为特征，在生理上以其收缩组织的能力为特征。事实上，当细胞变得更具收缩性时，经常观察到αSMA并入肌动蛋白-肌球蛋白机制[9,10]. 这是细胞收缩的一个重要特征，增加了组织内的等长张力[10–13].

特别是在肝脏和肾脏，间质肌成纤维细胞的过度活动是几乎所有慢性疾病的聚集点。肌成纤维细胞活性是重要因素的其他疾病包括心肌梗死、慢性阻塞性肺病、糖尿病、慢性结肠炎、动脉粥样硬化、中风和硬皮病等皮肤病。

4.常驻间充质前体细胞是多器官肌成纤维细胞的主要来源

4.2. 肾脏中的肌成纤维细胞祖细胞

肾损伤后周细胞的命运最初是通过仔细分析小鼠I型胶原α1表达模式和基于转录因子叉头盒D1（Foxd1）的遗传命运图来确定的(图2–三) [19,21]. 首先，Lin等人分析了转基因小鼠，其中启动子胶体α1GFP的驱动表达(胶体α1-GFP^玻璃钢老鼠）[21]. 观察到周细胞从毛细血管分离，迁移到间质，显著上调I型胶原α1的表达，并在损伤后重新表达硫酸软骨素蛋白多糖标记物NG2和αSMA：从形态学和生物化学角度来看，这些周细胞现在与肌成纤维细胞没有区别。动力学建模强调周细胞增殖和细胞周期动力学与纤维化期间观察到的肌成纤维细胞总数一致。Humphreys等人生成Foxd1-Cre；罗莎26胚胎发育期间间充质细胞被永久标记的转基因小鼠[19] (图3). 已知Foxd1可调节未分化的后肾间充质在肾脏发育早期转变为间充质细胞，因此可作为间充质起源的标志物。在Foxd1-GCE公司小鼠（GCE:GFP-Cre雌激素受体），GFP-CreER^T2段融合蛋白在细胞核中只能在LoxP位点重组基因组DNA；只有当内源性Foxd1基因激活（胚胎早期肾脏发育期间）或外源性应用雌激素受体（ER）激动剂他莫昔芬时，才会发生这种情况。在非纤维化肾脏中，髓质和皮质间质细胞均检测到LacZ（半乳糖苷酶）的强表达。这些细胞不表达αSMA或内皮标记物，但对CD73（胞外-5′-核苷酸酶；间充质血统标记物）和周细胞标记物PDGFRβ呈阳性。作者得出结论，这些细胞与Lin等人在胶体α1-GFP^玻璃钢老鼠[19]. 这些细胞在急性肾损伤后数量增加，并表达αSMA。事实上，这些小鼠中几乎100%的αSMA细胞也对LacZ呈阳性反应，这强烈表明纤维化肾脏中的大多数（如果不是全部）肌成纤维细胞来自Foxd1祖细胞。为了增加实验的严格性，使用了另一种命运追踪方法。三苯氧胺（雌激素受体配体）用于诱导LacZ在FoxD1-核心^T2段老鼠。在胚胎第10.5天应用三苯氧胺，可诱导20%的基质细胞呈LacZ阳性。这些细胞随后被追踪为成人肾脏中20%的Foxd1衍生周细胞。肾损伤后，周细胞扩大15倍，开始强烈表达αSMA；损伤前细胞无αSMA表达。引人注目的是，根据三苯氧胺诱导的细胞的原始比例，这种LacZ+细胞群体占总肌成纤维细胞群体的20%。

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图2

正常人肾活检标本和肾组织中周细胞的特征Coll-GFP公司^玻璃钢小鼠肾皮质。（A） 正常成人肾皮质，胶原蛋白Iα（1）蛋白免疫染色。请注意，胶原蛋白Iα（1）蛋白在肾小球足细胞（箭头）和毛细血管的血管周细胞中强烈表达（箭头）。（B） 正常成人Coll-GFP公司^玻璃钢肾皮质，GFP免疫染色。Coll-GFP公司^玻璃钢小鼠表达GFP受Coll1α1启动子，所以GFP蛋白表达表明Coll1α1转录。请注意，GFP表达细胞（肾小球足细胞（箭头）、血管周细胞（箭头所示）Coll-GFP公司^玻璃钢老鼠和Coll1α1-在人肾皮质表达细胞。因此，Coll绿色荧光蛋白^玻璃钢小鼠是人类肾脏中产生胶原蛋白Iα（1）蛋白的所有细胞的忠实报告者。（C） 大脑皮层的四色共焦图像Coll-GFP公司^玻璃钢小鼠肾脏毛细血管基底膜特异性蛋白层粘连蛋白α4（红色）和内皮标记物CD31（白色）染色。注意，许多GFP+细胞缺乏内皮、上皮或白细胞标记物（未显示），沿着毛细血管形成广泛的过程。注意与内皮细胞体的直接相互作用（箭头），注意Coll-GFP+过程通过毛细血管基底膜的裂口（箭头）。

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图3

使用Foxd1祖细胞在正常成人和损伤肾脏中的命运定位结果Foxd1-Cre；罗莎26-td番茄R鼠标。（A） 显示交叉的模式Foxd1-Cre系列重组酶等位基因Td番茄由通用启动子驱动的报告基因罗莎26轨迹。大鼠仅在激活细胞中重组Rosa基因座的基因组DNA福克斯1转录因子基因与肾脏发生。（B） 将Foxd1-Cre系列和罗莎26-tdTomatoR等位基因Coll-GFP公司^玻璃钢在一只小鼠中，表明肾脏Foxd1谱系的血管周细胞与Coll-GFP+周细胞（箭头）几乎完全重叠。图像显示肾皮质和肾髓质。注意，小动脉中的血管平滑肌细胞不表达Coll1α1（箭头所示）。（C） 在肾损伤中Foxd1-Cre；罗莎26-tdTomatoR小鼠（图示为UUO d7），血管周围成纤维细胞和周细胞数量增加。然而，现在所有增加的间质Foxd1祖细胞衍生细胞共同表达αSMA，该标记物将这些细胞定义为肌成纤维细胞。

最近，Asada等人从早期发育的时间点研究了肾周细胞[41]. 他们在胚胎发生期间将髓鞘蛋白零（P0细胞）从神经嵴定位到后肾间质。P0在胚胎早期迁移的神经嵴细胞和雪旺细胞中表达，雪旺细胞也起源于胚胎后期的神经脊。作者证明，成年健康小鼠肾脏中的大多数促红细胞生成素生成纤维母细胞来源于在胚胎发育期间（从E13.5开始）渗入肾脏的P0+细胞。他们还证明，在三种不同的肾纤维化模型中，作为对损伤的反应，P0+成纤维细胞失去产生促红细胞生成素的能力，而成为肌成纤维细胞。此外，神经保护剂的给药恢复了这些细胞产生红细胞生成素的能力，并减轻了纤维化。考虑到发育中肾脏中P0-Cre命运映射细胞在Six2+祖细胞周围聚集，并且这些细胞与Foxd1-PDGFR+细胞重叠，而Foxd1-PDGFR=细胞以前被认为在肾纤维化的发展中起重要作用，有强烈的迹象表明Humphreys等人描述的Foxd1衍生的细胞与Asada等人描述的细胞相同。

5.外周细胞结构和鉴定

周细胞是一种壁细胞，其定义是为血管提供营养和机械支持，周细胞来源于包括皮肤和肾脏在内的几个器官中的Foxd1相关间充质[59]. 与vSMC相反，周细胞与内皮细胞共享基底膜，可以直接接触通过扩展的细胞过程：这是周细胞的一个关键形态学特征。内皮细胞和周细胞通过毛细血管基底膜上被称为“钉-套”连接的中断进行接触[60] (图4). 这些是细胞质内陷，可能包含紧密连接、间隙连接和粘附连接以及整合素[60,61]. 正是基底膜和管座的不连续性使得内皮细胞和周细胞之间存在密切的信号传递关系；包括电信号和接收器-信号[62].

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图4

周细胞在微血管中的定位。（A） 健康组织中周细胞-内皮相互作用示意图。周细胞是存在于微血管中的间充质细胞，部分覆盖毛细血管内皮细胞。周细胞具有长的膜突起，部分或全部嵌入毛细血管基底膜（CBM）中，与内皮细胞共享。CBM通常是不完整的，允许细胞与内皮细胞直接接触。在这里可以形成许多连接，包括被称为peg和socket过程的细胞质内陷。人们认为，钉和插座有助于促进内皮细胞和周细胞之间的双向沟通，包括PDGF–VEGF信号。（B） 作为对损伤或创伤的反应，周细胞从毛细血管中分离、增殖并开始沉积病理性纤维基质。在此过程中，CBM被降解，内皮细胞失去周细胞的支持（包括其机械支持、周细胞VEGF分泌和其他营养信号）。（C） 周细胞脱落有两个主要后果。首先，受损器官留下稀薄的微血管，毛细血管广泛脱落（示意图显示其数量减少）。器官中产生的缺氧可以反馈产生更多的纤维生成信号。其次，周细胞/肌成纤维细胞沉积的胶原和层粘连蛋白扭曲了实质组织结构（例如，肾脏中的肾单位），并硬化了这些功能组织之间的间隙，阻碍了它们的正常功能。

虽然尚未检测到周细胞的真正特异性生物标记物，但它们确实表达血管生长因子血管生成素-1和血管生长因子（VEGF），以及发育中重要的PDGF受体α和β[30,63]. 它们还表达许多与间充质干细胞相关的标志物，包括CD44、CD73、CD105和CD146[64]. 值得注意的是，细胞在成为肌成纤维细胞后继续表达PDGFRβ，相反，周细胞甚至可以在健康组织中表达I型胶原转录物[21]. 此外，周细胞可变地表达一些神经标记物，包括NG2、突触蛋白、GFAP和p75神经生长因子受体（NFGR）。

最近在肾脏的一项研究确定了两种新的周细胞标记物，ADAMTS1和TIMP3（分别为：一种具有血小板反应蛋白基序-1的去整合素和金属蛋白酶；以及金属蛋白酶组织抑制剂3），这两种标记物可能在周细胞向肌成纤维细胞的转变中具有功能意义。在体外通过培养的周细胞稳定内皮管网络（本质上是一个重建的毛细血管）的实验，发现TIMP3可以促进稳定，而ADAMTS1则会阻碍稳定。除了验证两个潜在的周细胞标记物外，本研究还阐明了周细胞对血管稳定的重要性[65].

6.周细胞与微血管的相互作用

如前所述，共焦显微镜可以获得周细胞从毛细血管床上脱落的高分辨率图像[20]. 从最近的一项研究中可以清楚地看到，这种脱离是周细胞-内皮细胞信号传导失控的一种功能[30]. 周细胞在其细胞表面表达PDGFR-β并分泌VEGF；内皮细胞相互作用，在细胞表面表达VEGF受体2，并分泌PDGF。当这些受体中的任何一个被阻断时，肾损伤期间的纤维化和毛细血管稀疏都会得到改善。有趣的是，在疾病进展过程中，周细胞从产生血管生成性VEGF164亚型转变为分泌血管生成障碍性VEGF120和VEGF188亚型。此外，VEGF或PDGF受体通路的阻断会导致周细胞分化和增殖的相应中断，但VEGFR2的阻断也会导致巨噬细胞招募减弱[30]. 这一结果诱人地暗示了炎症、毛细血管和纤维化损伤之间的一种新的功能联系：随着我们对周细胞生物学的理解，这一范式可能会不断发展。在另一个交叉交谈的例子中，内皮细胞通过旁分泌释放PDGF-BB和肝素结合表皮生长因子（HB-EGF）在血管生成过程中招募周细胞[66].

参与周细胞脱离的生物力学和信号转导途径尚待完全阐明。这可能涉及整合素、黏着斑激酶（FAK）、p21蛋白活化激酶（PAK）和肌动蛋白-肌球蛋白细胞骨架之间的复杂相互作用。毫不奇怪，鉴于其对细胞骨架的既定作用，GTPase蛋白的Rho家族已被证明在（视网膜）周细胞收缩性以及对内皮细胞的旁分泌作用中发挥作用[67]. 然而，本研究依赖于通过抑制下游Rho激酶（ROCK1/2）和过度表达Rho突变体（例如，不区分RhoA、RhoB和RhoC）间接描述Rho途径。Rho家族是一个大家族，至少有20种哺乳动物亚型，它们之间的精细相互作用决定了细胞行为[68].

周细胞-CBM的确切性质以及周细胞-内皮细胞的协调需要进一步研究(图4). 然而，众所周知，内皮细胞周细胞募集伴随着整合素型α5β1、α3β1、β6β1和α1β1的表达增加，整合素结合纤维连接蛋白、巢原、层粘连蛋白亚型和IV型胶原[69].

7.纤维生成中的上皮细胞信号

最近的命运图研究表明，尽管上皮-间充质转化（EMT）可以发生在体外，它不会促进肌成纤维细胞的出现体内[19,20,34]. 然而，研究明确表明，损伤的上皮细胞可以直接触发许多器官的纤维化。例如，在成人肾损伤中，除了内皮细胞外，损伤的上皮细胞还产生PDGF和TGFβ1，TGFβ1activator integrinαvβ6仅限于肾上皮[70–74]. TGFβ1的上皮表达增加伴随着上皮本身中细胞内典型（Smad）和非典型（PAK2、c-Abl、Akt、tubin和mTorC1）信号通路的激活[75,76]. 阻断TGFβ1及其下游效应物可减轻肾脏损伤和纤维化[75–78]然而，在没有EMT证据的情况下，肾脏上皮细胞中TGFβ1的转基因过度表达足以触发间质性肾纤维化[35,79]. 此外，最近的一项研究表明，受损肾上皮释放的TGFβ1可以激活周细胞中典型的Smad通路，从而激活成肌纤维细胞[80]. 因此，受损的上皮细胞是配体的来源，配体是驱动纤维生成的重要因素。此外，上皮细胞是促炎性细胞因子和趋化因子的重要来源，它们直接促进几个器官的纤维化[81].

8.治疗纤维化的治疗方法：靶向周细胞和肌成纤维细胞

虽然纤维化曾一度被认为是一种进行性和不可逆转的疾病，但动物模型和人类研究的数据提供了明确的证据，证明纤维化至少可以部分逆转。现在有一些临床证据表明，纤维化可以在各种慢性肝病中消退，无论是在停止肝损伤原因还是治疗潜在疾病时都可以观察到；但证据有限或存在争议，通常基于小型回顾性队列研究[82]. 在肾素-血管紧张素系统阻断剂治疗后的实验模型中，慢性肾脏疾病的纤维化也得到了消退[83]. 然而，这些结果与大规模的人体研究相比，肾素-血管紧张素系统阻断可以减缓肾功能丧失的速度[84]. 术语“逆转或可逆性”通常用于暗示纤维化建立后正常结构的完全恢复。一个更好的术语应该是纤维化的“回归”，表示纤维化的含量比早期减少，而不量化回归的程度，也不表示组织学已经完全恢复正常。

迄今为止，尽管对有效抗纤维化药物的巨大医疗需求尚未得到满足，但大多数潜在药物产品仍在进行临床试验，以证明其疗效和安全性。在以肌成纤维细胞或其释放的生长因子表达的受体为靶点的潜在药物中，吡非尼酮是一种口服活性p38激酶抑制剂，可降低TGF-β1和TNF-α的活性在体外它是欧洲和日本（但不是美国）批准用于治疗特发性肺纤维化的第一种抗纤维化药物[85]. 治疗性TGF-β1中和抗体也已开发出来，并在肺纤维化小鼠模型上进行了测试[86]. Fresolimumab（GC1008）是一种灭活所有形式TGF-β1的人类单克隆抗体，Genzyme正在进行临床试验，以治疗局灶节段性肾小球硬化患者[87]; 还探讨了其在系统性硬化和特发性肺纤维化中的应用。

正在进行的试验正在调查甲磺酸伊马替尼（imatinib mesylate）的潜力，这是诺华公司销售的一种小分子酪氨酸激酶抑制剂，可抑制PDGFRs（以及c-Abl和c-kit）的信号传导，用于治疗肾源性系统性纤维化[88]以及新一代酪氨酸激酶抑制剂治疗肺纤维化。一种以CTGF蛋白为靶点的全人源化中和单克隆抗体被用于治疗糖尿病肾病的临床试验，CTGF蛋白质被认为是一种重要的促纤维化因子，同时也是TGFβ1作用的下游效应器和合作介质[89]以及原发性肺纤维化。然而，有证据表明，针对最近确定的通路的其他分子在临床上正在取得进展。读者可以参考最近一篇优秀的综述，其中广泛讨论了这些药物[90].

9.结论

在所有纤维化病例中，致病性肌成纤维细胞主要来源于常驻间充质细胞。这些细胞几乎存在于所有组织中，相应的命名也各不相同。当定位于微血管时，它们被称为周细胞。所有常驻间充质细胞通过激活其发育过程中的休眠基因，如αSMA和NG2，并迁移到损伤部位，对损伤作出反应。在这里，他们开始沉积胶原纤维和层粘连蛋白，这是纤维化的特征。这样一种观点——一种细胞类型分化为肌成纤维细胞以应对损伤——为我们展示了一种统一的全身纤维化模型的前景。

致谢

脚注

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