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临床投资杂志。2013年6月3日；123(6): 2380–2394.
数字对象标识：10.1172/JCI66904
预防性维修识别码：PMC3668809
PMID：23563311

平滑是成人肝脏修复的主要调节器

格雷戈里·米歇洛蒂,1 谢冠华,1 马尔泽娜·斯威德斯卡,1 史蒂夫·S·崔,1 游戏卡拉卡,1 莱恩迪·克鲁格,1 理查德·普雷蒙特,1 刘洋,1 Wing-Kin同步,1,2 丹尼尔·梅茨格,三和安娜·梅·迪尔1
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摘要

当再生过程不能跟上细胞死亡的步伐时，功能性上皮被疤痕取代。瘢痕的特征是纤维基质过度堆积，以及在成功伤口愈合期间短暂积聚的细胞类型持续生长，包括肌成纤维细胞（MF）和祖细胞。这表明通常引导这些细胞修复受损上皮的信号被解除了调控。为了评估这种可能性，我们在表达MF相关基因α座椅模块组件令人惊讶的是，阻断MFs中典型的Hh信号不仅可以抑制肝纤维化，还可以阻止肝祖细胞的积聚。通过对其他3株小鼠的血统追踪研究，结合使用流式细胞术、免疫荧光共聚焦显微镜、RT-PCR和原位杂交分析高纯度HSC制剂，确定Hh敏感的肝星状细胞（HSC）是MF和祖细胞的来源。结果表明，SMO是肝上皮再生的主要调节因子，其能够促进HSC衍生MF亚群中具有多能干祖细胞特征的间质-上皮转化。

介绍

肝硬化是所有慢性肝病的致命终点，由于最近慢性病毒性肝炎和肥胖相关肝病的流行，肝硬化正以惊人的速度增长(1)。当再生过程不能跟上肝细胞死亡的步伐时，就会发生肝硬化，导致功能性上皮逐渐替换为瘢痕(2,三)。肝纤维化是肝硬化的特征，而纤维化（即瘢痕化）被认为是导致肝功能和血流变化的原因，从而导致肝脏相关的发病率和死亡率(三,4)。由于旨在逆转纤维基质过度堆积的医疗干预措施不成功，肝移植是唯一可用的治疗方法。然而，由于供体器官相对缺乏，绝大多数肝硬化患者无法进行移植。预计供需之间的差距将扩大(1)除非开发出改善慢性损伤肝脏再生的治疗方法，否则肝硬化死亡人数将增加。成功需要更好地理解在慢性损伤期间控制功能性肝上皮重建的机制。

瘢痕的特征是胶原蛋白基质过度积累，以及在成功伤口愈合过程中短暂积累的细胞类型持续生长，包括MF和祖细胞(1,5)。这两种细胞类型都介导肝脏修复的关键方面。除了产生和重新吸收基质外，MFs还是肝上皮祖细胞营养因子的重要来源(5,6)。反过来，后一种细胞不仅分化为替代死亡的肝上皮细胞，还产生控制MF种群的可溶性因子(7,8)。由于MFs和肝上皮祖细胞在瘢痕形成区域聚集在一起，肝硬化患者通常会解除自分泌/旁分泌信号，该信号通常引导这些细胞修复受损的肝上皮细胞。由于损伤相关因素的过多以及由此产生的创伤修复反应的复杂性，确定驱动解除管制修复的精确信号通路和特定细胞类型一直是一项挑战。

刺猬（Hedgehog，Hh）是一种多效性、形态发生的信号通路，在胎儿发育期间协调组织生长，在各种原因的损伤期间活跃于成人肝脏(9,10)。Hh信号在成年期受到严格调控。健康肝脏几乎不表达Hh配体，成熟肝细胞和胆管细胞都不显示活跃的Hh信号(11–13)。然而，当受到致命应激或某些损伤相关细胞因子的影响时，这两种类型的成熟肝上皮细胞都开始产生Hh配体(7,14)。这些配体从受伤的产生配体的上皮细胞扩散出去，进入胆管和肝窦，激活排列在这些结构中的有活力的Hh反应细胞。后者包括Diss空间中的常驻周细胞（也称为肝星状细胞[HSCs]）和Hering管沿线的祖细胞。Hh途径激活刺激HSC成为增殖性纤维原性肌成纤维细胞（MFs）。它还促进肝祖细胞的生长和存活。反过来，HSC-衍生MF（MF-HSC）和肝祖细胞也会产生Hh配体，用这些因子进一步丰富受损的肝微环境(10).

Hh配体与Hh应答细胞表面的跨膜受体Patched（PTC）相互作用，从而沉默信号活性辅受体Smoothened（SMO）的PTC抑制。激活的SMO促进胶质瘤（Gli）家族转录因子的稳定和核定位，这些转录因子调节Hh靶基因的表达，控制细胞活力、生长和分化(9)。除了Hh配体-PTC相互作用外，SMO活性还通过多种途径进行调节，包括G蛋白偶联受体和TGF-β/TGF-β受体相互作用(15–17)。Gli因子也由SMO非依赖性（即非经典）机制控制，该机制由其他损伤相关因子启动，包括关键的促纤维化细胞因子TGF-β(16–18).

经典SMO-依赖性Hh信号和SMO-非依赖性机制对受损成人肝脏正常再生的相对重要性尚不清楚。然而，新的证据支持典型Hh信号在成人肝脏修复中的重要作用。对用SMO药物拮抗剂进行全身治疗的小鼠的研究表明，急性激活典型Hh通路对肝上皮再生是必要的(19)但也表明持续的SMO激活促进瘢痕形成(20)。经典Hh信号传导对肝脏修复的这些差异作用的基础尚不清楚。对这个问题的进一步研究是有道理的，因为替换受损的肝上皮而不留下疤痕似乎取决于SMO活性的适当调节。

结果

αSMA中SMO的条件性破坏+细胞干扰MFs中的Hh信号。

为了研究Hh-responsive MFs在成人肝脏修复中的作用，我们使用Cre-LoxP系统破坏表达MF相关基因α-平滑肌肌动蛋白（α座椅模块组件)。由于常驻HSC既具有Hh反应性，又是肝损伤期间MF的主要来源，因此首先在从SMO-flox小鼠中获得的原代HSC中测试了Cre介导的SMO重组的功效，这些HSC是为了使其转变为MF而培养的，然后用表达GFP的对照腺病毒或携带Cre重组酶的腺病毒进行处理。与新分离的（第0天）HSC相比，培养的HSC经AdGFP处理后，其表达增加平滑（Smo），几个Hh调节基因(Gli1公司,Gli2公司、和私人投资公司)，前上皮-间充质转化（前EMT）转录因子、SNAIL和MF基因，如α座椅模块组件和胶原蛋白1α1(第1a1列)。相反，对抗EMT的基因表达(Bmp7型，E-钙粘蛋白[CDH公司]和促结蛋白[Dsp公司])和标志HSC静止的基因(Gfap公司和Pparg公司)低于新鲜分离的HSC。用AdCre处理培养激活的HSC显著抑制平滑（Smo）Hh靶基因mRNA表达减少，蜗牛和MF基因，而拮抗EMT的基因被诱导，HSC静止标记物被上调（图​（图1A）。1A） ●●●●。正如预期的那样，敲低MF-HSC中的SMO阻止了重组Sonic hedgehog配体诱导Hh-调节转录因子或增加MF基因的表达（补充图1；本文在线提供的补充材料；doi:2017年10月10日/JCI66904DS1)。因此，总的数据验证了该方法抑制SMO的有效性，并证明MF-HSCs需要激活SMO才能完成典型的Hh信号传导并在培养中保持促纤维生成表型。

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αSMA中SMO的条件性破坏+细胞抑制MFs中的Hh信号。

(A类)从Smo-flox小鼠中分离出HSC。在培养第4天添加AdGFP或AdCre（MOI 25），3天后收获细胞。通过qRT-PCR评估对基因表达的影响。结果归一化为第0天的HSC*P（P）< 0.05. 插图显示Cre和tubulin表达的典型Western blot。(B类)漂浮SMO等位基因的寡核苷酸（参考文献。56,63; 补充表3）用于区分未排列的等位基因（Smoc（c）; 1.7 Kb）来自Cre-recombined null等位基因（Smon个; 0.5 Kb）。从用载体（VEH，n个=3）或TMX(n个=4）BDL和Smo后第4–10天n个和Smoc（c）扩增产物被扩增。通过密度测定法对扩增产物进行定量，以评估Cre介导的重组效率。结果表示为Smon个/平滑（Smo）n个+平滑（Smo）c（c）x 100，显示在每条车道下方。(C类)假手术或BDL后14天，从载体和TMX处理的DTG小鼠的肝脏中分离总RNA。SMO表达通过qRT-PCR进行评估，结果表示为折叠假手术加载体对照*P（P）< 0.05. (D类)肝脏GLI2的代表性免疫组织化学。GLI2型+在假手术组和BDL组中，对车辆治疗和TMX治疗的DTG小鼠的细胞进行量化，并用每个场的阳性细胞数表示(n个=11/组；原始放大倍数，×20[Sham]；×63[BDL]）*P（P）< 0.05, **P（P）< 0.01. (电子)BDL后14天，从载体和TMX处理的DTG小鼠的肝脏中分离出总RNA，并通过qRT-PCR分析Hh调节基因的表达。结果表示为折叠车处理组*P（P）< 0.05.

此外，数据支持HSC的固有可塑性，表明这些细胞同时存在上皮和间充质基因，并表明HSC根据Hh配体等环境线索调节这些基因的相对表达水平。HSC静止时上皮基因的表达占主导地位，而Hh途径激活后间充质基因的表达则占主导地位。事实上，新分离的HSC（以结蛋白标记）共表达E-钙粘蛋白，其定位于相邻HSC之间的界面（补充图2A）。尽管以前曾报道过健康肝脏HSC之间的钙粘蛋白连接(21–23)，人们普遍不认为HSC具有上皮特性。因此，我们使用免疫组织化学方法证实E-钙粘蛋白与结蛋白在成年小鼠未受损肝脏中共定位（补充图2B）。结果证明，静止的HSC（Q-HSC）在完整组织和新分离的组织中是相对上皮性的，但在培养过程中Hh信号被激活时转变为肌纤维母细胞。在培养的MF-HSC中，敲低SMO消除了Hh信号传导，这显然允许细胞恢复到其更上皮的表型。因此，在体外，HSC是能够进行EMT/间质-上皮转换（EMT/MET）的过渡细胞。随后的研究旨在确定体内是否可能发生类似的转变。

将SMO-flox小鼠与αSMA-Cre-ER杂交产生双转基因（DTG）小鼠T2段小鼠，其中αSMA启动子驱动三苯氧胺依赖性（TMX依赖性）Cre重组酶雌激素受体融合蛋白的表达(24)。TMX驱动Cre重组酶进入细胞核，删除漂浮的SMO外显子，从而选择性地消除αSMA表达细胞中的Hh信号。为了检测体内MFs中Hh信号的影响，DTG小鼠接受了为期14天的假手术或胆管结扎（BDL），以促进来自门静脉成纤维细胞（PFs）、HSC和骨髓纤维细胞的MFs在肝脏的积聚(25,26)。在第4天到第10天期间，每组中一半的小鼠接受TMX治疗，另一半接受溶媒治疗。全肝DNA的PCR分析表明，经载体治疗的小鼠中没有可检测到的转基因重排，但经TMX治疗的小鼠体内漂浮的SMO等位基因大量丢失，缺失的等位基因积累（图​（图1B）。1B） ●●●●。整个肝脏SMO表达显著下降（图​（图1C1C和补充图3），表明DTG小鼠可用于确定MFs中的Hh信号是否对体内肝脏修复重要。

与健康肝脏几乎没有Hh途径活性的事实一致，GLI2（图​（图1D）1D） SMO（补充图3）的表达在错误操作的小鼠中可以忽略不计，并且不受TMX的影响。正如BDL激活肝脏Hh信号的证据所预测的那样，BDL增加平滑（Smo）（图​（图1C1C和补充图3），并在车用DTG小鼠中诱导GLI2的核蓄积。TMX显著抑制了这一现象（图​（图1，1，C和D，以及补充图3），导致GLI2靶基因的mRNA表达降低，Gli1公司以及抑制各种GLI1调节基因，包括卷曲相关肽1(Frp1基因)和骨桥蛋白(Opn（操作）)（图​（图1E）。1E） ●●●●。因此，αSMA表达细胞中SMO的条件性破坏抑制体内Hh信号传导。

出乎意料的是，在BDL后用TMX治疗的DTG小鼠的导管细胞和门脉周围肝细胞中观察到核GLI2减少（图​（图1D）。1D） ●●●●。未成熟导管细胞和门脉周围肝细胞来源于位于Hering门脉周围通道的双功能肝上皮祖细胞(27)。因此，我们评估了非手术小鼠和BDL小鼠肝脏中α-甲胎蛋白（AFP）的表达，AFP是肝细胞祖细胞的标记物。假手术DTG控制的患者仅表现出罕见的AFP+单元格（未显示数据）。相反，BDL处理的DTG小鼠在BDL后接受载体，在门管区内和周围显示出大量AFP表达细胞（补充图4）。在许多AFP中发现GLI2的结肠化+细胞，包括从Hering样结构的管中出现的表达AFP的肝细胞。一些AFP阴性的肝细胞和导管细胞以及许多基质细胞也表达GLI2。相反，在BDL后接受TMX的DTG小鼠GLI2数量减少+细胞和AFP积累失败+BDL后的单元格。

阻断MFs中的Hh信号抑制损伤肝脏中MFs和导管细胞的纤维化和积聚。

BDL引起纤维化反应，相对于未受损肝脏而言，门静脉束增大（图​（图2，2，补充图5和6，以及参考。28)。这发生在车辆治疗的DTG小鼠中，但在TMX治疗的DTG-小鼠中显著减弱（图​（图2A2A和补充图6）。天狼星红染肝切片的形态计量学（图​（图2B），2B） ，全肝胶原mRNA表达（图​（图2C），2C） 和肝脏羟脯氨酸含量（图​（图2D）2D） 证实肝纤维化减轻。

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阻断Hh信号抑制受损肝脏的门脉扩张和纤维化。

(A类)假手术或BDL（原始放大倍数×4）后14天，对代表性载体和TMX处理的DTG小鼠的肝切片进行H&E染色。通过对所有小鼠的H&E染色切片进行形态计量学分析来评估门脉大小(n个=假载体中的4只小鼠；n个=4只假TMX小鼠；n个=BDL载具中的11只小鼠；n个=11只小鼠BDL TMX），以门脉大小的平均值±SEM表示，并相对于载体处理的假手术小鼠进行绘图*P（P）与车辆处理假手术组相比，<0.05。(B类)其他切片用天狼星红/固绿染色以显示纤维化（原始放大倍数×4）。形态测量数据显示为平均值±SEM*P（P）与BDL后的车用DTG小鼠相比，<0.05。(C类)分离肝脏总RNA第1a1列用qRT-PCR分析mRNA水平。结果表示为折叠车处理的混合操作DTG组*P（P）与车用BDL组相比，<0.05。(D类)各组肝羟脯氨酸的定量。结果表示为相对于车辆处理的混合操作DTG组*P（P）与车用BDL组相比，<0.05。

胆道梗阻引起的纤维化反应涉及各种MF和导管细胞在门脉周围的积聚(4)。因此，我们比较了表达αSMA（MFs的通用标记物）的细胞数量(6)，或角蛋白19（Krt19），导管细胞的标志物(29)，在两组中。BDL后，经车载治疗的DTG小鼠积聚了大量αSMA-和Krt19-阳性细胞。在TMX处理的DTG小鼠中，两种细胞类型的积累均受到显著抑制。免疫组化显示αSMA和Krt19的减少与α座椅模块组件和Krt19mRNA（图​（图3三).

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阻断MFs中的Hh信号抑制损伤诱导的MFs和导管细胞的积累。

DTG小鼠在假手术或BDL后用载体或TMX治疗，如方法所述。显示了αSMA、Krt19、结蛋白和弹性蛋白的代表性免疫组织化学、全肝形态计量学和全肝mRNA表达。结果表示为折叠车辆处理的混操作对照（计算机辅助形态测量）或每个场阳性染色细胞的总数(n个=11/组；原始放大倍数，×20）*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.001. 显示了从载体（白条）或TMX处理（黑条）BDL组分离的全肝总RNA中基因表达的qRT-PCR分析。结果表示为折叠车用BDL组*P（P）<0.05***P（P）<0.01。

BDL肝脏中的MF来自两个主要来源，HSC和PF(4,28)。因此，对肝脏切片进行结蛋白染色，结蛋白是MF-HSCs的标记物(30)或弹性蛋白，PFs的标志物(31)。车辆处理小鼠积累了大量的两种结蛋白+和弹性蛋白+BDL后的单元格（图​（图3）。三)。在TMX治疗的DTG小鼠中，两种细胞类型的积累均显著减少，并且相应的mRNA也受到类似的抑制（图​（图3）。三)。正如我们在平滑（Smo）在培养的MF-HSC中条件删除（图​（图1A），1A） ，删除αSMA中的SMO+BDL后的细胞增加了各种EMT抑制剂的表达，上调了Q-HSC基因（补充图7）和E-cadherin（补充图2B），表明MF-HSC在完整组织中的命运通过破坏Hh信号而改变。

MFs中Hh信号的阻断抑制了损伤肝脏中肝上皮祖细胞的积累，并导致肝萎缩。

导管细胞来源于表达转录因子SOX9的多能干祖细胞(32–35)。BDL诱导SOX9显著积累+车辆处理DTG小鼠中的细胞，但TMX处理的DTG小鼠没有（图​（图4A4A和补充图8）。如前所示（补充图4），TMX阻断了表达AFP的细胞的聚集（图​（图4B），4B） ，肝细胞前体的标记物，并降低Sox9指数,Afp公司以及各种干细胞标记，例如CD133型和纳克（图​（图44C） ●●●●。

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阻断MFs中的Hh信号抑制肝上皮祖细胞的积累，导致肝萎缩，并阻断BDL损伤后的肝细胞增殖。

(A类)BDL后14天，载体处理或TMX处理的DTG小鼠的代表性免疫染色肝切片中SOX9蛋白的表达（原始放大倍数，×20）。(B类)AFP的代表性肝脏切片免疫染色（原始放大倍数，×20）。(C类)qRT-PCR分析Sox9指数,Afp公司,CD133型、和纳克DTG动物的全肝RNA。结果表示为相对于车用BDL组的平均值±SEM**P（P）< 0.01; *P（P）< 0.05. (D类)经溶媒或TMX治疗的DTG小鼠BDL后14天，肝/体重（LW/BW）比值、血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平和完整肝组织中TUNEL阳性细胞。结果用平均值±SEM表示*P（P）< 0.05. (电子)BDL后14天，在代表性车辆治疗和TMX治疗小鼠中Ki67染色。Ki67阳性细胞被量化，并以平均值±扫描电镜（SEM）的形式绘制出与车辆处理假手术组相关的图表*P（P）与车用BDL组相比，<0.05（原始放大倍数，×20）。(F类)具有代表性的cyclin D1（CycD1）染色类似地显示，cyclin D1-阳性细胞的图示为相对于载体处理的假手术组的平均值±SEM（原始放大倍数，×20）*P（P）与车用BDL组相比，<0.05。(G公司)细胞周期蛋白D1的qRT-PCR分析(抄送1)和福克斯1全肝mRNA表达。TMX治疗BDL组的结果与载体治疗BDL的结果相关（平均值±SEM）*P（P）< 0.05.

经TMX治疗的DTG小鼠的肝脏/体重比在BDL后也有所降低（图​（图4D）。4D） ●●●●。SMO缺失可能通过加重BDL后的肝损伤而促进相对肝萎缩，但BDL相关的血清丙氨酸氨基转移酶和TUNEL数量增加+TMX治疗组的细胞没有恶化（图​（图4D）。4D） ●●●●。此外，TMX并没有增加肝脏的梗死或充血（图​（图2A2A和补充图5和6）或肝外器官（如肺或肾；补充图9和10），如果αSMA+血管平滑肌细胞发生改变。因此，不太可能因为血流改变或肝细胞死亡增加而导致肝质量恢复失败。相反，我们注意到Ki67核染色的肝细胞和导管细胞显著减少，Ki67是增殖的标志（图​（图4E）。4E） ●●●●。Hh途径激活刺激细胞周期蛋白D1和FOXM1的表达，这些因子促进细胞周期进展，并且是部分肝切除术后肝再生所必需的(36,37)。与车载治疗的DTG小鼠相比，cyclin D1表达细胞的数量和cyclin D2的全肝表达(抄送1)和福克斯1mRNA（图​（图4，4TMX处理的DTG小鼠BDL后，F和G）显著降低。因此，消除αSMA中SMO依赖的信号+细胞似乎主要抑制胆汁淤积性肝损伤的再生反应。

为了进一步研究Hh-responsive MFs在祖细胞介导的肝脏修复中的意义，我们给DTG小鼠喂食缺乏蛋氨酸胆碱、补充乙硫氨酸（MCDE）的饮食1周，以刺激肝脏脂质积聚，损伤肝实质细胞，抑制肝细胞复制，并触发MFs和未成熟肝上皮细胞的代偿性生长(8)。正如预期的那样，这引发了肝脏脂肪变性（补充图11），并触发了αSMA表达细胞在肝脏的显著积聚（图​（图5A），5A） ，结蛋白+单元格（图​（图5B），5B） ，和祖细胞（图​（图5，5、C和D）。虽然TMX对喂食对照饮食的DTG小鼠中的任何这些标记物都没有影响（数据未显示），也没有减轻MCDE饮食诱导的DTG鼠脂肪变性（补充图11），但它显著阻止了表达αSMA、结蛋白、AFP、，和SOX9，并且在喂食MCDE饮食的DTG小鼠中这些标记的mRNA表达降低（图​（图5，5，A–D）。如BDL小鼠（图​（图4D），4D） ，抑制MCDE饮食中MF和祖细胞的积累–喂食小鼠的肝脏/体重比降低（图​（图5E）。5E） ●●●●。同样与BDL小鼠的研究结果一致，SMO的缺失导致Hh调节基因的表达降低Gli2公司以及其他各种MF基因(第1a1列、弹性蛋白和波形蛋白）和祖细胞标记物(Krt7和Krt19; 补充图12）。因此，在慢性胆道损伤（BDL）和慢性肝细胞损伤（MCDE饮食）小鼠模型中，未能扩大肝MF数量与肝上皮祖细胞生长受限相关，并导致肝萎缩。这可能是由于缺乏MF衍生的营养因子或作为肝上皮前体的MF池耗尽所致。

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阻断MFs中的Hh信号抑制肝上皮祖细胞的积累，导致肝萎缩，并在MCDE饮食诱导的损伤后阻断肝细胞增殖。

(A类–D类)代表性免疫组织化学、肝脏形态计量学数据和全肝mRNA表达(A类)αSMA(B类)结蛋白(C类)AFP和(D类)MCDE饮食诱导损伤后DTG小鼠体内的SOX9。给小鼠喂食MCDE饮食1周，每组在第0、2、4和6天接受载体或TMX注射，并在第7天收获肝脏。结果表示为折叠车辆处理的假手术对照（计算机辅助形态测量）或每个场阳性染色细胞的总数（原始放大倍数×20）。NL，正常*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. 显示了MCDE组基因表达的qRT-PCR分析结果，结果表示为折叠车用MCDE处理组*P（P）< 0.05; **P（P）< 0.01. (电子)用赋形剂或TMX治疗的DTG小鼠MCDE后7天的代表性肝脏/体重比。结果用平均值±SEM表示*P（P）< 0.05.

命运图显示上皮细胞和基质细胞都是表达HSC标记的细胞的后代。

为了区分这些可能性，我们交叉了αSMA-Cre-ERT2段ROSA-Stop-flox-YFP小鼠(38)生成另一个DTG系，其中TMX可用于用YFP标记αSMA表达细胞及其后代。免疫组织化学显示，在假手术和BDL后，新DTG株中αSMA的表达与WT小鼠的表达相同（补充图13）。在用载体处理的WT小鼠或DTG小鼠中未显示YFP染色（图​（图6A6A和补充图13）。然而，当用TMX处理DTG小鼠以激活Cre重组酶时，发现YFP标记的细胞（图​（图6A6A和补充图13）。至关重要的是，还有更多YFP+BDL后这些小鼠体内的细胞比假手术后的细胞聚集。YFP标记的细胞定位于损伤肝脏的3个不同组织分区：导管结构、基质和肝细胞板（图​（图6A6A和补充图13）。为了评估这些发现是否可能是由于Cre重组酶的错误调节和/或错误的抗体特异性所致，从不同组中分离出肝细胞，并通过流式细胞术和直接荧光法进行进一步分析（图​（图6B）。6B） ●●●●。还通过PCR分析评估肝细胞中的基因重排（图​（图6C）。6C） 。这两种方法都证实了免疫组化数据，所有分析都表明至少四分之一的肝细胞来自αSMA表达细胞（范围24%-34%，图​图6，6，B和C，以及补充图14），从而支持Hh-反应性MF人群包括成人肝细胞前体的假设。

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上皮细胞和基质细胞是表达HSC标记物的细胞的后代。

(A类)αSMA-核心-ERT2段对x ROSA Stop-flox YFP小鼠进行假手术或14天BDL，并用载体或TMX治疗。对YFP进行免疫组化，并显示代表性图像（原始放大倍数×40[i–i]）。方框区域显示门脉周围区域的导管细胞（v；箭头）和中区的肝细胞和基质细胞（vi；分别为黑色和红色箭头；原始放大倍数×100[v和vi]）的代表性YFP染色放大倍数增加。还显示了车辆处理控制装置（分别为ii和iii）。(B类)野生型、ROSA-Stop-flox-YFP（无Cre）和αSMA-Cre-ERT2段/ROSA-Stop-flox-YFP（DTG-YFP）小鼠接受假手术或BDL，并用载体或TMX治疗。BDL后14天分离原代肝细胞，并通过流式细胞术分析直接YFP荧光。显示了YFP阳性细胞相对于WT对照的百分比。(C类)从ROSA-Stop-flox-YFP和DTG-YFP小鼠中分离肝细胞；通过PCR分析DNA以检查ROSA26位点的重排（灰色三角形表示LoxP位点）。一个普通正向引物与2个下游引物一起用于指定区域（PGK-Neo，EYFP；补充表3）。如图所示，对Cre介导的重组进行量化​图11显示在每条车道下方。(D类)此外，还对14天BDL损伤的GFAP-Cre-ERTM x ROSA-Stop-flox-YFP小鼠进行了血统追踪，并用溶媒或TMX治疗。对肝脏YFP进行免疫组化，并显示了代表性的YFP图像+导管区（箭头）、基质区（红色箭头）和肝细胞区（黑色箭头）的细胞（原始放大倍数，×40[顶部]；×100[底部]）。

αSMA是MFs的一般标记，因此由来自骨髓纤维细胞、PFs和HSC的MFs表达(31,39).

为了区分哪些肌纤维母细胞类型可能在肝损伤期间产生肝上皮细胞，我们建立了第三个DTG细胞系，其中TMX可用于用YFP条件性标记GFAP表达细胞及其子代。因为GFAP由HSC表达，而不是骨髓纤维细胞或PFs(31)GFAP-Cre-ERTM/ROSA-Stop-flox-YFP-DTG小鼠将HSC产生的肝上皮细胞（YFP阳性）与PF或纤维细胞产生的肝表皮细胞（YFP阴性）区分开来。当GFAP-Cre-ERTM/ROSA-Stop-flox-YFP DTG小鼠受到BDL刺激HSC-衍生和非MF-HSC扩张时（图​（图3），三)，我们观察到YFP标记的肝细胞和导管细胞显著聚集（图​（图6D6D和补充图15），证明GFAP表达细胞是至少一些肝上皮细胞的前体。这些发现反映了αSMA-Cre-ER血统追踪研究的结果T2段/ROSA-Stop-flox-YFP小鼠（图​（图6A6A和补充图13），并扩展了培养HSC的发现（图13​（图11和补充图2），共同支持HSC作为BDL损伤肝脏中肝上皮细胞的前体细胞的作用，因为HSC是已知表达GFAP和αSMA的唯一类型的成人肝细胞。

FACS和命运映射证明HSC和MF-HSC可重新编程。

HSC能够分化为肝细胞和导管细胞的概念与当前的教条相反，但并不完全新颖。其他一些研究小组报告称，HSC可以在体外表达各种祖细胞标记，包括SOX9(40,41)。我们发现Hh信号能够差异性地调节上皮和间充质标记物的HSC表达，我们之前对构成性GFAP-Cre/ROSA-Stop-flox-YFP和GFAP-Cre/ROSA-Stop-flox-LacZ小鼠在MCDE诱导的肝损伤期间的血统追踪研究表明，肝细胞和胆管细胞来源于表达GFAP的细胞(8)。然而，其他工作人员无法证明成人肝损伤期间上皮-间充质转化的发生(42,43)。因此，为了进一步研究损伤肝脏中的一些MF-HSC可能成为肝上皮细胞的可能性，我们使用了FACS分析（图​（图7，7，A-E和补充图16，A和B），RT-PCR（图​（图8A8A和补充图17），以及免疫荧光加共聚焦显微镜（图​（图8B）8B） 分析从健康成年WT小鼠分离的原代HSC，并立即（第0天）或培养7天后进行分析。HSC分离株用BODIPY染色以显示脂质球，并用紫激光分析以确定维生素A+细胞符合Kisseleva和Brenner的方案(44)。我们新分离的HSC中98%的BODIPY和维生素A呈阳性（补充图16C）。97%–98%的细胞也表达HSC标记结蛋白，进一步确保新鲜分离物和培养细胞都是高纯度的（图​（图7A）。7A） ●●●●。正如预期的那样，我们发现某些蛋白质在第0天的HSC和培养激活的（第7天）HSC中差异表达。最值得注意的是，第7天98%的HSC表达MF-HSC标记物αSMA，而第0天不到7%的HSC表示该蛋白（图​（图7A）。7A） ●●●●。对PTC和GLI2的FACS分析也证实，MF-HSC中的Hh信号传导比新分离的HSC中的更为活跃（图​（图7B）。7B） ●●●●。令人惊讶的是，SOX9在80%以上的HSC中得到了一致的证明，而与文化无关（图​（图7E）。7E） ●●●●。通过对两个新分离的HSC进行免疫染色，证实了该多能干祖细胞标记物和一个成熟的HSC标记物（结蛋白）的克隆化（图​（图8B）8B） 和完整的肝脏切片（图​（图7F）。7F） ●●●●。基于其他干/祖细胞相关标记物的表达，如OCT4和Nanog，MF-HSC比新分离的HSC更富含原始祖细胞型细胞（图​（图7，7、C–E和补充图17）。相反，表达肝上皮标记物的细胞，如HNF4α和Krt19，在新鲜HSC分离物中相对富集（图​（图7，7、C和D以及补充图17）。

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FACS证明HSC和MF-HSC可重新编程。

(A类)培养7天后，对新分离的小鼠HSC（第0天小鼠HSC）和MF-HSCs（第7天小鼠HSCs）进行星状细胞标记物desmin、GFAP、PPARγ、αSMA、胶原、波形蛋白和Ki67的细胞内染色。阴影区域表示同型控制。在第0天或第7天小鼠HSC中使用结蛋白、GFAP或αSMA(B类)Hh信号因子（PTC1，GLI2）(C类)肝细胞和/或其祖细胞的标记物（HNF4α、CCAAT/增强子结合蛋白α[CEBPα]、AFP、Krt8/18、白蛋白、成纤维细胞生长因子诱导分子14[FN14]）(D类)导管细胞标记物（Krt7、Krt19、HNF6）和(电子)祖细胞标记物（SOX9、OCT4、Nanog、CD133、CD44、CD24）。(A类–电子)显示了相对于同型对照的相应标记阳性细胞的百分比。(F类)WT（C57BL/6）肝脏结蛋白（棕色）和SOX9（绿色）的双重免疫组化显示这些标记物（箭头）的共定位（原始放大倍数×100）。

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肝细胞、祖细胞和MF的HSC差异共表达标记物。

(A类)从WT小鼠中分离出HSC。从新鲜分离的细胞或培养7天的细胞中纯化总RNA，并通过RT-PCR进行分析。琼脂糖凝胶电泳显示扩增子。根据第0天的mRNA水平量化和表达谱带强度。(B类)FISH检测新分离Q-HSC中GFAP（红色）和白蛋白（蓝色）mRNA（原始放大倍数×100）（上图）。免疫荧光（IF）染色显示共聚焦显微镜显示第0天HSC中结蛋白（绿色）和白蛋白蛋白的共定位。DAPI染色显示细胞核（原始放大倍数×100）（底部）。(C类)共聚焦显微镜观察第0天HSC（结蛋白阳性）和第7天培养激活的小鼠HSC（αSMA阳性）中代表性肝细胞和祖细胞标记物（AFP、SOX9、Nanog）的表达。通过DAPI染色显示细胞核（原始放大倍数，×100[第0天小鼠HSCs]；×40[第7天小鼠HSC]）。

为了确定新分离的HSC制剂中的上皮样细胞是否为静止的HSC，我们评估了细胞中白蛋白和静止的HSC-标记物（结蛋白或GFAP）的共表达，推断白蛋白是肝细胞及其直接前体的相对特异标记物(45,46)。流式细胞术显示，90%以上新分离的HSC中白蛋白和结蛋白共存（图​（图7C）。7C） 。新鲜分离的HSC的qRT-PCR分析也显示白蛋白mRNA（图​（图8A），8A） 原位杂交证实了白蛋白和GFAP转录物的共表达（图​（图8B）。8B） ●●●●。这一新分离的HSC中白蛋白表达的直接证据补充了结蛋白的数据+这些细胞共同表达E-钙粘蛋白（补充图2），以及其他流式细胞术和PCR数据（图​（图77和​和88以及补充图16和17），证实Q-HSC是具有肝细胞祖细胞特征的上皮样细胞。

众所周知，Q-HSC在损伤肝脏和培养过程中成为MF。因此，我们检测了第7天培养激活的HSC，以获得白蛋白表达的证据。我们无法使用FISH证明第7天HSC中的白蛋白转录物（补充图18）。与此一致，qRT-PCR证实，相对于新分离的HSC，MF HSC中的白蛋白mRNA水平显著下调（图​（图8A）。8A） ●●●●。然而，流式细胞术显示，超过90%的MF-HSCs同时表达白蛋白和αSMA（图​（图7C）。7C） 。虽然来自培养基的细胞粘附白蛋白可能解释了不一致的流式细胞术和mRNA数据，但考虑到白蛋白蛋白的半衰期较长，也可以想象MF-HSC保留了它们在较早时间点产生的白蛋白。

后一种可能性意味着MF-HSCs将展示之前白蛋白基因表达的其他独立证据。因此，我们检测了从IKKβ中获得的HSCΔHep小鼠，一种白蛋白基因调控元件驱动Cre-relubise表达的菌株，破坏抑制剂κβ激酶β(IKK公司β） 肝细胞中的基因(47)。在新分离的HSC和IKKβ培养激活的原代MF-HSCs的RNA和DNA中均发现突变的IKK？和Cre重组酶ΔHep小鼠，而突变等位基因和Cre都不能在从IKKβ中获得的HSC中显示飞行/飞行对照组小鼠（补充图19）。这些发现是用BDL小鼠的HSC复制的，以刺激HSC体内重编程为MF。虽然可以想象，新分离的HSC制剂可能含有污染的肝细胞，但肝细胞在常规用于诱导HSC转分化为MF的条件下无法存活7天。因此，结果证明，鼠MF-HSC来源于具有足够内源性白蛋白转录活性的细胞，以驱动Cre重组酶的表达并影响IKK公司β基因重排。

为了评估这些数据的通用性，我们对2个克隆性肌纤维母细胞HSC株进行了FACS分析。大多数克隆人MF-HSC（LX2细胞）和克隆大鼠MF-HSCs（8B细胞）是Hh反应性的，共表达白蛋白和αSMA。AFP和αSMA的高度共表达，以及αSMA和各种其他干/祖细胞标记的共表达也得到了同样的证明（补充图20和21）。

尽管我们的FACS研究结果支持我们对完整αSMA-Cre-ER进行的命运图研究的结果T2段/ROSA-Stop-flox-YFP DTG小鼠和GFAP-Cre-ERTM/ROSA-Sop-flox-YFP DTG-小鼠（图​（图6，6，A和D），HSC可以同时成为MF和肝上皮细胞的证据似乎反驳了中胚层在胚胎发生过程中产生HSC的报道(48)以及声称上皮-间充质转化在成人肝脏中不发生(42,43,49)。因此，关键是要确定我们的发现是否可以通过另一种方法得到证实。为此，我们在第四个DTG系（GFAP-Cre/ROSA-Stop-flox-LacZ小鼠）中进行了谱系追踪，在该系中，健康成年小鼠的组成性GFAP表达用于标记GFAP表达细胞及其后代。Hering（公认的SOX9蓄水池）的HSC和管壁细胞+双功能肝上皮祖细胞）为LacZ+在这些老鼠身上(8)。LacZ染色在肝外胆道树、胆囊和胰管中也显示出来（补充图22）。已知所有后一种结构都来自SOX9阳性多能祖细胞(32)。SOX9与Hh途径相互作用以控制祖细胞命运决定(50,51)表明健康成人胰胆管树中可能存在一定水平的Hh基础信号。为了解决这个问题，我们对PTC-LacZ小鼠的组织进行染色，其中β-半乳糖苷酶的表达由Hh靶基因的启动子元件控制，私人投资公司(7)。胆囊、肝外胆管和胰腺管中可见微弱的LacZ染色（补充图22）。

讨论

这项研究证明，SMO，一种典型Hh信号通路中的专性中间体，控制着成人肝脏中MFs和肝祖细胞的损伤相关积累。此外，研究结果揭示了我们认为是一种新的机制来替代受损的肝上皮，该机制依赖于SMO对HSC上皮-间充质转化的直接调节，HSC是驻留的肝周细胞，是多种肝损伤期间MFs的主要来源。

这些发现有几个重要的意义。首先，他们表明，单个分子SMO最终协调各种损伤相关因子与其受体相互作用时启动的纤维生成和再生信号，因为简单地删除MF中的SMO就足以阻止MF和肝上皮祖细胞在肝脏的蓄积。尽管出乎意料，但这一结果与SMO整合了至少3种主要形态发生信号通路Hh、Wnt和TGF-β的证据一致(16,52)表明SMO是肝纤维化和再生的中枢调节器。反过来，这一观点将SMO确定为预防肝硬化和优化肝损伤恢复的治疗靶点。第二，SMO在成人肝脏修复中的重要性证明了肝上皮损伤相关诱导Hh配体生成以及由此导致的Hh应答MF和祖细胞的肝蓄积的假定病理生物学意义(10)。这证明了通过减少肝上皮损伤来预防肝纤维化的策略是正确的，因为成功阻止了Hh配体的产生，否则Hh配子将为MF中SMO的激活以及随后的MF积聚和肝纤维化提供主要的旁分泌刺激。第三，有证据表明，MF中SMO的条件性缺失阻断了肝上皮祖细胞的肝蓄积（并加剧了肝萎缩），这为先前的观察结果提供了一个解释，即MF缺失会损害成人的肝再生(53,54)这意味着祖细胞在成人肝脏再生中的作用比一般认为的更重要。第四，证明常驻HSC需要SMO依赖性信号才能成为增殖性MF，再加上MF-HSC表达多潜能祖细胞标记的证据，支持补充的血统追踪证据，即HSC作为兼性祖细胞来替代受损肝脏中受损的肝上皮细胞。

总的来说，这些数据表明了一个新的、公认有争议的模型，根据该模型，SMO通过调节保留多能性的常驻肝细胞亚群的分化来决定肝损伤的结果。最近，在成人乳腺中发现了一个共表达上皮和间充质标记物的移行细胞亚群。上皮样乳腺细胞能够上调其多能因子的表达，以获得更多的间充质干细胞样表型。过渡期乳腺细胞对病毒传递的癌基因的重新编程特别敏感。尽管驱动这一过程的信号尚未阐明，但也发生了自发的重新编程(55,56)。我们的研究结果支持HSC是肝脏中相当于移行乳腺细胞的概念，并将SMO激活确定为重编程过程中的关键事件。在缺乏Hh配体和其他激活SMO的信号的健康肝脏中，HSC是非纤维和非增殖（即静止）周细胞。像其他组织中的过渡乳腺细胞和周细胞一样，这些静止的HSC表达一些间充质基因(55,57–59)。HSC也表达许多肝细胞和胆管细胞前体的标记物，这表明如果需要替换成熟的肝上皮细胞，他们将接受MET。相反，在慢性肝损伤期间，HSC微环境逐渐且持续地富含Hh配体和激活SMO的其他促纤维化因子(7,20)。HSC中SMO的激活启动信号，下调上皮基因，但上调驱动HSC增殖、成肌纤维细胞和成纤维细胞的基因表达。多潜能因子的表达，如Nanog和OCT4(60)也出现在一些MF-HSC中。因此，通过产生持续的旁分泌信号持续激活HSC中的SMO，慢性肝上皮损伤有利于MF和多能干细胞的积累，同时抑制这些多能干祖细胞向静止的HSC和更成熟的肝上皮细胞的分化。尽管这些反应可能被视为一种适当的适应，可确保肝毒性威胁消失后肝上皮最终替换，但随着肝脏逐渐被相对未分化和肌纤维母细胞多能干祖细胞及其直系后代重新填充，纤维化随之发生。

该模型并不排除其他类型的肝上皮前体细胞在维持肝上皮稳态中的作用。事实上，后者很可能提供了强有力的证据，证明肝祖细胞群体是异质的，不同的情况引发了对肝上皮细胞替换的需求(61)。该模型也没有定义HSC的最终来源。这与成人HSC来源于成人胆道树中假定的前体细胞的可能性完全一致(33,61,62)或残留间皮(48,63)。在新模型中，除HSC外，还存在来自细胞的MF的空间。与MF-HSC不同，MF-HSC能够转变回非纤维细胞，PF和骨髓衍生纤维细胞似乎提供了一致的胶原基质来源(26)。不同MF人群的相对重要性已被认为因肝损伤的类型和持续时间而异(26,31)。需要进一步的研究来阐明哪些类型的MF持续存在并在上皮损伤消退后继续产生胶原基质。最后，该模型对具有常驻星状细胞/周细胞群的其他上皮组织的再生具有潜在相关性，如成人胰腺和肾脏(64)。我们的研究表明，αSMA表达细胞中SMO的条件性缺失减少了肾脏αSMA的数量+细胞（补充图10）。如果这些组织中的星状细胞/周细胞也能保持足够的可塑性以转化为替代上皮细胞，那么SMO可能是成年人上皮修复的主要调节器。此外，因为SMO的激活受到许多不同的细胞表面分子的调节，这些分子影响着细胞的命运决定(15)，它可能是一种新的“药物”靶点，以防止纤维化，并确保在多种组织损伤期间健康上皮的再生。

方法

动物和实验设计。

平滑（Smo）tm2麦克/J（SMO-flox）小鼠(65)和ROSA-Stop-flox-YFP小鼠(38)从Jackson实验室获得，并与αSMA-Cre-ER杂交T2段转基因小鼠(24)在αSMA启动子的控制下表达TMX调节的Cre重组酶。DTGαSMA-Core×SMO/flox纯合子对照小鼠通过SMO/flo纯合子、αSMA-Cre-ER杂交获得T2段SMO/flox纯合子小鼠的半合子小鼠。此外，αSMA-Cre-ERT2段通过杂交ROSA-Stop-flox-YFP纯合子、αSMA-Cre-ER培育×ROSA-Sop-flox-YFP小鼠T2段带有ROSA-Stop-flox-YFP纯合子小鼠的半合子小鼠。成年（8-12周龄）小鼠接受BDL或假手术，如前所述(66) (n个=每组11只小鼠）。术后14天处死动物；采集血液和肝脏样本。

诱导氧化性肝损伤并激活HSC和肝祖细胞群，αSMA-Cre-ERT2段如前所述，给×SMO/flox DTG小鼠喂食添加0.15%乙硫氨酸（MCDE）的缺乏蛋氨酸/胆碱的饮食(7)。将动物分为两组，每组接受其中一种运载工具(n个=5）或TMX(n个=6），喂食MCDE饮食1周后处死存活小鼠。Chow-fedαSMA-Cre-ER公司T2段×SMO/flox DTG小鼠(n个=6）或TMX(n个=6）也在同一时间点被处死。

IKKβ飞行/飞行和IKKβΔHep这些老鼠是迈克尔·卡林（美国加利福尼亚州圣地亚哥UCSD）送的礼物。IKKβ飞行/飞行用蛋白核心小鼠繁殖小鼠，以产生蛋白表达细胞及其后代IKKβ缺陷的动物（即IKKΔHep) (67)。所有老鼠都被关在一个设施中，光照/黑暗周期为12小时，允许自由获取食物和水。两种转基因IKKβ飞行/飞行和DTG IKKβΔHep如上所述，动物受到BDL(n个=每组4只小鼠）。

ROSA-Stop-flox-LacZ小鼠来自Jackson实验室(http://www.jax.org)。在构成性GFAP调节元件（GFAP-Cre-ER小鼠）的控制下表达Cre重组酶的小鼠与先前描述的ROSA-Stop-flox-LacZ转基因小鼠杂交(8)。之前曾描述过成年雄性PTC-LacZ报告小鼠(18).

TMX注入。

为了启动Cre介导的漂浮等位基因的基因重排，接受假手术或BDL（约25 g体重）的DTG小鼠以每公斤体重10 mg的剂量腹腔注射TMX（Sigma-Aldrich）。GFAP小鼠在第0天开始注射BDL损伤，αSMA小鼠在第4天开始注射。每隔一天注射一次，直到手术后第14天采集组织。对于MCDE饮食诱导的损伤，从MCDE膳食给药的第0天开始注射TMX，每隔一天注射一次，直到第7天收获组织。

β-半乳糖苷酶染色。

如前所述，使用β-半乳糖苷酶检测试剂盒（Promega）对全山组织和石蜡包埋组织中的β-半乳糖苷酶进行染色(68).

羟脯氨酸测定。

如前所述，在快速冷冻的肝脏样品中用色度法定量肝脏羟脯氨酸含量(7)。根据用高纯度羟脯氨酸（Sigma-Aldrich）制备的标准曲线计算浓度，并以每克肝脏中的羟脯氨酸毫克数表示。

免疫组织化学。

肝组织用福尔马林固定，石蜡包埋。根据制造商的方案，使用DAKO Envision System（DAKO Corporation）进行免疫组织化学染色，检测GLI2、SMO、αSMA、弹性蛋白、Krt19、SOX9、AFP、结蛋白、Ki67和细胞周期蛋白D1。如前所述进行免疫染色(69)。简单地说，福尔马林固定石蜡包埋的肝组织被切割成5μm的切片，并放置在玻璃载玻片上。切片用二甲苯脱巴拉圭，用乙醇脱水，然后用3%过氧化氢培养以阻断内源性过氧化物酶。通过在10 mM柠檬酸钠缓冲液（pH 6.0）中加热或与胃蛋白酶（00-3009；Invitrogen）孵育进行抗原回收。在DAKO蛋白块（X9090；DAKO）中阻断切片，然后与一级抗体孵育。使用了以下主要抗体：GLI2（GWB-EB3B44；1:4500；GenWay Biotech）、结蛋白（ab6322；1:1000；Abcam）、弹性蛋白（BA-4；1:2000；Santa Cruz Biotechnology Inc.）、Krt19（Troma III，1:400；Hydroma Bank）、AFP（A0008，1:400）、αSMA（M0851；1:500；DAKO）、SOX9（AB5535；1:1000、Millipore）、Ki67（NCL-Ki67-MM1；1:1000，Novocast）、，细胞周期蛋白D1（ab16663；1:1000；Abcam）；SMO（sc-6366；1:150；圣克鲁斯生物技术公司）；YFP（GFP-1020；1:600；Aves实验室）；和GFAP（DAKO；1:1000；Novus）。HRP缀合的抗兔（K4003；DAKO）、抗小鼠（K4001；DAKO）二级抗体用于观察靶蛋白。检测过程中使用DAB试剂（K3466；DAKO）。组织切片用Aqua Hematoxylin INNOVEX（INNOVEX Biosciences）进行复染。根据制造商的建议（BioCare Medical），使用Vina Green进行双重免疫组化。阴性对照组包括暴露于1%牛血清白蛋白而非各自的主要抗体的肝脏标本。

通过形态计量学（MetaView软件，Universal Imaging Corp.）评估天狼星红染色和αSMA、结蛋白和弹性蛋白免疫组化染色。为了进行形态计量量化，对每只小鼠的10个随机选择的场进行了评估，每个截面放大×20倍。使用类似的方法对GLI2、SOX9、Ki67和细胞周期蛋白D1染色进行定量：对于这些参数中的每一个，在每只小鼠随机选择的10×20视野中计数细胞核染色的细胞数量。

原位杂交。

为了检测分离的HSC和肝细胞内的特定转录物，根据制造商的协议，使用针对小鼠白蛋白（VB6-12839，Panomics）、胶原蛋白1α1（VB1-13595，Panomic）和GFAP（VB1-10623，Panommics）mRNA的经验证探针进行FISH。简单地说，使用4%甲醛将新分离的HSC和肝细胞或第7天培养激活的HSC固定在盖玻片上。细胞被渗透并与图中所示的探针杂交​图8B。8B.Q-HSC多重杂交为GFAP（Cy3）和白蛋白（Cy5）。MF-HSC复合杂交为COL1A1（Cy3）和白蛋白（Cy5。然后使用DAPI（Vector Laboratories）将载玻片安装在Vectashide水性安装介质中。使用蔡司710倒置共焦显微镜通过杜克共焦显微镜核心设备观察载玻片。

免疫细胞化学。

HSC被胞浆或生长在盖玻片上7天。细胞被清洗，固定在4%多聚甲醛中，用冷甲醇渗透，并在室温下与一级抗体孵育2小时。细胞在PBS中清洗，并在室温下与Alexa Fluor 594山羊抗鼠IgG或Alexa Fluor 488山羊抗兔IgG（H+L）孵育45分钟。使用Prolong Gold防褪色试剂（Invitrogen）将载玻片安装在载玻片上，并使用蔡司710倒置共焦显微镜（卡尔蔡司）进行观察。

HSC隔离和培养。

从DTG小鼠和IKKβ中分离出原代HSC飞行/飞行和IKKβΔHep老鼠。评估分离的HSC的纯度和活力（补充图16C），并以3×10的密度播种2每毫米电池数2如前所述，补充10%胎牛血清和青霉素/链霉素的DMEM(11).

HSC的腺病毒转导。

如前所述，在培养第4天，将携带GFP基因（AdGFP）或Cre重组酶基因（AdCre）的腺病毒以50的MOI添加到原代小鼠HSC中(11)。24小时后，抽吸含病毒培养基并用新鲜培养基替换。通过共焦显微镜评估AdGFP感染的病毒效率，发现>95%的感染细胞呈GFP阳性。通过对细胞全细胞提取物的Western分析证实了感染细胞的Cre表达。

伤害措施。

根据制造商的说明，分别使用Biotron Diagnostics（66-D）和Cayman Chemicals（10010303）的商用试剂盒测量血清丙氨酸氨基转移酶和甘油三酯。使用罗氏应用科学公司（In-Situ Cell Death Detection assay，11-684-817-910）提供的商用分析对石蜡包埋组织进行TUNEL分析

细胞系维护。

人类MF-HSC线LX2（由Scott Friedman提供，西奈山医学院，纽约，纽约，美国）(70)在Dulbecco改良的Eagle's培养基中培养，补充10%胎牛血清，1 mM我-谷氨酰胺和100 IU/ml青霉素/链霉素。

克隆衍生大鼠MF-HSC 8B系(71)在RPMI 1640培养基中培养，并补充10%胎牛血清和100 IU/ml青霉素/链霉素。所有细胞均通过胰蛋白酶消化获得并用于流式细胞仪分析。补充表1提供了所有HSC株系的表型特征

两步实时RT-PCR和常规RT-PCR。

使用TRI从细胞、肝脏或大脑中提取总RNA佐尔（Invitrogen），然后进行无RNase DNase I治疗（Qiagen）。使用随机引物和SuperScript RNase H-reverse Transcriptase（Invitrogen）将RNA反向转录到cDNA模板并扩增。

对于半定量qRT-PCR，使用StepOne Plus Real-Time PCR Platform（ABI/Life Technologies）和靶序列的特异性寡核苷酸引物以及核糖体S9看家基因扩增1.5%的第一链反应。qRT-PCR参数如下：在95℃下变性3分钟，然后在95℃变性40个周期10秒，在最佳引物温度下退火/延伸60秒。阈值周期(C类t吨)由StepOne Plus实时检测系统自动计算。根据2–ΔΔCt方法。补充表3列出了引物序列。

流式细胞术。

所有染色步骤均在4°C的黑暗中进行，并用BD-Fc Block封闭。对于表面染色，细胞在流式细胞术染色缓冲液（eBioscience）中与抗体孵育30分钟，并用流式细胞仪缓冲液清洗3次。对于细胞内染色，细胞用Cytofix/Cytoperm缓冲液（BD-PharMinen）固定并渗透20分钟，用Perm/Wash缓冲液（BG-PharMineng）洗涤两次，然后用抗体在Perm/Wash-缓冲液中培养30分钟。流式细胞术数据采集采用LSR II（BD）和FACSDiva软件，分析采用FlowJo软件（TreeStar）。用BODIPY 493/503（4,4-二氟-1,3,5,7,8-五甲基-4-bora-3a，4a-diaza-秒-茚）（20μg/ml；Invitrogen）30分钟，并使用FITC通道进行分析。使用FITC通道分析肝细胞中YFP的表达。抗体和结合物列于补充表2中。

统计学。

所有数据均表示为平均值±SEM。使用Student’st吨测试。所有分析均使用GraphPad Prism 4软件（GraphPad-software Inc.）进行。与的差异P（P）≤0.05被认为具有统计学意义。

研究批准。

动物护理和手术程序由杜克大学医学中心机构动物护理和使用委员会批准，如实验动物护理和使用指南由NIH发布。

补充材料

补充数据：
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鸣谢

这项工作得到了NIH拨款R37 AA010154和R01 DK077794（给A.M.Diehl）的部分支持。

脚注

利益冲突：提交人声明，不存在利益冲突。

关于本手稿评估的说明：杜克大学、北卡罗来纳大学教堂山分校、杜克-美国和桑福德-伯纳姆医学研究所的科学家撰写的手稿，不是由编辑委员会成员处理，而是由科学编辑处理，他们与选定的外部编辑和审稿人协商。

本文引文： 临床投资杂志。2013;123(6):2380–2394. doi:10.1172/JCI66904。

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文章来自临床研究杂志由以下人员提供美国临床研究学会